鴿源大腸桿菌的分離鑒定·耐藥性及致病性分析

關(guān)鍵詞鴿；大腸桿菌；分離鑒定；耐藥性；致病性中圖分類號(hào)S858.39文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 0517-6611（2025）08-0070-06doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

AbstractObetie]TopovidereferencefortheprevetioandcontrolofEscherichcolidiseaseandliicalmedicationinpigeobd ingMethod]oadaldctealttgsitalo tinganddetectionofsistaegensandviulencegensResulteesulssowdtatorofschericcoliwasisolaterote livertissueofdeasedpigeonsonestrainfroteanalswabofdarealpgeonsdoestrainfromtheeadebropigeongaed E coli-SWEclodt drugs.The resistance genes of T E M ， a a c C 2 ， a a c C 4 ， q n r A ， s u l 1 ， s u l 2 ， f l o R ， and tetA could be detected.Three strains of Escherichia coli could kill mice，the virulence genes fyuA and irp2 were detected in E .coli-SW and E.coli-FX，while no virulence genes were detected in E.coli-SP.[Conclusion]Thresolatedasofeccoliveuplegsistaedrtainptogeciyodingfereefore and research of Escherichia coli disease of pigeons in the local area.

Key Words Pigeon；Escherichia coli；Isolation and identification；Drug resistance；Pathogenicity

大腸桿菌（Escherichiacoli）是一種廣泛分布于自然界、人類和動(dòng)物的革蘭氏陰性人獸共患病原菌，它不僅嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，還可以通過污染的蔬菜、飲水、動(dòng)物源產(chǎn)品及其他食品導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生，從而威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全[1-2]；此外，大腸桿菌多重耐藥情況嚴(yán)峻，這些耐藥菌株和耐藥基因可以通過環(huán)境和食物鏈引起公共衛(wèi)生安全問題[3-4]。由大腸桿菌導(dǎo)致的禽大腸桿菌病可引起禽類的多系統(tǒng)混合感染，感染肉鴿后可引起精神沉郁、食欲減退和腹瀉等臨床癥狀，通常伴有敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎和腹膜炎等病理變化。此外，它還會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，并對(duì)乳鴿和童鴿造成更為嚴(yán)重的臨床癥狀[5-7]。大腸桿菌還會(huì)與其他病原混合感染[7-10]，由此導(dǎo)致疾病的復(fù)雜性并增加病鴿的死亡率，給肉鴿養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

廣西某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)青年鴿零星發(fā)病，駐場(chǎng)技術(shù)人員臨床診斷疑為大腸桿菌感染，且死胚鴿蛋有所增加。基于此，該研究確定引起肉鴿死亡的病原菌，并進(jìn)一步對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥性和致病性分析，以期為肉鴿養(yǎng)殖中大腸桿菌病的防控和臨床用藥提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料。廣西某肉鴿場(chǎng)送檢的病死鴿、腹瀉病鴿和死胚鴿蛋。

1.1.2主要試劑。標(biāo)準(zhǔn)DL2O00DNAMarker，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司； 2 × RapidTaqMasterMix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB瓊脂、LB肉湯、麥康凱瓊脂、大腸埃希氏菌干制生化鑒定試劑盒等，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3主要儀器。PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳成像儀，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；凝膠電泳儀，購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.4試驗(yàn)動(dòng)物。昆明小鼠（KM小鼠），體質(zhì)量 ，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病料處理。廣西某肉鴿場(chǎng)送檢的病死鴿4只、腹瀉病鴿1只，死胚鴿蛋若干個(gè)。對(duì)送檢的病死鴿進(jìn)行剖檢，無(wú)菌采集肝、腎、脾、肺等組織；對(duì)腹瀉病鴿采集肛拭子備用；死胚鴿蛋取尿囊液備用。

