秋水仙素誘導(dǎo)陽光玫瑰葡萄多倍體的效果研究

中圖分類號：S663.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-2910（2025）02-0038-05

Study on the effects of colchicine-induced polyploidization in Shine Muscat grapes

ZHANGShihao， SUNXinru，F(xiàn)ENG Haonan，YAO Yuxin* （College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai'an，Shandong271018，China）

Abstract： The shoot segments of Shine Muscat grapes were used as materials， and 0 . 2 % 0 . 4 % ， 0 . 8 % ，and 1 . 2 % colchicine solutions were applied to treat the shoot with different times by the cotton immersion and soaking methods， the study was aimed to obtain the tetraploid grapes. The results showed that soaking grape branch segments in 0 . 4 % colchicine （ and 1 % dimethyl sulfoxide （ 2 0 0 m L ）for 6 days resulted in the greatest mutagenic effect， with a lethal rate of 5 0 . 0 0 % （20號 and a mutation rate of 6 . 6 0 % ， respectively. A total of 12 tetraploid and 2 mixed polyploid plants of the Sunshine Rose were obtained; The cotton soaking method with 1 . 2 % colchicine 2 0 0 m L + 1 % dimethyl sulfoxide 2 0 m L cotton soaked grape branch segments for 6 days showed the greatest mutagenic effect， with a lethal and mutation rate of 2 5 . 0 0 % and 6 . 0 0 % ， respectively.

Key words： grape; Shine Muscat; colchicine; induce; polyploidy

多倍體作物具有產(chǎn)量高、器官巨大、抗病抗逆能力強等特性，生產(chǎn)上有廣泛推廣應(yīng)用[1。多倍體育種受許多育種家的青睞，其中秋水仙素（Colchicine）誘導(dǎo)法較常見。20世紀(jì)50年代，Dermen利用秋水仙素誘導(dǎo)夏葡萄（Vitisaestivalis）、歐洲葡萄（ V . vinifera）和圓葉葡萄（V.rotundifolia），獲得了四倍體或嵌合體[2]。吳紅[3]、集賢4用秋水仙素分別處理維多利亞、優(yōu)無核葡萄的種子和試管苗，均獲得一定數(shù)量的四倍體植株。

秋水仙素誘導(dǎo)多倍體時其濃度和處理時間是影響誘變效果的關(guān)鍵因素。有研究表明，較有效的秋水仙素濃度為 0 . 0 0 1 % ～ 1 % ，誘導(dǎo)果樹多倍體的時間是 4 ～ 7 2 0 h 。一般通過設(shè)置不同的秋水仙素濃度和處理時間，探討誘導(dǎo)果樹多倍體的最優(yōu)濃度與時間組合[5]。

陽光玫瑰葡萄是以安蕓津21號與白南雜交選育而成的二倍體歐美雜交種品種[]。為提升其果實品質(zhì)及為葡萄遺傳改良提供新的親本材料，筆者于2023年3～12月在葡萄日光溫室大棚內(nèi)進行試驗，以秋水仙素對陽光玫瑰二倍體枝條進行處理，以獲得四倍體種質(zhì)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

以陽光玫瑰葡萄帶芽莖段為試材，莖段為冬季埋土防寒的葡萄枝條，處于休眠末期或剛萌動狀態(tài)。處理前將枝條剪成長 、帶2個芽的莖段。

試驗中所用藥品為秋水仙素粉末，純度 9 9 % HPLC級別，規(guī)格為 瓶，阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；化學(xué)滲透劑二甲基亞砜（DMSO），規(guī)格為 5 0 0 m L/ 瓶；細胞裂解液，Sigma-Aldrich生產(chǎn)；PI染色液；超純水。

試驗儀器包括離心機、高壓滅菌鍋、貝克曼CytoFLEX流式細胞儀、倍性分析試劑盒CyStainTMUV Precise。

1.2秋水仙素誘變液配制

將秋水仙素粉末與超純水按照 、1 ： 1 2 5 ， 3 ： 2 5 0 的比例分別配置適量的 0 . 2 % ， 0 . 4 % 、0 . 8 % 、 1 . 2 % 秋水仙素溶液，將4個濃度的秋水仙素溶液分別與 1 % 的滲透劑二甲基亞砜（DMSO）以1 0 ： 1 的比例混合，以混合液處理葡萄枝段。

