水稻OsIAA10蛋白的表達(dá)及純化

引用格式：，等.水稻OsIAA10蛋白的表達(dá)及純化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025（5）：1-5.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.005.001

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2025）05-0001-05

Abstract：OsIAA10playsanimportantroleinthegrowthdevelopment，andstressresponsesofrice.Tisstudyaims toexplorethe biochemicalnatureofOsIAA10.WiththecDNAof wild-type'Zhonghua11'（ZH11）plantsasthetemplate，andthecodingsequence of OsIAA10wasamplified withtheforwardandreverseprimersof pGEX-6p-1-IAA10.Then，therecombinant plasmid pGEX-6p-1- IAA10 containing OsLAAlO was obtained through vector construction and transferred into BL21 cells.After IPTG-induced expression， purification，ndGEdetection，aingleproteinbandosistentwihtheexpectatioasbaed，nditwaidtobe OsIAA10.Theiductionconditosfortheexpresioof tisproteiweretenoptized.Tesultshowedtatereatmetwith0. mmol/L IPTG at 37% for12 h were the optimal conditions for inducing the expression of OsIAA10.The research results underpin the subsequent research on the function of OsIAA10.

Keywords：rice;IAA1O;vector construction;protein purification

水稻（OryzasativaL.）是我國(guó)主要的糧食作物，全國(guó)約有 60% 的人口以水稻為主食[。生長(zhǎng)素在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中扮演著重要的角色，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由3個(gè)核心信號(hào)成分介導(dǎo)：受體TIR1/AFBs、轉(zhuǎn)錄抑制因子 Aux/LAAs 和轉(zhuǎn)錄因子ARFs^[2] 。Aux/IAA蛋白是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子，在水稻當(dāng)中，Aux/IAA家族已鑒定出31個(gè)成員[3-4]，其中，OsIAA10基因在水稻調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中發(fā)揮了重要功能。OsIAA10過(guò)表達(dá)顯著降低了水稻的株高、粒長(zhǎng)、粒寬和千粒重；而osiaa10的株高與野生型并無(wú)差異，粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重較野生型明顯增加[5。另外，水稻矮縮病毒（RDV）的外殼蛋白P2通過(guò)與水稻生長(zhǎng)素信號(hào)通路中的抑制子兼共受體OsIAA10（Aux/IAA家族蛋白）發(fā)生相互作用，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了OsIAA10與生長(zhǎng)素受體OsTIR1的結(jié)合。這種互作干擾導(dǎo)致感病水稻中OsIAA10無(wú)法通過(guò)26S蛋白酶體途徑正常降解，從而使其蛋白積累量顯著高于健康水稻[。段鎮(zhèn)淳等[]通過(guò)亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OsIAA10蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞膜上存在雙重定位，進(jìn)一步通過(guò)酵母雙雜交篩庫(kù)結(jié)合菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，OsIAA10只能與OsARF轉(zhuǎn)錄因子家族中的4個(gè)成員（OsARF5、OsARF17、OsARF21、OsARF23）發(fā)生互作。這種互作關(guān)系在水稻生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有重要意義。

研究以野生型中花11（ZH11）植株的cDNA為模板基因，通過(guò)pGEX-6p-1-IAA10上下游引物擴(kuò)增OsIAA10基因的編碼序列，再通過(guò)載體構(gòu)建獲得含OsIAA10基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-IAA10，將其轉(zhuǎn)人BL21菌株中，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化、SDS-PAGE檢測(cè)，以期獲得高純度的IAA10蛋白，為后續(xù)利用Pull-down探究OsIAA10與OsARFs的體外相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

模板基因?yàn)橐吧椭谢?1（ZH11）植株的cDNA，供試質(zhì)粒為經(jīng)BamHI/EcoRI線性化的pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，供試菌株為 DH5a 、BL21，均由保存。

