卵巢切除小鼠的骨重塑特征研究

中圖分類號：R332 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20250846

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of estrogen deficiency on bone remodeling characteristics in an ovariectomized mouse model.MethodsTen12-week-old female C57BL/6Jmice were randomly divided into the sham operation group and the ovariectomy （OVX）group，with 5micein each group.The uteri of mice were isolatedat16 weeks postoperatively.The morphologywasobserved，anduterine weights were counted.CTscans were performed toanalyze the distal femur of the mice，and anti-tartrateacid phosphatase （TRAP） staining wasperformed to assess the number of osteoclasts in paraffin sectionsoffemoraltissue.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BM-MSCs）and bone marrow-derived macrophages （BMMs）were sortedfrom femoral bone marrow of mice using CD11b magnetic beads.Alkaline phosphatase （ALP） staining was performed to assess the osteogenic diferentiation potential ofBM-MSCs.Reverse transcription-quantitativePCR（RT-qPCR）wasperformed to detect theexpresson levelsof genesrelated toosteogenic diferentiationofBM-MSCs（Runx2，，Sp7，andSpp1）andosteoclastdiferentiationof BMMs（Ctsk，Acp5，andCd40）. ResultsCompared with the shamgroup，the uterus ofthe OVX groupshowedsignificant atrophyand weightloss，and bone mineraldensity（BMD），bone volume fraction（BV/TV），bonesufaceareatissue volumeratio （BS/TV），numberof trabeculae （Tb.N），trabecularthickness（Tb.Th），corticalbonemineraldensity（Ct.BMD）andcorticalbonehickness（Ct.Th）were significantly reduced，and bone trabecular separation （Tb.Sp） was significantly increased （ Plt;0.01 ）. The mRNA expression levels of Runx2，Sp7 and Sppl were reduced in BM-MSCs of the OVX group compared with the sham group （ Plt;0.01 ）. The osteogenicdiferentiationwasalsodiminishedafterinduction.ThemRNAexpressionlevelsofCtsk，Acp5and Cd4O were elevated intheBMMsof theOVX group，andthenumberofosteoclasts inbone marowofthedistalfemurwas greater in the

OVX group than that in the sham group Plt;0.01 ）. Conclusion OVX-induced estrogen deficiency can enhance osteoclast diferentiationandatenuateosteogenicdiffrentiationcapacity，ultimatelycausingdysregulationof bonehomeostasisand resulting in osteoporosis.

Key words： ovariectomy; estrogens; macrophages; mesenchymal stem cells; bone remodeling

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞及骨脆性增加為特征的慢性骨代謝性疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、內(nèi)分泌、力學(xué)負(fù)荷等多因素交互作用，雌激素作為維持骨重塑平衡的關(guān)鍵激素，其缺乏被廣泛認(rèn)為是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要誘因之一[2]。雌激素水平下降打破了骨重塑平衡，導(dǎo)致骨形成不足和骨吸收增加[3]。雖然卵巢切除（ovariectomy，OVX）小鼠模型作為研究骨質(zhì)疏松的經(jīng)典模型已被廣泛用于骨質(zhì)疏松的研究，但卵巢切除后骨重塑的具體特征仍有待進(jìn)一步研究。骨重塑是一個涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞協(xié)調(diào)作用的動態(tài)過程[4-5]。研究表明，骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow-derived mesenchymal stemcell，BM-MSCs）作為成骨細(xì)胞的前體，其成骨分化潛能的下降直接限制骨形成；而骨髓來源的巨噬細(xì)胞（bonemarrowmacrophage，BMMs）作為破骨細(xì)胞的前體，其向破骨細(xì)胞的分化增強(qiáng)則進(jìn)一步加劇骨吸收[6。盡管雌激素缺乏導(dǎo)致骨質(zhì)疏松已有報道，但在骨重塑過程中雌激素缺乏如何調(diào)控BM-MSCs與BMMs的分化潛能和相關(guān)基因表達(dá)，以及這些改變?nèi)绾芜M(jìn)一步影響骨微結(jié)構(gòu)與骨穩(wěn)態(tài)，仍有待深入探討。本研究利用OVX小鼠模型，模擬絕經(jīng)后雌激素急劇下降的病理狀態(tài)，探討雌激素缺乏引起的骨重塑特征變化，以期為骨質(zhì)疏松尋找新的治療策略。