配制裂解液：參考Veylder裂解液配制方法[7]。每 1 0 0 m L 超純水中加入 、 檸檬酸鈉、 0 . 4 1 8 g 3 - （ N- 嗎啉基）丙磺酸、2 0 0 μ L 曲拉通X-100（ 提供 離子，用于維持酶的活性或穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)；檸檬酸鈉螯合 、 等金屬離子，抑制金屬依賴的核酸酶，防止DNA降解；3-（N-嗎啉基）丙磺酸維持裂解液的pH穩(wěn)定，確保反應(yīng)條件適宜；曲拉通X-100破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，促進細胞裂解，釋放細胞內(nèi)含物）。

1.3 試驗設(shè)計

設(shè)置2種葡萄枝蔓誘變處理方法，一是秋水仙素誘變液浸泡法，二是秋水仙素液棉浸漬法。將陽光玫瑰葡萄二倍體一年生枝蔓剪成長 1 5 ～ 2 0 c m 的帶芽枝段，進行藥劑誘變處理。

1.3.1秋水仙素浸泡誘變法設(shè)置2個變量，變量1，處理濃度，設(shè)置 0 . 2 % 和 0 . 4 % 2 個梯度；變量2，處理時間，設(shè)置3d和6d2個時間，記作4個處理，即 0 . 2 % 處理3d、 0 . 2 % 處理6d、 0 . 4 % 處理3d、 0 . 4 % 處理6d，分別記作T1，T2，T3，T4。以噴清水作為對照（CK）。各處理和清水對照分別30個枝條。

于3月7日將陽光玫瑰葡萄帶芽莖段用小刀進行刻芽處理后浸泡于不同濃度的秋水仙素誘變液中。浸泡結(jié)束時，取出莖段用無菌水清洗3～4次，然后將莖段扦插入大棚苗床培養(yǎng)管理。

1.3.2秋水仙素棉浸誘變法設(shè)置2個變量，變量1，處理濃度，設(shè)置 0 . 8 % 和 1 . 2 % 2 個梯度；變量2，處理時間，設(shè)置5d和 個時間，記作4個處理，即 0 . 8 % 處理 5 d， 0 . 8 % 處理 1 0 d， 1 . 2 % 處理 5 d， 1 . 2 % 處理 1 0 d ，分別記作M1，M2，M3，M4。以噴清水作為對照（CK）。各處理100個枝條，清水對照30個枝條。

3月10日將葡萄帶芽莖段用小刀進行刻芽處理后，用雙層脫脂棉包裹芽位，再用保鮮膜裹緊，將經(jīng)過包裹處理的莖段扦插到大棚苗床上。在傍晚或清晨將 0 . 8 % 和 1 . 2 % 秋水仙素誘變液均勻地注入脫脂棉中，注射劑量保證處理芽充分浸泡在藥劑中，注射完成后及時覆蓋遮陽網(wǎng)，防止秋水仙素見光分解。隔天注射1次，直至枝條開始發(fā)芽后解除保鮮膜及脫脂棉，繼續(xù)在苗床上培養(yǎng)管理。

1.4植株倍性檢測

當(dāng)苗床葡萄插條生長40d后，使用貝克曼CytoFLEX流式細胞儀進行快速倍性鑒定，根據(jù)出現(xiàn)的細胞數(shù)峰值位置和基因強度Mean值進行倍性的判定。具體方法如下。

