連翹脂素調(diào)節(jié)cAMP/EPAC1/RAP1信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響

摘要：目的 探究連翹脂素調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷腺苷激活的交換蛋白1/Ras相關(guān)蛋白1（cAMP/EPAC1/RAP1）信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響。方法 體外培養(yǎng)肺癌細胞A549，并分為對照組，連翹脂素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/L），連翹脂素高劑量+百日咳毒素（PTX）組（100 mg/L連翹脂素+5 μmol/L PTX），連翹脂素高劑量+EPAC1拮抗劑（ESI-09）組（100 mg/L連翹脂素+1.5 μmol/L ESI-09）。CCK-8實驗檢測細胞增殖；劃痕實驗檢測細胞遷移；Transwell檢測細胞侵襲；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞上清液cAMP水平；Western blot分析cAMP/EPAC1/RAP1信號通路及凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達。結(jié)果 相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組OD450值、劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)目、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2表達下降，細胞凋亡率和Bax表達升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與連翹脂素高劑量組比較，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞中光密度（OD）450值、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)目、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2蛋白表達增加，細胞凋亡率和Bax表達下降（P＜0.05）；連翹脂素高劑量+ESI-09組各指標水平均與之相反。結(jié)論 連翹脂素通過下調(diào)cAMP/EPAC1/RAP1信號通路阻礙A549細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：肺腫瘤；連翹脂素；細胞增殖；細胞凋亡；cAMP/EPAC1/RAP1信號通路

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20250063

肺癌是常見的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年遞增，對其早期治療通?？扇〉幂^好的預后效果，而晚期預后較差［1］。因此，亟需開發(fā)高效的新治療藥物，尋找有效的診斷分子來改善患者預后。連翹脂素又稱為連翹苷，提取于木犀科植物連翹干燥果實中［2］。研究發(fā)現(xiàn)，連翹脂素具有抗癌、抗菌和抗炎等藥理作用［3］。吳林斌等［4］研究發(fā)現(xiàn)連翹苷可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路削弱腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是一種蛋白激酶致活劑，可通過與cAMP激活的交換蛋白1（EPAC1）作用使Ras相關(guān)蛋白1（RAP1）脫離鳥苷二磷酸（GDP），結(jié)合鳥苷三磷酸（GTP），激活下游分子，從而調(diào)控細胞生長過程［5］。Moon等［6］研究發(fā)現(xiàn)抑制EPAC1/RAP1通路可抑制腦腫瘤細胞生長。但連翹脂素調(diào)節(jié)cAMP/EPAC1/RAP1信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響尚未可知。因此，本研究將深入探討連翹脂素對肺癌細胞增殖、遷移等惡性進展的影響及其與cAMP/EPAC1/RAP1信號通路的調(diào)節(jié)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肺癌細胞A549購自中國科學院細胞庫；CCK-8試劑盒購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；EPAC1拮抗劑（ESI-09）購自上海源葉生物科技有限公司；百日咳毒素（PTX）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；cAMP酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及羊抗兔二抗HRP購自Abcam（英國）公司；兔源一抗B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源一抗EPAC1、RAP1、GAPDH購自索萊寶科技（北京）有限公司；基質(zhì)膠購自BD（美國）公司。FlexA-200酶標儀購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司；FCK-50C光學顯微鏡、DFM-90C倒置顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司；CytoFLEX SRT流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；4200SF凝膠成像儀購自上海天能生命科學有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 取出凍存的A549細胞進行復蘇，然后放置在37 ℃、5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用含10% FBS 和1% 雙抗的RPMI-1640，24 h 后進行傳代。將A549細胞分為對照組，連翹脂素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/L，該劑量根據(jù)文獻［7］和前期預實驗結(jié)果確定），連翹脂素高劑量+PTX（特異性增加細胞內(nèi)cAMP含量）組（100 mg/L連翹脂素+5 μmol/L PTX［8］），連翹脂素高劑量+ESI-09 組（100 mg/L連翹脂素+1.5 μmol/L ESI-09［8］）。對照組常規(guī)培養(yǎng)，加等量溶劑DMSO，其余組用相應(yīng)藥物處理48 h。

1.3 CCK-8 法檢測A549 細胞增殖 A549 細胞在96 孔板（1×104 個/孔）培養(yǎng)，24 h后依據(jù)1.2 分組進行藥物干預，24、48、72 h 后分別添加10 μL CCK-8 試劑，37 ℃、5%CO2 孵育2 h。用酶標儀測定450 nm光密度（OD）值。