1材料與方法

1.1實驗動物10只12周齡雌性C57BL/6J小鼠購自集萃藥康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2023-0008；使用許可證號：SYXK（京）2023-0032]。根據(jù)簡單隨機(jī)抽樣原則，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)（Sham）組和OVX組，每組5只。麻醉后，Sham組僅行雙側(cè)背部切開縫合，OVX組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除。術(shù)后小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心，室溫維持在 （22±2）^°C ，相對濕度 （50.0±5.5）% ，光照強(qiáng)度 20ls 明暗各 ^12h ，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。本研究已通過天津醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查（倫理批號：TMUaMEC2023019）。

1.2主要試劑和儀器（1）主要試劑。 ∝ -MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、GlutaMAX、胰蛋白酶和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；地塞米松購自美國MCE公司；L-抗壞血酸和EDTA脫鈣液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；β-甘油磷酸鈉購自美國Sigma公司；組織固定液購自武漢博士德生物工程有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）

染色試劑盒和堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（改良Gomori鈣鈷法）購自北京索萊寶科技有限公司；CD11b磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；TaqProUniversalSYBRqPCRMasterMix試劑購自諾唯贊生物科技公司，實時熒光定量PCR（qPCR）引物購自北京擎科生物科技公司。核因子 κB 受體活化因子配體（receptoractivatorof nuclear factor- ?×B ligand，RANK-L）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）購自美國ThermoFisher公司。（2）主要儀器。正置光學(xué)顯微鏡（NIKON，日本），倒置熒光顯微鏡（ZEISS，德國），低溫高速離心機(jī)、 CO₂ 培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國），75OOFastReal-TimePCR儀（AppliedBiosystems，美國），小動物顯微CT（Micro-CT）儀（Invscan，法國），專業(yè)膠片掃描儀（Epson，日本）。

1.3 研究方法

1.3.1Micro-CT采用IRISCT掃描機(jī)對術(shù)后16周的Sham和OVX組小鼠股骨遠(yuǎn)端橫斷面進(jìn)行斷層掃描。掃描后，通過ImalyticsPreclinical3.1軟件對雙側(cè)股骨的重建圖像進(jìn)行定量分析，測定以下參數(shù)：骨礦物質(zhì)密度（bone mineraldensity，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（bonevolumefraction，BV/TV）、骨表面積與組織體積比（bone surface area to tissue volume ratio，BS/TV）、骨小梁數(shù)目（trabecularnumber，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecularseparation，Tb.Sp）、皮質(zhì)骨礦物質(zhì)密度（corticalbonemineraldensity，Ct.BMD）和皮質(zhì)骨厚度（cortical thickness，Ct.Th）。1.3.2TRAP染色將小鼠經(jīng)頸椎脫白處死后，無菌條件下取出雙側(cè)股骨。將股骨組織在組織固定液中固定2d并在EDTA脫鈣液中脫鈣2周，再經(jīng)梯度乙醇脫水、透明和包埋石蠟制作成 4μm 切片后，按照TRAP染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察，對TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。1.3.3BM-MSCs和BMMs的分離與培養(yǎng)將小鼠經(jīng)頸椎脫白處死后，無菌條件下取出雙側(cè)股骨，刺穿股骨兩端，用PBS（含 10% FBS）沖洗骨髓，200目篩網(wǎng)過濾后離心 5min （1000r/min） ，紅細(xì)胞裂解液處理 5min 后離心， α -MEM重懸細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞與CD11b微珠混合 4^°C 孵育 15min ，孵育后的細(xì)胞懸液在磁場作用下，CD11b+BMMs會被吸附在分選柱內(nèi)，CD11b-BM-MSCs細(xì)胞則流出分選柱。將收集的BM-MSCs和BMMs分別置于含有 a -MEM的培養(yǎng)皿中，于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BMMs貼壁后，更換新鮮配置的a -MEM完全培養(yǎng)基（ 50μg/L M-CSF和 50μg/L RANKL）。1.3.4BM-MSCs成骨誘導(dǎo)分化將BM-MSCs接種于6孔板由 5×10³ 細(xì)胞）使田完全培美其培美細(xì)胞待細(xì)胞融合度約 80% 時，更換成骨分化條件培養(yǎng)基（ α -MEM培養(yǎng)基中添加10% 未滅活FBS、 50mg/L 抗壞血酸、 10mmol/L β- 甘油磷酸鈉、 .10nmol/L 地塞米松 .1% 青-鏈霉素），誘導(dǎo)BM-MSCs成骨分化7d，每3d更換1次培養(yǎng)基，分化誘導(dǎo)期間細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為 5%CO₂ ，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.5ALP染色將接種于6孔板中的BM-MSCs誘導(dǎo)7d后用蒸餾水洗滌3次，棄去上清液，加組織細(xì)胞固定液，室溫固定 20min ，然后按照ALP染色試劑盒說明書步驟對BM-MSCs細(xì)胞進(jìn)行ALP染色。蒸餾水洗滌后用掃描儀掃描，評估BM-MSCs成骨分化潛能。

