具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其機(jī)制

[摘要］目的探究具有 PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF7和BT549，分別將其分為 A～J 組和 a～j 組，并分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pcDNA3.1、TAZ、PLKO.1、shTAZ、TAZ + PLKO.1、TAZ + shGLUT3、WT pGLUT3 + pcDNA3.1、WT pGLUT3 + TAZ、pGLUT3mutation + pcDNA3.1 和 pGLUT3 mutation + TAZ。通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè) A～F 組和 a{～f 組細(xì)胞克隆形成率和遷移率，通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè) A～D 組和 a～d 組細(xì)胞TAZ下游 相對(duì)表達(dá)水平，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)檢測(cè) A～F 組和 a～f 組GLUT3蛋白表達(dá)情況。通過JASPER數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)TAZ-轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)締合域（TEAD）與GLUT3的結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)G～J 組和 g～j 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。結(jié)果細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組與A組相比、b組與a組相比，細(xì)胞克隆形成率顯著升高 （t=23.04，25.97，Plt;0.05）;L 組與C組相比、d組與c組相比、F組與E組相比、f組與e組相比，細(xì)胞克隆形成率顯著降低， （t=9.76～42.68，Plt;0.05） 。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組與A組相比、b組與a組相比，細(xì)胞遷移率顯著升高 （t=30.85，29.44，Plt;0.05） ；D組與C組相比、d組與c組相比、F組與E組相比、f組與e組相比，細(xì)胞遷移率顯著降低 （t=12.40～33.08，Plt;0.05） 。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示， H 組與G組相比、h組與 g 組相比，相對(duì)熒光素酶活性顯著升高 （F=138.73，222.10，t_LSD=11.09，25.81，Plt;0.05） 。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組與A組相比、b組與a組相比，細(xì)胞中 相對(duì)表達(dá)水平顯著升高 _t=15.80 、14.53，Plt;0.05 ;D組與C組相比、d組與c組相比細(xì)胞中 相對(duì)表達(dá)水平顯著降低 .Plt;0.05? 。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組與A組相比、b組與a組相比，細(xì)胞中GLUT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（ ?_t= 2.22、6.50， Plt;0.05 ）;D組與C組相比、d組與c組相比、F組與E組相比、f組與e組相比，細(xì)胞中GLUT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低 （t=2.67～8.00，Plt;0.05） 。結(jié)論TAZ可能通過TEAD結(jié)合到GLUT3的啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)GLUT3表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

Effect of transcriptional coactivator with PDZ-binding motif on proliferation and migration of breast cancer cells and its mechanismWANG Lin， ZHAO Gaoxiang（Schol of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao ，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore theefectof thetranscriptionalcoactivator with PDZ-binding motif（TAZ）onthe pro liferationand migrationof breastcancercellsand itsmolecularmechanism.MethodsHuman breastcancercells MCF7and BT549 were cultured in vitro and divided into groups A-J and a-j ，respectively. The cells were transfected with pcDNA3.1， TAZ，PLKO.1， shTAZ，TAZ+PLKO.1，TAZ + shGLUT3，WT pGLUT 3+ pcDNA3.1，WT pGLUT3+TAZ，pGLUT3 mutation+ pcDNA3.1，and pGLUT3 mutation + TAZ. Colony-forming assay （CFA） and Transwell assay were used to determine plating efficiency and migration rate in groups A-F and a一f. Quantitative reverse transcription PCR（RT-qPCR） was used to measure the relative expression of GLUT3 mRNA downstream of TAZ in groups A-D and a-d . The GLUT3 protein expression level in groups A-F and a-f was measured using Western bloting （WB）. The binding site of TAZ transcription enhanced association domain（TEAD）and GLUT3 was predicted using the JASPER database，and the relative luciferase activityof cells in groups G-J （204號(hào) and g-j Was measured using dual luciferase reporter（DLR）assy.ResultsThe resultsof theCFA showed thatthe plating eficiency was significantly higher in groups B/b than in groups A/a （t=23.04，25.97，Plt;0.05） ，and significantly lower in groups D/ d and F/f than in groups c/c and E/e （t=9.76-42.68，Plt;0.05） . The results of the Transwell assay showed that the cell migration rates were significantly higher in groups B/b than in groups A/a （t=30.85，29.44，Plt;0.05） ，and significantly lower in groups D/d and F/f than in groups C/c and E/e ′=12.40-33.08，Plt; 0.05）.The results of the DLR assay showed that the relative luciferase activity was significantly higher in groups H/h than lin groups G/g ?F=138.73，222.10，t_LSD=11.09，25.81，Plt;0.05） .The RT-qPCRresults showed that the relative expresion levels of GLUT3 mRNA were significantly higher in groups B/b than in groups A/a （t=15.80，14.53，Plt;0.05） ，and significantly lower in groups D/d than in groups C/c ？ ′=4.33，4.11，Plt;0.05） .The results of the WBshowedthattherelative expressionlevelsofGLUT3 were significantlyhigherin groups B/bthanin groups A/a （2號(hào) （t=2.22，6.50，Plt;0.05） ，and significantly lower in groups D/d and F/f than in groups C/c and E/e （ t=2.67-8.00 Plt;0.05 ） ConclusionTAZ may bind to the GLUT3promoterregion through TEAD toupregulateGLUT3 expression，thus promoting the proliferation and migration of breast cancer cells.