1.4 劃痕實驗測定A549細胞遷移 A549細胞接種于6孔板（1×106個/孔）進行貼壁培養(yǎng)。使用200 μL無菌移液器尖端在孔中進行劃痕，然后用1.2 中不同分組對應(yīng)的藥物處理劃傷的細胞48 h。用光學顯微鏡在0 h和48 h捕獲劃痕區(qū)域，并測量劃痕寬度，以0 h和48 h劃痕寬度差值與0 h劃痕寬度百分比表示劃痕愈合率。

1.5 Transwell 檢測A549細胞侵襲 用200 μL不加FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞（1×106個細胞），將其接種于Transwell上室，Transwell上室涂有40 μL基質(zhì)膠。然后，在Transwell下室添加RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL。用規(guī)定濃度的藥物在37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞48 h，清洗Transwell 插入物上表面，用4%多聚甲醛固定細胞30 min。用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下對隨機5個視野中的侵襲細胞進行計數(shù)。

1.6 流式細胞術(shù)檢測A549細胞凋亡 A549細胞按照1.2 分組方法用不同藥物處理48 h，用預冷的PBS洗滌1次，用PBS稀釋的300 μL Binding Buffer 重懸。孵育10 min 后，加入5 μL Annexin V-FITC；然后加入5 μL PI，混合均勻，室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。

1.7 ELISA檢測細胞上清液中cAMP水平 收集處理后的各組A549細胞上清液，嚴格按照cAMP ELISA試劑盒說明書步驟檢測cAMP水平。

1.8 Western blot測定EPAC1、RAP1及凋亡蛋白表達 將各組A549細胞勻漿，在低溫下用RIPA裂解緩沖液處理30 min，分離提取物中蛋白質(zhì)。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉阻斷1 h，4 ℃ 將PVDF 膜與Bax、EPAC1、RAP1、Bcl-2、GAPDH（1∶1 500）一抗過夜孵育。室溫下孵育二抗（1∶3 000）4 h。ECL顯影，用Quantity One軟件分析蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法 用GraphPad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細胞增殖水平比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09組24、48、72 h的OD450值差異均有統(tǒng)計學意義（n=5，F(xiàn) 分別為201.931、114.342、63.658，均P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組24、48、72 h的OD450值下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組24、48、72 h的OD450值增加，連翹脂素高劑量+ESI-09組OD450值下降（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組A549細胞遷移情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組劃痕愈合率（%）分別為60.23±5.11、47.64±3.81、33.52±2.75、19.67±1.37、31.16±2.42和13.58±1.08，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（n=5，F(xiàn)=158.080，P＜0.05）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組劃痕愈合率降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞劃痕愈合率升高，連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 各組A549細胞侵襲情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09組侵襲細胞數(shù)目（個）分別為87.51±6.17、72.63±5.56、54.42±4.18、35.17±2.44、49.93±3.82、23.68±1.63，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（n=5，F(xiàn)=153.139，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組侵襲細胞數(shù)目下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞侵襲細胞數(shù)目升高，連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞侵襲細胞數(shù)目降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組A549細胞凋亡情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組細胞凋亡率（%）分別為6.13±0.67、13.75±1.23、21.02±1.91、32.33±2.65、22.16±1.98和41.84±3.59，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（n=5，F(xiàn)=166.438，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組凋亡率升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組凋亡率降低，連翹脂素高劑量+ESI-09組凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組A549細胞上清液中cAMP水平比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX 組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組cAMP（nmol/L）水平分別為21.93±1.79、17.29±1.42、11.67±0.95、6.34±0.53、16.86±1.35 和6.29±0.52，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（n=5，F(xiàn)=143.527，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組cAMP水平下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞上清液中cAMP 水平升高，連翹脂素高劑量+ESI-09 組A549細胞上清中cAMP水平變化無顯著差異。2.6 各組A549 細胞cAMP/EPAC1/RAP1 通路及凋亡蛋白表達水平比較 與對照組比較，連翹脂素低、中、高劑量組A549細胞Bax表達增加，EPAC1、RAP1和Bcl-2表達減少，并且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與連翹脂素高劑量組比較，連翹脂素高劑量+PTX組A549 細胞Bax 表達減少，EPAC1、RAP1 和Bcl-2 表達增加（P＜0.05），連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞Bax表達增加，EPAC1、RAP1和Bcl-2表達減少（P＜0.05），見圖5、表1。