1.3.6qPCR檢測各基因的相對表達(dá)量使用Trizol法提取BM-MSCs和BMMs的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行qPCR，檢測BMMs破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因蛋白酶K（cathepsinK，Ctsk）酸性磷酸酶5（acid phosphatase5，Acp5）、分化簇40（clusterof differentiation40，Cd40）及BM-MSCs成骨分化相關(guān)基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-relatedtranscription factor 2，Runx2 ）、轉(zhuǎn)錄因子 sp7 （specificity protein7，Sp7 ）和分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，Spp1 基因表達(dá)。本研究中所有引物均通過NCBIPrimer-Blast工具設(shè)計，經(jīng)BLAST核酸序列同源性分析驗證引物特異性后，委托北京擎科生物科技公司完成合成，見表1。反應(yīng)體系： 2× SYBR qPCR Master Mix 10μL ，上、下游引物各 0.6μL 1 ，cDNA2μL（ 40mg/L） ，無核酸水補(bǔ)至 20μL 反應(yīng)條件： 95^°C 預(yù)變性 2min ；95℃變性 30s，60^°C 退火 15s 72^°C 延伸30s，40個循環(huán)。實驗以GADPH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 2^-ΔΔCt 法計算各基因的相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPadPrism9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本 Φ_t 檢驗。 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1OVX導(dǎo)致小鼠子宮萎縮卵巢切除術(shù)后16 周，與Sham組相比，OVX組子宮形態(tài)出現(xiàn)明顯萎 縮，見圖1。OVX組子宮質(zhì)量較Sham組降低（g： 37.20±18.67 vs. 104.00±31.30 ； n=5 ， t=4.098 ， Plt; 0.01）。

2.20VX導(dǎo)致小鼠股骨骨量丟失12周齡小鼠術(shù)后16周股骨的Micro-CT結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)流失，見圖2。與Sham組相比，OVX組BMD、BV/TV、BS/TV、Tb.N和Tb.Th明顯減少， Tb.Sp 則明顯增加（均 Plt;0.01 ），見表2；與Sham組相比，OVX組皮質(zhì)骨的Ct.BMD和Ct.Th明顯減少（ ，見表3。

2.3OVX導(dǎo)致BM-MSCs成骨分化能力減弱OVX組BM-MSCs中 Runx2，Sp7 和 的表達(dá)水平明顯低于Sham組（ ），見表4。此外，在誘導(dǎo)BM-MSCs成骨分化7d后，OVX組BM-MSCs的ALP染色陽性比例明顯低于Sham組 S77.97±4.94;n=3，t=12.050，Plt;0.01， ，見圖3。

2.4OVX增強(qiáng)BMMs的破骨分化潛能OVX組BMMs中Ctsk、Acp5和 表達(dá)水平明顯高于Sham組（均 Plt;0.01 ），見表5。

2.5OVX增強(qiáng)小鼠的骨質(zhì)吸收與Sham組相比，OVX組骨髓腔中可見大量深紅色TRAP染色區(qū)域，

見圖4。與Sham組相比，OVX組骨髓腔內(nèi)的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多（單位：個/視野； S18.60±1.59;n=5，t=14.140，Plt;0.01） 。

3討論

雌激素對于骨穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用，其缺乏常導(dǎo)致骨吸收增加和骨形成減少，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。本研究發(fā)現(xiàn)，0VX小鼠術(shù)后16周時子宮明顯萎縮且質(zhì)量減輕，符合雌激素水平缺乏導(dǎo)致的生殖器官退行性變化，驗證了模型的有效性。CT掃描結(jié)果表明，與Sham組相比，OVX組小鼠股骨遠(yuǎn)端的BMD、BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.Th、Ct.BMD和Ct.Th均明顯降低，而Tb.Sp明顯增加，提示雌激素缺乏導(dǎo)致骨重塑特征，表現(xiàn)為骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)惡化，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理特征一致。