主要試劑有一步法快速克隆試劑盒[貨號(hào)10911ES，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]，KOD Fx 高保真聚合酶（貨號(hào)2406055，Toyobo公司），GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（貨號(hào)P2262，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白酶抑制劑（貨號(hào)P1025，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DNAMarker（DS2000，北京聚合美生物技術(shù)有限公司），柱回收試劑盒（貨號(hào) MF030–01 ，北京聚合美生物技術(shù)有限公司），多彩質(zhì)粒小提試劑盒（貨號(hào)MF031-plus-01，北京聚合美生物技術(shù)有限公司）。引物合成和測(cè)序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1pGEX-6p-1-IAA10載體構(gòu)建以野生型ZH11植株的cDNA 為模板，其中上游引物使用pGEX-6p-1-IAA10-F（ 5^′. TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGAGAGGAGGAGTAGCTG- 3^′ ，下劃線部分是同源臂），下游引物使用pGEX-6p-1-IAA10-R（ 5^′. CTCGAGTCGACCTGGGAATTCGGATCTGCCTCTTGTTGAA- .3^′ ，下劃線部分是同源臂，去掉終止密碼子TGA）。PCR總體系（ 50μL ）： 2×KODFx Buffer 25μL ， dNTP 10μL ，上游引物 1.5μL ，下游引物 1.5μL ，cDNA1 μL， KODFx 1 μL， ddH₂O （204號(hào) 10μL 。PCR程序： 95°C 預(yù)變性 5min ;95°C 變性 30s ， 58^°C 退火 30s ， 68^°C 延伸 1min ，34個(gè)循環(huán)； 68^°C 延伸 5min 。取 5μL PCR產(chǎn)物利用核酸瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物質(zhì)量。使用柱回收試劑盒對(duì)剩余PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，利用核酸瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)回收片段質(zhì)量，于 -20% 保存。

利用10911ES試劑盒將IAA10基因與前期經(jīng)BamHI/EcoRI線性化的pGEX-6p-1載體連接，反應(yīng)體系（ 10μL ）： LAAIO 基因 6.5μL ，已切pGEX-6p-1載體 0.5μL ，同源重組酶 1μL ， 5× Buffer 2μL 。輕輕吹打混勻后， 37% 水浴 30min ，冰浴 2min 。取25μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 37% 過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率；將驗(yàn)證成功的單菌落搖瓶擴(kuò)繁，用多彩質(zhì)粒小提試劑盒提取菌液質(zhì)粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用Geneious軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和目的基因進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2目的蛋白誘導(dǎo)及SDS-PAGE檢測(cè)將測(cè)序比對(duì)成功的pGEX-6p-1-IAA10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基（含100mg/L 氨芐青霉素）中，于 37% 、 220r/min 環(huán)境下震蕩培養(yǎng) 12h 按 1：50 比例擴(kuò)大培養(yǎng)至 OD₆₀₀ 為 0.8～ 1.0，分別添加 0.1～0.6mmol/L 的異丙基 -β -D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，IPTG），于 37% 、 220r/min 環(huán)境下繼續(xù)震蕩培養(yǎng) 12h 。取2mL菌液，常溫下 12000r/min 離心 2min ，棄上清，加人 300μL PBS磷酸緩沖液，混合均勻，加入 100μL5× SDSLoadingBuffer，煮沸 5min ，再進(jìn)行 12000r/min 離心 10min ，取 20μL 樣品上清液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3OsIAA10蛋白的純化（1）將 5μL 擴(kuò)繁好的工程菌菌液接種至 150mL 的LB培養(yǎng)液（含 150μL 氨芐青霉素和 0.2mmolL IPTG）中， 37% 過(guò)夜培養(yǎng)。（2）收集工程菌菌液至離心管中， 4^°C，5000r/min 離心 20min ，棄上清，收集沉淀。（3）在沉淀中加入4mL 裂解緩沖液，充分重懸菌體。（4）加入 40μL 蛋白酶抑制劑，混合均勻。5）加入 40μL 溶菌酶混勻，冰浴或冰上放置 30min 。（6）冰上超聲裂解細(xì)菌：使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（產(chǎn)品型號(hào)ZOLLO92-II，上海左樂(lè)儀器有限公司）在 200～300W 超聲功率下進(jìn)行超聲處理，每次處理 5s 、間隔 5s ，共超聲處理 7min 。（7） 4^°C5000r/min 離心 30min ，收集細(xì)菌裂解液上清，冰浴或冰上放置。（8）后續(xù)蛋白純化參考GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（貨號(hào)P2262）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsIAA10基因的擴(kuò)增和同源重組

利用OsIAA10基因的上下游特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1A）顯示，在 750～1000bp 之間有單一明亮條帶，與OsIAA10基因的編碼序列大小一致（ 843bp ，編碼281個(gè)氨基酸）。PCR產(chǎn)物經(jīng)柱回收試劑盒回收、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1B）顯示，出現(xiàn)單一目的條帶，說(shuō)明回收產(chǎn)物正確。利用一步同源重組試劑盒將目的基因與已經(jīng)切開(kāi)的pGEX-6p-1進(jìn)行連接，經(jīng)菌落PCR鑒定后，得到了12個(gè)陽(yáng)性克?。▓D