[KEY WORDs]Breast neoplasms；Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif proteins;Glucose transporter type 3; Cell movement；Cell proliferation；In vitro techniques

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，該疾病在分子層面和組織層面表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。近幾年研究表明，Hippo通路的失調(diào)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-4]，具有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）作為該通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子發(fā)揮重要作用[5]。進(jìn)一步研究表明，TAZ能與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)締合域（TEAD）家族形成復(fù)合物結(jié)合到基因增強(qiáng)子上，調(diào)節(jié)RNA聚合酶I以促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的代謝活動(dòng)[6-8]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）的表達(dá)水平會(huì)在缺氧或炎癥微環(huán)境的影響下發(fā)生變化[9-1]。其中GLUT3以高親和力和強(qiáng)大的運(yùn)輸能力攝取葡萄糖，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，參與腦膜瘤、乳腺癌等的增殖和遷移等生物學(xué)過程[12-13]，然而目前對(duì)TAZ與GLUT3之間的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)乳腺癌的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過探究TAZ對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響及其具體分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新方向。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF7和BT549購自美國菌種保藏中心，DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，鏈霉素、青霉素以及胎牛血清購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 和H400O 購自北京英格恩生物科技有限公司，Trizol試劑購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，高保真PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司，限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶購自美國ThermoScientific公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，BCA定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，ECL發(fā)光液購買于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，GLUT3抗體購自美國SantaCruz公司，β-肌動(dòng)蛋白（ β actin）抗體以及二抗購自美國CST公司，雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

TAZ質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，首先通過PCR擴(kuò)增得到TAZ基因目的片段cDNA，而后用限制性內(nèi)切酶切割目的片段和載體質(zhì)粒并用T4連接酶連接，最后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌中，進(jìn)行篩選并鑒定以后，按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。TAZ基因的引物序列：F： 5^′ -CGGGATCCGCCACCATGAATC-CGGCCTCGGCGC- 3^′ ， R：5^′ -TCGACTCGAGCAG-CCAGGTTAGAAAGGGCTCAC- 3^′ 。pcDNA3.1、PLKO.1、shTAZ、shGLUT3、WT pGLUT3 以及pGLUT3mutation質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建。

1.3 細(xì)胞分組及處理

人乳腺癌細(xì)胞MCF7和BT549置于含有 10% 胎牛血清、 青霉素和 100g/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（DMEM完全培養(yǎng)基），于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 60%～70% 時(shí)，將MCF7細(xì)胞分為 A～F 組，將BT549細(xì)胞分為 a～f 組，使用Lipofectamine3000向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒。A組和a組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1，B組和b組轉(zhuǎn)染TAZ，C組和c組轉(zhuǎn)染PLKO.1，D組和d組轉(zhuǎn)染shTAZ，E組和e組轉(zhuǎn)染TAZ以及PLKO.1，F(xiàn)組和f組轉(zhuǎn)染TAZ以及shGLUT3。轉(zhuǎn)染后第 6～8 小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞更換新的DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染 ^48h 時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成率