成骨相關(guān)基因表達(dá)是體現(xiàn)成骨細(xì)胞成骨能力的重要指標(biāo)，其中包括Runx2、Sp7和Spp1。Runx2被認(rèn)為是成骨分化的核心轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，Runx2通過直接調(diào)控成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factorreceptor，F(xiàn)gfr）2和Fgfr3的表達(dá)，促進(jìn)骨細(xì)胞前體的增殖，這對骨骼發(fā)育的早期階段至關(guān)重要[7]。此外，Runx2與Hedgehog、Wnt和Pthlh信號通路相互作用，進(jìn)一步維持骨骼發(fā)育的動態(tài)平衡[8]。Spp1是一種分泌的磷酸化糖蛋白，廣泛表達(dá)于骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和其他組織[9]。轉(zhuǎn)錄因子SP7受Runx2轉(zhuǎn)錄調(diào)控，驅(qū)動前骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞的分化。有研究表明，SP7通過與遠(yuǎn)端缺失同源框5（distal-lesshomeobox5，DLX5）等輔因子相互作用，調(diào)控成骨特異性基因表達(dá)；該相互作用在富含AT堿基序列增強(qiáng)子區(qū)域富集，并激活如I型膠原蛋白α1鏈（collagen typeI alpha1chain，Colla1）和骨 γ- 羧酸谷氨酸蛋白2（bonegamma-carboxyglutamateprotein2，Bglap2）等基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。本研究證實，OVX組BM-MSCs中成骨分化關(guān)鍵基因 Runx2，Spp1 和Sp7的表達(dá)明顯低于Sham組。這些基因表達(dá)的下調(diào)直接降低BM-MSCs成骨分化的潛能，從而減少骨重塑中的骨形成。在細(xì)胞水平，BM-MSCs體外成骨誘導(dǎo)后的ALP染色證實OVX組BM-MSCs的成骨分化能力明顯減弱。本研究證實了雌激素缺乏通過下調(diào)BM-MSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)，并抑制其成骨分化能力，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

破骨細(xì)胞由BMMs經(jīng)過成骨細(xì)胞分泌RANKL誘導(dǎo)分化形成，雌激素缺乏后，RANKL分泌增加，骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）表達(dá)減少，RANKL/OPG比值升高，從而通過激活活化T細(xì)胞核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）促進(jìn)BMMs向破骨細(xì)胞分化[1-12]。Ctsk是破骨細(xì)胞發(fā)揮破骨功能的關(guān)鍵蛋白酶，通過高效切割I(lǐng)型膠原的三螺旋和端肽，完成骨吸收過程。其活性在酸性環(huán)境下增強(qiáng)，依賴于RANKL誘導(dǎo)的NFATc1途徑調(diào)控[13]。Acp5是成熟破骨細(xì)胞的標(biāo)志物，通過失活Spp1，促進(jìn)破骨細(xì)胞從骨表面釋放，完成骨吸收[14]。Cd40是一種共刺激分子，主要通過與T細(xì)胞上的CD40配體CD40L相互作用，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的成熟[14]。本研究證實，OVX組破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Ctsk、Acp5和Cd40的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。TRAP染色進(jìn)一步證實，OVX組股骨遠(yuǎn)端組織中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加。雌激素缺乏不僅抑制成骨分化，同時還促進(jìn)骨微環(huán)境中破骨細(xì)胞的破骨相關(guān)基因表達(dá)和破骨細(xì)胞的分化，從而系統(tǒng)地促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與進(jìn)展。

盡管本研究觀察到OVX后骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)惡化，但未探明雌激素缺乏是通過哪些具體信號通路影響骨重塑。例如， Wnt/β- catenin通路在成骨細(xì)胞分化中的作用，或RANKL/OPG通路在破骨細(xì)胞分化中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。此外，本研究僅聚焦股骨遠(yuǎn)端，未評估其他骨骼部位的變化。本研究也僅在轉(zhuǎn)錄水平分析了BM-MSCs細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因和BMMs破骨相關(guān)基因的表達(dá)，未驗證其蛋白水平變化。關(guān)于雌激素是否直接參與上述基因表達(dá)調(diào)控的問題也需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究揭示了OVX誘導(dǎo)的骨重塑失衡特征，為理解雌激素缺乏相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)，為未來表型和分子機(jī)制研究提供了優(yōu)化的實驗動物模型。

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（2025-03-03收稿2025-04-10修回）

（本文編輯李國琪）