1.2.2細(xì)菌分離。分別將病死鴿肝臟組織樣品、腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液接種于麥康凱瓊脂，分離純化后對(duì)各菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.2.3生化鑒定。將分離菌株接種大腸埃希氏菌干制生化鑒定試劑， 培養(yǎng) 后，記錄各生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序。根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取各菌株基因組DNA，合成用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA的引物（ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- ，R： -GGTTACCTTGTTACGACTT ，擴(kuò)增片段大小約為

）。以提取的細(xì)菌DNA為模板分別擴(kuò)增16SrRNA基因片段并送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列通過在線工具BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5藥敏試驗(yàn)。針對(duì)大腸桿菌，采用6類18種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。將細(xì)菌菌液分別在LB平板上涂布后，貼上藥敏紙片，置于 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) ，測(cè)量抑菌圈直徑，判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

1.2.6細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)。參考文獻(xiàn)合成相關(guān)耐藥基因引物（表1），包括氨基糖苷類耐藥基因aacC2和 內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM和 C T X 、喹諾酮類耐藥基因qnrA和 、四環(huán)素類耐藥基因tetA和tetB、磺胺類耐藥基因 sul1和sul2、氯霉素類耐藥基因 。以提取的細(xì)菌DNA 為模板進(jìn)行耐藥基因PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

1.2.7動(dòng)物致病性試驗(yàn)。各菌株劃線接種于LB瓊脂，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng) ，分別通過平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將各菌液濃度調(diào)至 cfu/mL備用。取KM小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，其中試驗(yàn)組腹腔注射菌液 ，對(duì)照組腹腔注射LB肉湯 ，觀察小鼠的發(fā)病和死亡情況。

1.2.8細(xì)菌毒力基因檢測(cè)。參考文獻(xiàn)合成大腸桿菌7種毒力基因引物（表2），包括fyuA和irp2基因（耶爾森菌強(qiáng)毒力島HPI）papA和 papC基因（P菌毛）afa基因（黏附素）[13]ler和eaeA基因（腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島LEE）[14]，以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行毒力基因的PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1剖檢結(jié)果對(duì)病死鴿進(jìn)行剖檢，可見心臟覆有黃色纖維素性滲出物（圖1）。

2.2細(xì)菌分離純化將病樣接種麥康凱瓊脂，結(jié)果分別從3只病死鴿心、肝組織中分離到3株細(xì)菌，從腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液中各分離出1株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，5株細(xì)菌在麥康凱瓊脂平板均長(zhǎng)出桃紅色菌落（圖2A）。對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果5株細(xì)菌均呈長(zhǎng)短不一、兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌（圖2B）。

2.3生化試驗(yàn)將5株分離菌株接種大腸埃希氏菌生化鑒定試劑，結(jié)果顯示，5株細(xì)菌靛基質(zhì)、MR、VP和西蒙氏檸檬酸鹽項(xiàng)目的反應(yīng)結(jié)果分別為陽(yáng)性、陽(yáng)性、陰性、陰性，符合大腸桿菌的生化特性。

2.416SrRNA基因擴(kuò)增與序列分析擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因，結(jié)果擴(kuò)增到約 的特異性條帶（圖3）。測(cè)序序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)從病死鴿心、肝組織分離到的3株細(xì)菌16SrRNA基因序列一致，判斷它們?cè)谶z傳進(jìn)化上親緣關(guān)系一致，選擇其中1株菌株進(jìn)行后續(xù)研究。從病死鴿肝組織、腹瀉鴿肛拭子、死胚尿囊液分離的細(xì)菌之間16SrRNA基因序列同源性為9 8 . 8 7 % ～ 9 9 . 5 8 % ，并分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中多株大腸桿菌如PP157583、CP055251、CP046396同源性為 100 % 、 9 9 . 9 3 % ！100 % 。結(jié)合分離菌株的菌落和菌體形態(tài)、生化鑒定結(jié)果可注：A.麥康凱培養(yǎng)基；B.革蘭氏染色鏡檢（ 1 0 0 0 × 。Note：A.Maconkeyagar；B.Gram stainmicroscopy（ 1 0 0 0 × ）知，從病死鴿、腹瀉鴿、死胚分離的細(xì)菌為大腸桿菌，分別命 名為