1C），說(shuō)明OsIAA10基因已經(jīng)連接到了原核表達(dá)載體上。

2.2原核表達(dá)載體pGEX-6p-1-IAA10的測(cè)序鑒定

將鑒定為陽(yáng)性的菌落用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與已知序列用Geneious軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，除終正密碼子TGA外，所有序列均一致。這表明pGEX-6p-1-IAA10原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 OsIAA10蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-IAA10轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)菌株BL21中，待長(zhǎng)出菌落后挑取單克隆擴(kuò)繁，菌液經(jīng) 0， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6mmol/L IPTG 37% 誘導(dǎo) 12h 后收集菌體，利用 5×SDS 溶液提取總蛋白，用SDS-PAGE（電壓 80V ，電流 250mA ）檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)情況。結(jié)果（圖3）表明，當(dāng)溫度為37% 、IPTG濃度為 0.1～0.6mmol/L 、誘導(dǎo)時(shí)間為12h時(shí)，均可誘導(dǎo)出OsIAA10蛋白；其中，當(dāng)IPTG濃度為0.2和 0.5mmol/L 時(shí)蛋白表達(dá)量最高，可用于后續(xù)蛋白純化。

在 37% 、IPTG濃度為 0.2mmol/L 、誘導(dǎo)時(shí)間^12h 的條件下，對(duì)蛋白表達(dá)菌株BL21進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，參照1.2.3的方法進(jìn)行OsIAA10融合蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 處出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小一致的條帶（圖4），表明該研究成功純化出了OsIAA10融合蛋白（其中E1＼～E5分別表示洗脫第1～5次后的蛋白樣品）。

3 結(jié)論與討論

研究以野生型中花11（ZH11）植株的cDNA為模板基因，通過(guò)pGEX-6p-1-IAA10上下游引物擴(kuò)增OsIAA10基因的編碼序列，再通過(guò)載體構(gòu)建獲得含OsIAA10基因的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-IAA10，將其轉(zhuǎn)入BL21菌株中，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化、SDS-PAGE檢測(cè)，獲得了與預(yù)期相符的單一蛋白條帶，經(jīng)驗(yàn)證該條帶是OsIAA10蛋白；對(duì)蛋白誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，溫度為 37^°C IPTG濃度為0.2mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為 ^12h 的條件為OsIAA10蛋白誘導(dǎo)的最優(yōu)條件。

植物激素是植物生長(zhǎng)發(fā)育中重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，其中生長(zhǎng)素是研究最廣泛的激素[8]。細(xì)胞核內(nèi)的TIR1/AFBs-Aux/IAA-ARFs信號(hào)通路介導(dǎo)了植物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)，該通路主要由生長(zhǎng)素/吲哚3-乙酸（Aux/IAA）和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）蛋白相互作用控制[9-11]。在模式生物擬南芥中有29個(gè)Aux/IAA基因，而水稻中有31個(gè)，說(shuō)明水稻的Aux/LAA基因存在某些獨(dú)有功能和模式[3-4]。目前，水稻中被報(bào)道的OsIAAs基因至少有17個(gè)，分別是1、3、6、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、20、23、25、26，它們?cè)谡{(diào)控水稻生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中發(fā)揮了重要功能[12-29]。該研究以 ZH11植株的cDNA 為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出OsIAA10基因的編碼序列，通過(guò)一步同源重組連接到蛋白表達(dá)載體pGEX-6p-1上，在溫度為 37^°C 、IPTG濃度為 0.2mmol/L 、誘導(dǎo)時(shí)間 12h 的條件下誘導(dǎo)出OsIAA10融合蛋白，利用蛋白純化試劑盒成功純化出單一的融合蛋白，為后續(xù)OsIAA10蛋白的功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的受體，具備遺傳背景清楚、基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善、繁殖迅速、操作方便、培養(yǎng)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，但是其融合蛋白表達(dá)過(guò)程中還受多種因素的影響，如誘導(dǎo)的條件、載體的類型等。在該研究原核表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中，選擇pGEX-6p-1作為表達(dá)載體，該載體融合GST標(biāo)簽，具有高效表達(dá)、易于純化、增加蛋白溶解度、提高蛋白穩(wěn)定性、便于下游應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)表達(dá)、純化以及后續(xù)的應(yīng)用提供了便利，是生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)研究中常用的高效表達(dá)載體之一。Yasukawa等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPTG濃度在 0.1～0.2 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量相對(duì)較高。本試驗(yàn)研究卻發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度在 0.5mmol/L 時(shí)，OsIAA10蛋白的表達(dá)量也較高，這可能是因?yàn)榫w在IPTG濃度為 0.5mmol/L 時(shí)，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)較好，有利于蛋白的表達(dá)。另外，在蛋白純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，35＼～40kDa和 處也存在非特異性條帶，這可能是由GlutathioneAgaroseBeads與目的蛋白結(jié)合的同時(shí)，也會(huì)與重組蛋白菌液中的其他蛋白相結(jié)合所致。

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（責(zé)任編輯：成平）