番茄灰霉病生防菌的分離鑒定·發(fā)酵條件優(yōu)化及其防治效果

關(guān)鍵詞灰葡萄孢；銅綠假單胞菌；鑒定；發(fā)酵優(yōu)化；生防

中圖分類號 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號 0517-6611（2025）08-0133-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

AbstractAbcoacte35withoodcotetagistBotrtsineresolatedfrozospresoiloftatoi tion rate was 5 1 . 6 7 % .Thestrain was identifiedasPseudomonas aeruginosa basedonmorphological and molecular biologyanalysis.Theoptimized cultural medium and fermentation conditions for strain 2135 resulted in an inhibition rate of 9 2 . 9 4 % .Thebiocontrol effect of different dilutedconcentratiosofferentationbrothontomatgayoldinitroandpotedpantsasevaluatedTesultsshowedtatteoalfer mentation broth hada biocontrol effect of 8 6 . 0 5 % on detached leaves and 7 5 . 5 3 % on potted plants.

Key WordsBotrytis cinerea；Pseudomonas aeruginosa；Identification；Fermentationoptimization；Control effect

番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)上發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重的一種病害。該病菌可對番茄的多個(gè)部位進(jìn)行侵染危害，在番茄果實(shí)表面形成“花臉斑”，嚴(yán)重后果實(shí)被霉層覆蓋腐爛；在葉片上形成“V\"形斑或圓形斑，造成葉片脫落，還能引起植株莖稈腐爛[1]。番茄灰霉病在全國各地番茄種植地區(qū)廣泛流行，尤其是對高溫高濕的保護(hù)地番茄危害更加嚴(yán)重[2]。常常造成番茄植株死亡，直接減產(chǎn)20%～30%，甚至60%以上[3-4] 。

番茄灰霉病的防治方法主要有選育抗病品種、使用化學(xué)藥劑防治以及生物防治。由于選育品種時(shí)間較長等因素導(dǎo)致目前該病的抗性品種較少，而使用化學(xué)藥劑防治會出現(xiàn)環(huán)境污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題[5]。生物防治中的生防菌均篩選于自然界，對環(huán)境友好，對人類安全，因此生物防治成為當(dāng)今病害防治的新方法和研究熱點(diǎn)[6-7]

菌株2135是從番茄根部周圍土壤中篩選到的1株細(xì)菌，研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌對番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）具有較強(qiáng)的抑制效果。筆者對菌株2135進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、 DNA序列分析以及生理生化測定等研究，探索了該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件，并初步研究了其拮抗效果，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤、植株選取及采集。在設(shè)施蔬菜種植區(qū)（ 番茄灰霉病發(fā)生嚴(yán)重的地塊取土，將番茄根際周圍 王層的王壤取出，上下翻動，混勻后裝入自封袋中。

選取番茄灰霉病發(fā)病植株及健康植株的根和莖，然后裝入自封袋中。1.1.2菌株。供試番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）由分離并保存。1.1.3培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白陳 ，酵母粉 ，蒸餾水 ；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 ，葡萄糖 ，瓊脂 ，蒸餾水 。1.1.4番茄品種。番茄品種“漢姆1699”，由赤峰和潤農(nóng)業(yè)高新科技產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司選育。

1.2 方法

1.2.1生防菌株分離。采用平板稀釋法對采集的土壤及番茄根莖中的生防菌進(jìn)行分離。用無菌水對土壤進(jìn)行梯度稀釋，配制稀釋到 的土壤懸浮液；將番茄根莖表面清洗干凈，選取內(nèi)部組織置于研缽中，用磷酸緩沖液磨碎，用無菌水將研磨液配制成 的懸浮液。吸取土壤和根莖懸浮液上清液 ，分別涂布于LB培養(yǎng)基上。

將平板置于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，選取菌落特征不同的單菌落，純化培養(yǎng)，觀察記錄各菌落特征。重復(fù)3次。1.2.2生防菌株篩選。采用平板對峙法對分離出的菌株進(jìn)行番茄灰霉病菌的抑制作用測定。將活化培養(yǎng)7d的番茄灰霉病菌打成直徑 的菌餅，將菌餅置于PDA平板中央，在距離菌餅 處用滅菌針點(diǎn)接菌株2135，設(shè)不接菌株2135的PDA平板為對照，置于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)3次。待對照平板灰霉菌長滿培養(yǎng)血時(shí)調(diào)查結(jié)果。

抑菌率 （對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑 × 1 0 0 %

1.2.3 生防菌株鑒定。

1.2.3.1培養(yǎng)性狀觀察。將活化后的菌株劃線培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基上， 培養(yǎng) ，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]觀察記錄菌落顏色、形狀等特征。同時(shí)將不同菌株進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.3.2分子生物學(xué)鑒定。菌株采用16SrDNA基因序列分析并對生防菌進(jìn)行序列鑒定。菌株DNA的提取使用TS-INGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）。采用通用引物27F（ -AGTTTGATCMTGGCTCAG- ）和1492R（ -GGTTAC-CTTGTTACGACTT- ）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。由擎科生物有限公司進(jìn)行測序，比對采用MEGA7.0軟件，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用 Neighbor-Joining 法。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化。