將 A～F 組和 a～f 組細(xì)胞按每孔約300個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，加入 3mL DMEM完全培養(yǎng)基，置于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔 3～5d 更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2～3 周。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，每孔以 4% 多聚甲醛固定 ¹h ，適量結(jié)晶紫溶液染色 20～40min 后，肉眼計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕? （克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)） ×100% 。

1.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移率

Transwell小室鋪基質(zhì)膠，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 。使用DMEM完全培養(yǎng)基養(yǎng)基重懸 A～F 組以及 a～f 組細(xì)胞，使細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度為 5× 10⁸ 個(gè)/L。向上層Transwell小室內(nèi)加入 200μL 細(xì)胞懸液，下層24孔板內(nèi)加入 600μL DMEM完全培養(yǎng)基，置于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h 。取出Transwell小室，以 4% 多聚甲醛避光固定 ，適量結(jié)晶紫溶液染色 20min 。普通倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，觀察各組遷移細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率 = （遷移細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)） ×100% 。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞 相對(duì)表達(dá)水平

使用Trizol試劑提取 A～D 組細(xì)胞中的總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR，程序設(shè)置： 95°C 預(yù)變性 30s;95°C 變性 15s，60^°C 退火/延伸 30s ，循環(huán)40次。以 β actin為內(nèi)參基因，采用 2^-ΔΔCT 方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物名稱及序列見表1。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染 ^48h 的A組 ～F 組、a組 ～f 組細(xì)胞以PBS清洗2次，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)各組的蛋白濃度，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜， 5% 脫脂奶粉室溫封閉 ¹h ，加人GLUT3一抗于 4^°C 下置于搖床孵育過夜。加人二抗室溫孵育 ，用ECL發(fā)光液曝光并使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)讀取蛋白條帶。使用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶及內(nèi)參 β -actin條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平 °leddash 目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

在JASPER網(wǎng)站對(duì)TAZ-TEAD與GLUT3啟動(dòng)子之間的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將擴(kuò)增的GLUT3基因啟動(dòng)子序列（CACAGAATTCCG）插入pGL3-basic載體中以構(gòu)建野生型質(zhì)粒WTpGLUT3，然后將GLUT3的啟動(dòng)子突變序列（CGTATAGTCC-AG）插入到pGL3-basic載體當(dāng)中以構(gòu)建突變型質(zhì)粒pGLUT3mutation。而后將培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%～70% 的MCF7和BT549細(xì)胞分別分為 G～J 組和 g～j 組，使用H4000向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒。G組和 g 組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T pGLUT3 和 pcDNA3.1，H組和 h 組轉(zhuǎn)染W(wǎng)TpGLUT3和TAZ，I組和i組轉(zhuǎn)染pGLUT3 mutation 和 pcDNA3.1，J組和j組轉(zhuǎn)染pGLUT3mutation和TAZ。將上述各組細(xì)胞置于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^48h ，而后按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書檢測(cè)，并計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用GraphPadPrism8.3.O軟件，計(jì)量資料以 表示，兩組間比較采用配對(duì) Ψ_t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD- ?t 檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TAZ對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

A組和B組細(xì)胞克隆形成率分別為 （2.33± 0.67）% 和 （21.67±1.67）% ，細(xì)胞遷移率分別為（26.92±3.41）% 和 （82.58±6.03）%， B組細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞遷移率均顯著高于A組 、30.85，Plt;0.05） 。a和 b 組細(xì)胞克隆形成率分別為（1.86±0.70）% 和 （21.89±2.01）% ，細(xì)胞遷移率分別為 （28.25±2.05）% 和 （88.50±3.28）%， b組細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞遷移率顯著高于a組（ ζ=25.97 ！29.44， Plt;0.05） 。C和D組細(xì)胞克隆形成率分別為（13.22±1.02）% 和 （1.44±0.20）% ，細(xì)胞遷移率分別為 （77.50±4.00）% 和 （38.00±1.56）% ，D組細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞遷移率顯著低于C組 χ=24.42 、12.40，Plt;0.05） 。c和d組細(xì)胞克隆形成率分別為（11.67±1.00）% 和 （1.55±0.69）% ，細(xì)胞遷移率分別為 （85.58±2.26）% 和 （44.42±0.52）%， d組細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞遷移率顯著低于c組（ Φ_t=16.34 、33.08，Plt;0.05） 。見圖1、2。