在苗床中取長勢良好的嫩葉測定倍性。用二倍體的峰值校準(zhǔn)流式分析儀，待峰值準(zhǔn)確穩(wěn)定后將所取嫩葉用蒸餾水清洗后放入一次性培養(yǎng)皿中，加入6 0 0 μ L 裂解液（倍性分析試劑盒CyStainTMUVPrecise），用雙面刀片垂直于試材下切成顆粒狀，再次加入 6 0 0 μ L 裂解液，保證試材充分浸透在溶液里 1 m i n ，以充分提取細胞核。在400目的過濾器中過濾殘渣，取 1 . 5 m L 澄清液于離心管中，加入適量的PI染色液，比例為 1 m L 裂解液加入 5 5 μ L PI染色液。靜置 1 m i n ，離心后上機檢測。根據(jù)流式細胞儀檢測出的峰值位置判定倍性，篩選出誘變成功且生根的莖段移植到大田中繼續(xù)觀察研究。

2 結(jié)果與分析

2.1秋水仙素浸泡法誘導(dǎo)多倍體的效果

如表1，用誘變混合液浸泡葡萄莖段，T1、T2秋水仙素濃度 0 . 2 % 時，誘變3d和6d的致死率分別是 3 . 3 3 % 和 1 0 . 0 0 % ，變異率分別是 0 % 和 3 . 3 3 % ：T3、T4秋水仙素濃度在 0 . 4 % 時，誘變3d和6d的致死率分別是 1 3 . 3 3 % 和 5 0 . 0 0 % ，變異率分別是 0 % 和 6 . 6 6 % 。說明誘變混合液濃度一定時，誘變時間是影響誘變效果的關(guān)鍵因素，誘變致死率與變異率均與誘變時間呈正相關(guān)。

誘變處理相同的時間，不同濃度的效果不同。處理3d時，T1、T3的時間相同， 0 . 2 % 和 0 . 4 % 秋水仙素誘變液致死率分別是 3 . 3 3 % 和 1 3 . 3 3 % ，變異率分別是 0 % 、 0 % ；處理6d時，T2、T4的時間相同，0 . 2 % 和 0 . 4 % 秋水仙素誘變致死率分別是 1 0 . 0 0 % 和5 0 . 0 0 % ，變異率分別是 3 . 3 3 % 7 6 . 6 6 % 。說明誘變時間一定時，誘變混合濃度是影響誘變效果的關(guān)鍵因素，誘變致死率、變異率均與誘變混合液的濃度呈正相關(guān)。

綜上，T4（ 0 . 4 % 秋水仙素 02 0 0 m L 浸泡6d）的誘變效果最大，誘變致死率和變異率分別是 5 0 . 0 0 % 和 6 . 6 6 % 。

2.2秋水仙素棉浸法誘導(dǎo)多倍體的效果

如表2，對用脫脂棉包裹的莖段注射誘導(dǎo)混合液，處理 Ml 、M2濃度在 0 . 8 % 時，處理5d和 1 0 d 的致死率分別為 1 1 . 0 0 % 和 1 6 . 0 0 % ，變異率分別是0 % 和 2 . 0 0 % ；M3、M4濃度在 1 . 2 % 時，處理5d和1 0 d 的致死率分別是 2 0 . 0 0 % 和 2 5 . 0 0 % ，變異率分別是 3 . 0 0 % 和 6 . 0 0 % 。說明誘變混合液濃度一定時，棉浸法誘變時間成為誘變效果的關(guān)鍵因素，誘變致死率與變異率均與誘變時間呈正相關(guān)。誘變處理5d時，M1、M3的時間相同， 0 . 8 % 和 1 . 2 % 的秋水仙素誘變液的誘變致死率分別是 1 1 . 0 0 % 和 2 0 . 0 0 % ，變異率分別是 0 % 、 3 . 0 0 % ；誘變處理10d時，M2、M4的時間相同， 0 . 8 % 和 1 . 2 % 的秋水仙素誘變液的誘變誘變致死率分別是 1 6 . 0 0 % 和 2 5 . 0 0 % ，變異率分別是2 . 0 0 % 、 6 . 0 0 % 。說明誘變時間一定時，誘變混合濃度成為誘變效果的關(guān)鍵因素，誘變致死率、變異率均與誘變混合液的濃度呈正相關(guān)。