2.5藥敏試驗(yàn)用18種常見藥物對(duì)3株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，由表3可知，3株大腸桿菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、阿米卡星敏感，對(duì)其他15種藥物均耐藥，表明大腸桿菌存在嚴(yán)重的多重耐藥情況。

注：M.DL200ODNAMarker；1.E.coli-SW；2.E.coli-FX；3.E.coli-SP.

2.6耐藥基因檢測(cè)對(duì)分離的3株大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果表明， 和 檢測(cè)到TEM、CTX、aacC2、aacC4、qnrA、sul1、floR、tetA耐藥基因，未檢出qnrB、sul2、tetB耐藥基因（圖4A），而 檢測(cè)到TEM、 耐藥基因，未檢測(cè)到 qnrB、sul2、tetB耐藥基因（圖4B），表明分離的3株大腸桿菌攜帶較為廣譜的耐藥基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符。

2.7動(dòng)物致病性試驗(yàn)分別將3株大腸桿菌接種試驗(yàn)組小鼠，結(jié)果 組小鼠接種后出現(xiàn)精神沉郁、扎堆不動(dòng)、食欲廢絕、肌肉震顫等癥狀，并于接種 內(nèi)全部死亡；E.coli-SP組小鼠接種后精神沉郁，接種后 內(nèi)死亡1只，其余小鼠后期逐漸恢復(fù)。

從死亡小鼠的肝臟中能分離到病原菌，其菌落形態(tài)及生化鑒定結(jié)果與接種菌株一致，表明分離的3株大腸桿菌具有一定的致病性，且E.coli-SW、E.coli-FX致病力強(qiáng)于E.coli-SP。

2.8毒力基因檢測(cè)對(duì)分離的3株大腸桿菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，結(jié)果表明，E.coli-SW和 檢測(cè)到fyuA和irp2毒力基因，而E.coli-SP未檢測(cè)到毒力基因（圖5）。

3結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著政策的扶持和社會(huì)資本的投入，肉鴿產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展。然而，肉鴿規(guī)?；B(yǎng)殖的同時(shí)也伴隨著疾病的發(fā)生。近年來(lái)，有關(guān)肉鴿大腸桿菌病的報(bào)道呈上升趨勢(shì)[5-6，15-16]，與其他病原混合感染引起肉鴿發(fā)病的報(bào)道更是屢見不鮮[7-10]，鴿病的多樣性和復(fù)雜性，給肉鴿養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該試驗(yàn)從肉鴿場(chǎng)病樣中分離到3株致病菌，通過菌體觀察、生化鑒定和16SrRNA測(cè)序分析，確定3株病原菌均為大腸桿菌，分別命名為 SP，3株大腸桿菌之間16SrRNA基因序列同源性為 9 8 . 8 7 % ～9 9 . 5 8 % 。動(dòng)物致病性試驗(yàn)證實(shí)，3株分離菌株對(duì)小白鼠具有一定致病性，應(yīng)該引起獸醫(yī)工作者、養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶對(duì)大腸桿菌病的重視，如果不加以控制，一旦在鴿群流行并導(dǎo)致疾病的發(fā)生，將會(huì)給養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