2.2TAZ對(duì)GLUT3mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

A和B組細(xì)胞中 的相對(duì)表達(dá)水平分別為 4.83±1.00，6.89±0.37，GLU JT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 0.56±0.12，0.83±0.15，B 組上述指標(biāo)顯著高于A組 （t=15.80，2.22，Plt;0.05） 。a和b組細(xì)胞中 的相對(duì)表達(dá)水平分別為 3.84±1.00，5.65±0.33 ，GLUT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 0.56±0.12，0.90±0.10，b 組上述指標(biāo)顯著高于a組 （t=14.53，6.50，Plt;0.05） 。C和D組細(xì)胞中 的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.04±1.00，0.23±0.37，GL UT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 0.77±0.06，0.37±0.12，D 組上述指標(biāo)顯著低于C組 （t=4.33，4.00，Plt;0.05） 。c和d組細(xì)胞中 的相對(duì)表達(dá)水平分別為 1.17± 1.01，0.23±0.31 ，GLUT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 0.83±0.15，0.37±0.12，d 組上述指標(biāo)顯著低于c組 （t=4.11，3.21，Plt;0.05） 。見圖3。

2.3 TAZ-TEAD對(duì)GLUT3基因啟動(dòng)子區(qū)域的靶向作用

JASPER數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)TAZ-TEAD與GLUT3的結(jié)合位點(diǎn)序列為CACAGAATTCCG。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示， G～J 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值分別為 0.96±0.21，5.96±0.67，0.96± 0.15，1.00±0.17 ，各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較差異具有顯著性 （F=138.73，Plt;0.05） ；其中，H組相對(duì)熒光素酶活性顯著高于G組 （t_LSD=11.09，Plt; 0.05），I組與J組的相對(duì)熒光素酶活性無顯著差異L （Pgt;0.05） 。 g～j 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值分別為 1.03±0.21?6.27±0.51?1.06±0.15?1.00±0.20 各組比較差異具有顯著性 （F=222.10，Plt;0.05） ;其中， h 組相對(duì)熒光素酶活性顯著高于 Φ_g 組 Δ_tLSD= 25.81， ，i組與j組比較無顯著差異（ Pgt; 0.05）。

2.4GLUT3在TAZ調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用

E、F組細(xì)胞中GLUT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為 ，細(xì)胞克隆形成率分別為0 （16.22±0.51）% ！ （7.76±0.80）% ，細(xì)胞遷移率分別為 （72.08±2.88）%.（24.67±2.50）%，F(xiàn) 組上述指標(biāo)均顯著低于E組 （t=8.00～42.68，Plt;0.05） 。e、f組細(xì)胞當(dāng)中GLUT3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.83±0.06，0.60±0.10 ，細(xì)胞克隆形成率分別為0 （22.55±2.03）% 、 （9.78±1.07）% ，細(xì)胞遷移率分別為 （93.92±1.28）% 1 （40.00±2.22）% f組上述指標(biāo)均顯著低于e組 Ω_t=2.67～29.88 。見圖4～6 。

3討論

乳腺癌作為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥致死率最高的病種之一。研究表明，20%～30% 的乳腺癌患者在確診和原發(fā)腫瘤治療后可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，而遠(yuǎn)處重要器官的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良和死亡的主要原因[14-15]。Hippo 信號(hào)通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，該通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子TAZ是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，受到Hippo 通路的負(fù)向調(diào)控[16-17]。TAZ 因缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，需要通過與TEAD結(jié)合從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[18-19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TAZ的激活能夠誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的形成，顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段發(fā)揮重要的作用[20]。在乳腺癌干細(xì)胞中，TAZ缺失能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)[21]；敲低TAZ能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移[22]；去泛素化酶2可通過直接去泛素化作用激活TAZ，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[23]。上述研究均表明TAZ能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究TAZ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制。