3 討論

肺癌可分為非小細胞癌和小細胞癌，肺癌發(fā)病率和死亡率在男性惡性腫瘤中均占首位，在女性惡性腫瘤中排第三［9］。臨床中常依據(jù)患者的病程來選擇多種方法綜合治療，但目前臨床治療方式對于晚期患者預后效果較差［10］。因此，需要更深入地了解肺癌進展的病理機制，尋找新藥物來改善患者預后。

天然化學物質(zhì)被認為是抗癌藥物的重要來源［11］。連翹脂素是從傳統(tǒng)中藥連翹中提取的一種活性成分，具有許多生物學特性［12］。研究表明，連翹苷元通過調(diào)節(jié)多種細胞行為表現(xiàn)出抗癌作用［13］。Li等［3］研究發(fā)現(xiàn)連翹苷元可顯著阻滯胰腺癌細胞侵襲、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Ding等［14］研究發(fā)現(xiàn)連翹苷元通過調(diào)節(jié)SHP-1/JAK2/STAT3信號通路抑制骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移。近年研究顯示，連翹脂素可增強結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的免疫應(yīng)答，抑制血管生成［15］；并抑制宮頸癌［16］、前列腺癌［17］細胞增殖、侵襲、遷移并誘導凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，連翹脂素低、中、高劑量組OD450值、侵襲細胞數(shù)目、劃痕愈合率及Bcl-2表達下降，凋亡率、Bax表達增加，且呈劑量依賴性，表明連翹脂素能夠誘導肺癌細胞凋亡，阻滯細胞增殖、遷移和侵襲。

cAMP對細胞的調(diào)控作用主要通過蛋白激酶控制細胞內(nèi)代謝過程，主要作用靶點有cAMP依賴蛋白激酶A（PKA）和EPAC［18］。EPAC 有EPAC1 和EPAC2 兩種形式，EPAC1 是一種100 ku 的單體蛋白，在全身組織均有分布［19］。RAP1屬于Ras小G蛋白家族［20］。作為cAMP的下游效應(yīng)分子，EPAC1參與GDP/GTP 交換，將與RAP1 結(jié)合的GDP 置換為GTP，引起RAP1激活，從而在多種生物學功能中發(fā)揮重要作用。研究表明cAMP/EPAC1/RAP1信號通路是腫瘤進展的關(guān)鍵信號通路［21］。Kumar等［22］研究發(fā)現(xiàn)EPAC1在乳腺癌細胞遷移和凋亡中發(fā)揮重要作用，通過其特異性抑制劑ESI-09阻斷EPAC1表達可促進乳腺癌細胞凋亡，抑制細胞遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量連翹脂素均能降低A549細胞中cAMP水平及EPAC1和RAP1表達，其效果隨劑量增高而增強，說明連翹脂素可能通過介導cAMP/EPAC1/RAP1通路緩解肺癌進展過程。為證實這一推測，本研究在連翹脂素高劑量作用基礎(chǔ)上分別利用可特異性增加細胞內(nèi)cAMP含量的PTX和EPAC1拮抗劑ESI-09進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組細胞凋亡率和Bax表達下降，OD450值、侵襲細胞數(shù)目、劃痕愈合率、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2表達增高；連翹脂素高劑量+ESI-09 組趨勢與之相反。由此表明，抑制cAMP/EPAC1/RAP1通路可增強連翹脂素對A549細胞惡性進展的抑制作用，激活cAMP/EPAC1/RAP1通路可減弱連翹脂素對A549細胞惡性進展的抑制作用，證實了連翹脂素可能通過下調(diào)cAMP/EPAC1/RAP1通路誘導A549細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，連翹脂素可通過抑制cAMP/EPAC1/RAP1通路抑制肺癌細胞惡性進展。這為連翹脂素在肺癌領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定參考，但信號通路對癌癥的調(diào)控極其復雜，連翹脂素改善肺癌發(fā)生發(fā)展過程的其他機制還有待深入探究。另外，本研究樣本量較少，僅用一株細胞系進行功能驗證和機制研究。未來將使用多個肺癌細胞株驗證連翹脂素的功能，并通過動物實驗進一步探討連翹脂素在體內(nèi)的作用是否與體外研究結(jié)果一致。同時，將通過與其他中藥成分進行比較，觀察連翹脂素在抗肺癌方面是否有優(yōu)勢。

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（2025-01-07收稿 2025-02-14修回）

（本文編輯 李志蕓）