毒力因子對(duì)大腸桿菌的致病性息息相關(guān)，大腸桿菌主要毒力因子有耶爾森菌強(qiáng)毒力島（HPI） 菌毛、腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島（LEE）、攝鐵系統(tǒng)、溫度敏感性血凝素（Tsh）、溶血素（hlyF）、侵襲素和空泡毒素[17]。該試驗(yàn)通過檢測(cè)fyuA和irp2基因（耶爾森菌強(qiáng)毒力島HPI）papA和papC基因（P菌毛）ler和eaeA基因（腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島LEE）和afa基因（黏附素）7個(gè)毒力基因來(lái)評(píng)估3株大腸桿菌的致病力，結(jié)果E.coli-SW和E.coli-FX檢測(cè)到fyuA和irp2毒力基因，而E.coli-SP未檢測(cè)到毒力基因。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的3株大腸桿菌均具有一定致病性，且 FX致病性強(qiáng)于 ，這可能與E.coli-SW、E.coli-FX攜帶fyuA和irp2毒力基因有關(guān)，相關(guān)致病機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外，雖然E.coli-SP毒力較弱，但其可能與鴿胚孵化率降低有關(guān)，應(yīng)該引起重視。

目前，畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中大腸桿菌耐藥情況嚴(yán)重[4，18]，鴿是大腸桿菌耐藥菌株的常見攜帶者之一[10，19]。該試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果表明，3株大腸桿菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、阿米卡星敏感，對(duì)其他15種藥物均耐藥，同時(shí)檢測(cè)到 β -內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、氨基糖苷類耐藥基因aacC2和aacC4、喹諾酮類耐藥基因qnrA、磺胺類耐藥基因 s u l 1 、氯霉素類耐藥基因floR、四環(huán)素類耐藥基因tetA，表明分離的大腸桿菌存在嚴(yán)重的多重耐藥情況，與王洪彬等[14]和沈欣悅等[6報(bào)道的鴿源大腸桿菌的多重耐藥結(jié)果一致，但楊文儀等[報(bào)道的鴿源大腸桿菌對(duì)阿莫西林、氧氟沙星和諾氟沙星敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢呋辛、新霉素等表現(xiàn)為中介，耐藥情況較為良好，這可能與菌株來(lái)源有關(guān)。此外，分離菌株雖然攜帶氨基糖苷類耐藥基因aaaC2和aaaC4，但對(duì)阿米卡星敏感，這可能是由于耐藥基因與耐藥譜之間關(guān)系較為復(fù)雜，導(dǎo)致二者的結(jié)果不能達(dá)到一一對(duì)應(yīng)，出現(xiàn)菌株對(duì)某類藥物耐藥卻未檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因或檢測(cè)到了耐藥基因卻對(duì)藥物敏感的現(xiàn)象，也可能與菌株存在其他氨基糖昔類耐藥基因或其他耐藥機(jī)制有關(guān)[20]；另外，阿米卡星是卡那霉素的半合成衍生物，對(duì)氨基糖苷類鈍化酶具有一定穩(wěn)定性，其耐藥率遠(yuǎn)低于其他氨基糖苷類藥物[21]。由此可知，多種原因?qū)е铝朔蛛x菌株雖然攜帶相關(guān)氨基糖苷類耐藥基因卻對(duì)阿米卡星敏感的現(xiàn)象。

細(xì)菌耐藥與大量抗生素的使用有關(guān)，因此在鴿群發(fā)生細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，該肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)科學(xué)合理地使用頭孢他啶、頭孢曲松等第三代頭孢菌素或者阿米卡星進(jìn)行防治。使用養(yǎng)殖場(chǎng)分離的病原菌制備的滅活疫苗是一種行之有效的預(yù)防措施，對(duì)于常見細(xì)菌病具有防控作用[22]；積極尋找一些中藥、益生菌、抗菌肽、微量元素、植物提取物以及復(fù)合添加劑等抗生素替代品用于鴿群的預(yù)防保健[23]，有報(bào)道應(yīng)用乳酸桿菌可以預(yù)防由大腸桿菌導(dǎo)致的鴿腹瀉，是一種有效的抗生素替代品[24]；加強(qiáng)生物安全防控和日常管理工作，改善養(yǎng)殖環(huán)境，重視鴿病的預(yù)防和凈化工作，防止或減少多種病原混合感染的發(fā)生，避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

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