本研究首先在 A～F 組和 a～f 組中分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pcDNA3.1、TAZ、PLKO.1、shTAZ、TAZ + PLKO.1、TAZ + shGLUT3，其中TAZ質(zhì)粒的空載對(duì)照為pcDNA3.1，shTAZ和shGLUT3質(zhì)粒的空載對(duì)照為PLKO.1。通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖和遷移能力，結(jié)果顯示，與A組和a組相比較，過表達(dá)TAZ的B組和b組中細(xì)胞的克隆形成率和遷移率增加；與C組和c組相比較，敲低TAZ的D組和d組中細(xì)胞的克隆形成率和遷移率降低，說明TAZ上調(diào)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

為了探究TAZ影響乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的具體機(jī)制，本研究通過JASPER網(wǎng)站預(yù)測(cè)并篩選出TAZ-TEAD下游的靶基因可能為GLUT3。相關(guān)研究報(bào)道顯示，Yes相關(guān)蛋白（YAP）可以通過調(diào)節(jié)GLUT3/AMPK信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[24]，GLUT3的過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境促進(jìn)三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移[25]，這些研究均表明GLUT3的表達(dá)水平在乳腺癌的遷移過程中起著至關(guān)重要的作用。本研究通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)TAZ與GLUT3之間的靶向作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與A組和a組相比，過表達(dá)TAZ的B組和b組中GLUT3表達(dá)水平明顯上調(diào)；與C組和c組相比，敲低TAZ的D組和d組中GLUT3表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示GLUT3為TAZ下游靶基因，TAZ可能通過上調(diào)GLUT3的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移。為了進(jìn)一步探究GLUT3和TAZ之間的關(guān)系，本研究進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒WTGLUT3＋TAZ的H組和h組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性相比于其對(duì)照組G組和 Φ_g 組顯著升高，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGLUT3mutation + TAZ的J組和j組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性則與其對(duì)照組I組和i組無顯著差異。這些結(jié)果提示TAZ可以通過TEAD結(jié)合到GLUT3的啟動(dòng)子區(qū)域，從而促進(jìn)GLUT3的表達(dá)。

為了進(jìn)一步明確GLUT3在TAZ調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移過程中的作用，本研究在過表達(dá)TAZ的同時(shí)敲低GLUT3，以證明TAZ是否通過調(diào)節(jié)GLUT3表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與E組和e組相比，F(xiàn)組和f組中敲低GLUT3會(huì)顯著抑制TAZ過表達(dá)引起的乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。上述結(jié)果提示，TAZ能夠通過上調(diào)GLUT3表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移，表明GLUT3在TAZ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，TAZ可能通過TEAD從而結(jié)合到GLUT3的啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)GLUT3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究在一定程度上揭示了TAZ促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的新型分子機(jī)制，有望為乳腺癌的臨床治療提供潛在的治療靶點(diǎn)和新的研究方向。

作者聲明：趙高翔、王琳參與了研究設(shè)計(jì)；趙高翔、王琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1]GRADISHAR W J，MORAN M S，ABRAHAM J，et al. Breast cancer，version 3.2O24，NCCN clinical practice guidelines in oncology[J]. J Natl Compr Canc Netw， 2024，22（5） ： 331-357.

[2]EMANUELLE PEREIRA SANTOS V， LUIZ DE FRANCA NETO P，EDA DE OLIVEIRA ISIDIO B，et al. An overview about biomarkers in breast cancer： Insights into the diagnostic and prognostic significance[J]. Clin Chim Acta，2025，567： 120030.

[3]WEI C R，WANG Y，LI X Q. The role of Hippo signal pathway in breast cancer metastasis[J].Onco Targets Ther，2018， 11：2185-2193.

[4]CALSES P C， CRAWFORDJJ， LILL JR， et al. Hippo pathway in cancer： Aberrant regulation and therapeutic opportunities[J]. Trends Cancer，2019，5（5）：297-307.