1.2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化。方法參照潘曉梅[0]，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉。氮源分別為硝酸銨、氯化銨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉。無機(jī)鹽分別為硫酸鎂、色氨酸、氯化錳、硫酸鐵、氯化鈣。將不同成分發(fā)酵液 裝入 滅菌三角瓶中，然后選取在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng) 的菌株2135單菌落分別接人不同成分的發(fā)酵液中，每瓶接種一個(gè)單菌落。將發(fā)酵液置于 的振蕩培養(yǎng)箱中（ 培養(yǎng) ，按 與PDA混合均勻后倒入培養(yǎng)皿。在各處理培養(yǎng)皿中接入番茄灰霉菌，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于 恒溫培養(yǎng)箱中，7d后調(diào)查結(jié)果。

1.2.4.2發(fā)酵條件優(yōu)化。方法參照潘曉梅[10]，接種量分別為1 % 2 % . 5 % 和 10 % 。發(fā)酵時(shí)間為 ，每處理間隔 。搖床轉(zhuǎn)速為 ，每處理間隔 ；初始 為 ，每處理間隔0.5；溫度為 ，每處理間隔 次重復(fù)。

1.2.5 菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病的生防效果評價(jià)。

1.2.5.1菌株發(fā)酵液對番茄離體葉灰霉病的生防效果。方法參照潘曉梅[10]，將濃度為 個(gè) 的番茄灰霉菌孢子懸浮液，分別與不同稀釋濃度的菌株發(fā)酵液以1：1體積混合均勻。每個(gè)培養(yǎng)皿中放置1片番茄葉，番茄葉下使用浸濕的濾紙進(jìn)行保濕，在番茄葉主葉脈旁接人上述各混合液 次重復(fù)，置于 恒溫培養(yǎng)箱中，7d后調(diào)查結(jié)果。

防效 （對照組平均病斑直徑-處理組平均病斑直徑）/對照組平均病斑直徑 × 1 0 0 %

1.2.5.2菌株發(fā)酵液對盆栽番茄灰霉病的生防效果。選取苗齡 的番茄進(jìn)行試驗(yàn)，先在番茄葉片上噴灑菌株發(fā)酵液， 后再在噴灑過菌株發(fā)酵液的葉片上噴灑濃度為 1 × 個(gè) 的番茄灰霉菌孢子懸浮液。對照不噴灑菌株發(fā)酵液，直接噴灑番茄灰霉菌孢子懸浮液。每處理1株番茄，每株番茄處理5片真葉，3次重復(fù)。對照開始發(fā)病后，每隔 調(diào)查1次發(fā)病情況。分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉面積 1 / 2 0 以下；2級，病斑面積占葉面積gt; 級，病斑面積占葉面積 gt; 1 / 6 ～ 1 / 3 ； 4 級，病斑面積占葉面積gt;13～12；5級，病斑面積占葉面積12 以上[1]

病情指數(shù) = Σ （各級病葉數(shù) × 相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級數(shù)值） × 1 0 0

防治效果 （對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù) × 1 0 0 %

2 結(jié)果與分析

2.1生防菌的篩選從赤峰市松山區(qū)初頭朗鎮(zhèn)、大廟鎮(zhèn)蔬菜種植園區(qū)共采集番茄根際土壤5份，采集番茄灰霉病發(fā)病番茄根和莖4份，共分離純化52株細(xì)菌。其中9株菌對番茄灰霉病菌的拮抗效果明顯（圖1），抑菌率可達(dá) 4 0 . 4 2 % ～5 1 . 6 7 % ，其中2135拮抗效果最明顯，抑菌率可達(dá) 5 1 . 6 7 % （表1），因此選取菌株2135作為番茄灰霉病菌的拮抗菌。

Fig.1Inhibition effects of different strains on mycelia against Botrytis cinerea

2.2 菌株2135的鑒定

2.2.1菌株2135的菌落形態(tài)。菌株2135在LB培養(yǎng)基上為黃綠色、圓形、光滑的菌落，菌落微隆起，革蘭氏陰性（圖2）。2.2.2菌株2135的分子鑒定。將菌株2135的16SrDNA基因片段序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株2135與銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa聚在同一分支（圖3）。根據(jù)菌株2135的培養(yǎng)特征和16SrDNA基因序列分析，將菌株2135鑒定為銅綠假單胞菌 P.aeruginosa。

2.3發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.3.1不同碳源發(fā)酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。由圖4可知，發(fā)酵液中加入碳源后，番茄灰霉菌菌落直徑均顯著小于基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基（ 。其中加入蔗糖后，菌株2135發(fā)酵液的抑制效果最好，對番茄灰霉病菌的抑菌率為 9 2 . 5 9 % ，其次為葡萄糖，因此菌株2135最佳發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為蔗糖。2.3.2不同氮源發(fā)酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。當(dāng)?shù)礊長B、硫酸銨、硝酸銨和尿素時(shí)，番茄灰霉菌菌落差異不顯著（圖4），因此選擇LB、硫酸銨、硝酸銨和尿素作為氮源均可。