綜上，以M4（ 1 . 2 % 秋水仙素 2 0 0 m L+1 % D M S C 02 0 m L 棉浸 1 0 d ）的誘變效果最大，誘變致死率和變異率分別是 2 5 . 0 0 % 和 6 . 0 0 % 。

2.3 葡萄變異植株倍性鑒定結(jié)果

對陽光玫瑰二倍體和經(jīng)秋水仙素誘變液處理的二倍體材料進行倍性分析，根據(jù)流式細胞儀出現(xiàn)細胞數(shù)峰值的位置和待測樣品的基因強度Mean值，比較四倍體Mean值與二倍體Mean值的比值（ ≈ ，判斷四倍體及混倍體，結(jié)果如圖1、圖2所示，縱坐標(biāo)為細胞總數(shù)，橫坐標(biāo)為DNA的熒光強度，四倍體峰值在二倍體之后，混倍體在二倍體和四倍體位置均有峰值。Mean值比較結(jié)果如表3，混倍體Mean值約1.80，四倍體Mean值約 2 . 0 0 。流式分析儀篩選出14組倍性變異植株，其中12株四倍體和2株混倍體陽光玫瑰。

3小結(jié)與討論

秋水仙素可抑制細胞分裂時紡錘體形成，阻礙染色體向細胞兩極移動，使染色體數(shù)目加倍，形成多倍體細胞。研究證實，借助適宜濃度秋水仙素與處理時間誘導(dǎo)植物多倍體，能夠成功培育多倍體植株[7]。采用秋水仙素溶液浸泡法和棉浸法處理二倍體陽光玫瑰葡萄枝段，均可得到一定數(shù)量的加倍變異體，隨著秋水仙素濃度和處理時間的增加，其致死率升高，這與潘宏兵等[8在石榴、劉牧青等[]在不同葡萄品種上的研究結(jié)果一致。

從誘導(dǎo)效果看，浸泡法處理誘導(dǎo)效果較好。當(dāng)秋水仙素濃度為 0 . 4 % 、處理時間6d時，變異率達6 . 6 6 % ，致死率為 5 0 . 0 0 % 。比棉浸法操作更簡便、工作量更小，不過秋水仙素使用量更大。從影響因素分析，浸泡法在 0 . 2 % 和 0 . 4 % 濃度條件下，處理時間對材料的影響程度大于濃度；而棉浸法中，時間與濃度對試材的誘變作用均較為顯著。因此，后續(xù)試驗可增設(shè)組培苗、種子等材料，并拓展至其他葡萄品種開展處理研究，進一步完善葡萄秋水仙素誘變體系。

利用秋水仙素進行誘導(dǎo)時出現(xiàn)嵌合體是常見的，隨著處理時間和秋水仙素處理濃度的增加而增加[10]?；瘜W(xué)滲透劑二甲基亞礬與秋水仙素混合使用會增強其對細胞分裂的抑制作用而大大降低嵌合體的產(chǎn)生[]。本試驗利用秋水仙素與二甲基亞砜的混合液處理陽光玫瑰葡萄莖段，共獲得了12株四倍體和2株混倍體，數(shù)量明顯較少，這與張虹等[12]在黑果枸杞萌動種子上的研究結(jié)果一致。

葡萄染色體數(shù)量較多，不易觀察，且工作量大，使用流式細胞儀成功測得陽光玫瑰誘變枝條的倍性，判斷并篩選出變異體，可以定量測試植物不同部位細胞中RNA、DNA的含量。與傳統(tǒng)的組型分析法染色體計數(shù)法相比，該方法能較為迅速準(zhǔn)確地鑒定植物倍性，方法簡便，精準(zhǔn)度較高[13，14]，已在獼猴桃[15]、山楂[16]、菊芋[17]等植物上應(yīng)用并成功測出了植株的倍性。該研究利用流式分析儀成功測得陽光玫瑰誘變枝條的倍性，判斷并篩選出變異體。后續(xù)將變異體移栽到田間進行性狀觀察和相關(guān)生理指標(biāo)測定，以獲得穩(wěn)定的多倍體株系，為陽光玫瑰葡萄多倍體育種提供種質(zhì)資源。

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