[5]ZHANG ZQ， LUO ZY， HUANG H Z， et al. YAP/TAZ inhibitor-based drug delivery system for selective tumor accumulation and cancer combination therapy[J]. Biomacromolecules ， 2025，26（1） ：266-278.

[6] CHEN L M， CHAN S W， ZHANG X Q， et al. Structural basis of YAP recognition by TEAD4 in the hippo pathway[J]. Genes Dev，2010，24（3）：290-300.

[7] ZANCONATO F，F(xiàn)ORCATO M，BATTILANA G，et al. Genome-wide association between YAP/TAZ/TEAD and AP-1 at enhancers drives oncogenic growth[J]. Nat Cell Biol，2015， 17（9）：1218-1227.

[8]KOO J H， GUAN K L. Interplay between YAP/TAZ and me tabolism[J]. Cell Metab，2018，28（2）：196-206.

[9]TUFAIL M，JIANG C H，LI N. Altered metabolism in cancer：Insights into energy pathways and therapeutic targets[J]. Mol Cancer，2024，23（1） ：203.

[10] WU W Z，BAI Y P. Endothelial GLUTs and vascular biology [J].Biomed Pharmacother，2023，158：114151.

[11] ANCEY P B， CONTAT C，MEYLAN E. Glucose transporters in cancer---From tumor cells to the tumor microenvironment[J].FEBS J，2018，285（16） ：2926-2943.

[12] ZHANG P，MISKA J，HEIMBERGER A B. GLUT3 regulates alternative macrophage signaling through a glucose transport-independent role[J].J Clin Invest，2023，133（21）： e174540.

[13］YU D M，ZHAO JW，LEE E E，et al. GLUT3 promotes macrophage signaling and function via RAS-mediated endocytosis in atopic dermatitis and wound healing[J]. J Clin Invest， 2023，133（21） ：e170706.

[14] RAGHAVENDRA A S， IBRAHIM N K. Breast cancer brain metastasis：A comprehensive review[J]. JCO Oncol Pract， 2024，20（10）：1348-1359.

[15]SUNMS，YUNYY，LIUHJ，etal.Brain metastasisinde novo breast cancer：An updated population-level study from SEER database[J]. Asian J Surg，2022，45（11）：2259-2267.

[16]JUAN W C，HONG WJ.Targeting the hippo signaling pathway fortissue regeneration and cancertherapy[J].Genes（Basel），2016，7（9）：55.

[17]KODAKA M，HATA Y. The mammalian Hippo pathway： Regulation and function of YAP1 and TAZ[J].Cell Mol Life Sci，2015，72（2）：285-306.

[18]HANSENCG，MOROISHIT，GUANKL.YAPandTAZ： Anexus forHippo signaling and beyond[J].Trends Cell Biol， 2015，25（9）：499-513.

[19]IBAR C，IRVINE K D. Integration of hippo-YAP signaling withmetabolism[J].DevCell，2020，54（2）：256-267.

[20] HONG A W，MENG Z P，GUAN KL. The Hippo pathway inintestinal regeneration and disease[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2016，13（6）：324-337.

[21]BARTUCCIM，DATTILOR，MORICONIC，etal.TAZis required formetastaticactivityand chemoresistanceof breast cancer stem cells[J].Oncogene，2015，34（6）：681-690.

[22]CHOI H S，JANG HJ，KRISTENSEN MK，et al. TAZ is involved in breast cancer cell migration via regulating actin dynamics[J].FrontOncol，2024，14：1376831.

[23] ZHANG Z K，DU JJ，WANG S，et al. OTUB2 promotes cancer metastasisvia hippo-independentactivation ofYAPand TAZ[J].Mol Cell，2019，73（1）：7-21.

[24]JIANGL H，ZHANGJW，XU Q X，et al. YAP promotes the proliferation and migration of colorectal cancer cells through the Glut3/AMPK signaling pathway[J]. Oncol Lett， 2021，21（4）：312.

[25]TSAI TH，YANGCC，KOU TC，etal.Overexpression of GLUT3 promotes metastasis of triple-negative breast cancer bymodulating the inflammatory tumor microenvironment[J]. JCellPhysiol，2021，236（6）：4669-4680.

（本文編輯李京蔓厲建強(qiáng)）