2.3.3不同無機(jī)鹽發(fā)酵液對番茄灰霉菌抑菌率的影響。當(dāng)無機(jī)鹽為硫酸鎂時(shí)，番茄灰霉病菌的菌落直徑小于基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基（圖4），因此應(yīng)選擇硫酸鎂作為最佳無機(jī)鹽。

2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1接種量對菌株抗菌活性的影響。由圖5可知，當(dāng)菌株2135的接種量為 10 % 時(shí)，番茄灰霉菌的菌落直徑顯著小于其他接種量的菌落直徑（ ），發(fā)酵液抑菌率最大，因此，發(fā)酵液接種量選擇 10 % 。

2.4.2發(fā)酵時(shí)間對菌株抗菌活性的影響。發(fā)酵培養(yǎng) 時(shí)，發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理（ ，為 9 2 . 9 4 % （圖5），因此，菌株2135最佳發(fā)酵時(shí)間為 。

2.4.3搖床轉(zhuǎn)速對菌株抗菌活性的影響。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為 時(shí)，發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理（ P lt; 0 . 0 5 ）（圖5），因此，菌株2135最佳搖床轉(zhuǎn)速為 。

2.4.4初始""對菌株抗菌活性的影響。當(dāng)初始pH為 5 . 0 ～6.5時(shí)，發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理

1""（圖5），因此，菌株2135發(fā)酵液最佳初始pH為5.0～6.5。

2.4.5溫度對菌株抗菌活性的影響。當(dāng)培養(yǎng)溫度為 2 6 ～ 時(shí)，發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑菌率顯著高于其他處理L （圖5），因此，菌株2135最佳發(fā)酵液培養(yǎng)溫度為

。

2.5 菌株2135對番茄灰霉病的生防效果

2.5.1菌株發(fā)酵液對番茄離體葉片灰霉病的生防效果。接種7d后，對照葉片番茄灰霉病平均病斑直徑為 ，菌株發(fā)酵液處理的葉片，菌株發(fā)酵液濃度越大，病斑越大（圖6）。發(fā)酵液原液防效達(dá) 8 4 . 5 0 % ，發(fā)酵液2倍稀釋液防效達(dá)7 6 . 7 4 % （表2）。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ 。

2.5.2菌株發(fā)酵液對盆栽番茄灰霉病的生防效果。研究表明，菌株發(fā)酵液的稀釋濃度越小，盆栽番茄灰霉病的病情指數(shù)越小，防治效果越明顯（圖7）。菌株發(fā)酵液原液的防治效果為 7 5 . 5 3 % ， 2 倍稀釋液防效為 7 2 . 7 7 % ， 4 倍稀釋液防效降為 5 7 . 6 8 % ，且與原液和2倍稀釋液差異顯著（ "。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)從番茄根部周圍的土壤中篩選出1株對番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）具有顯著拮抗效果的細(xì)菌2135，并鑒定其為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。假單胞菌屬細(xì)菌是一類分布廣泛的微生物，近年來，假單胞菌防治病害的報(bào)道較多。黃藝爍等[12-14]分別研究了假單胞菌對番茄匍柄霉葉斑病、萵筍鏈格孢葉斑病、草莓炭疽病的防治作用。

該研究中的菌株2135對番茄灰霉病菌抑制效果良好，梁衛(wèi)驅(qū)等[15報(bào)道了銅綠假單胞菌對豆角的促生、抗病效果，而鮮有關(guān)于銅綠假單胞菌防治番茄灰霉病的研究，因此該生防菌具有一定的開發(fā)潛力。

該研究中菌株2135的最適碳源為蔗糖，氮源為蛋白陳，這與魏靖宇等[16]報(bào)道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi-nosa）最佳碳氮源一致。而吳翔等[17研究的銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）最適碳氮源為葡萄糖和谷氨酸，潘洪玉等[18]研究的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的最佳碳源為果糖，均與該研究結(jié)果不同。

王燕等[19]研究的Pseudomonasextremorientalis 最適pH為7.31，穆曉雅等[20]報(bào)道的菊苣假單胞菌（Pseudomonasci-chorii）最佳pH為7，而該研究菌株2135的最適pH為 5 . 0 ～ 6.0，說明酸性環(huán)境較適合菌株2135生長，與上述菌株不同。

通過對菌株發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株2135的無菌發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌率可達(dá) 9 2 . 9 4 % 。無菌發(fā)酵液原液對番茄離體葉灰霉病的防效為 8 6 . 0 5 % ，對盆栽番茄灰霉病的防效為 7 5 . 5 3 % 。表明菌株2135抑制番茄灰霉病的效果明顯，具有良好的生物防治菌劑應(yīng)用潛力。

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