太平洋牡蠣溶菌酶基因?qū)?種磺胺類抗生素的表達響應(yīng)

摘要：為了探究太平洋牡蠣溶菌酶基因（LZM 基因）對4種磺胺類抗生素的表達響應(yīng)，本研究開展了4種磺胺類抗生素對太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的暴露實驗。基于海洋環(huán)境中磺胺類抗生素的調(diào)查濃度，設(shè)置暴露濃度為5 μg·L-1和500 μg·L-1。進行牡蠣急性（48 h）、亞慢性（14 d）抗生素暴露及暴露后的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）刺激實驗，采集肝胰腺和鰓組織進行LZM 基因表達的檢測和分析。結(jié)果表明：4種抗生素對牡蠣LZM 基因表達的影響及其表現(xiàn)出的生物毒性效應(yīng)均存在差異，其中磺胺二甲基（SMT）和磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDX）與空白對照組相比對鰓組織（SMT和SDX的抑制率分別約為69%和72%）和肝胰腺（SMT和SDX的抑制率分別約為70%和74%）LZM 基因的表達具有顯著抑制作用；磺胺間甲氧嘧啶（SMM）具有更好的生物免疫適應(yīng)性，且在高濃度、長時間暴露條件下，其生物毒性效應(yīng)明顯增加。菌刺激實驗后發(fā)現(xiàn)，SMT和SDX暴露組與空白對照組相比并未降低牡蠣對弧菌的免疫能力，而SMM和磺胺甲惡唑（SMX）可能提高了牡蠣對弧菌的免疫能力；牡蠣對弧菌的免疫響應(yīng)存在組織差異性，且相較于鰓組織，肝胰腺LZM 基因的表達響應(yīng)更為明顯。研究表明，磺胺類抗生素暴露能夠引起太平洋牡蠣LZM 基因表達響應(yīng)發(fā)生變化，但磺胺類抗生素對牡蠣的生物效應(yīng)機制及對牡蠣免疫能力的影響閾值仍需進一步研究。

關(guān)鍵詞：磺胺類抗生素；太平洋牡蠣；溶菌酶；基因表達

中圖分類號：X503.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2025）03-0839-10 doi：10.11654/jaes.2024-1131

自1928年青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素的發(fā)展史已有將近一百年，其對人類的健康及生活有不可磨滅的貢獻[1]。目前抗生素大致分為磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、氯霉素類、四環(huán)素類、氨基糖苷類及大環(huán)內(nèi)酯類[2]。研究顯示，僅2000—2015年，抗生素消耗量就增加了65%規(guī)定日劑量由211億增長至348億，在沒有政策干預(yù)的情況下，2030年全球抗生素消費量預(yù)計比2015年高出200%[3]。大量抗生素的生產(chǎn)和使用，使得我國河口近岸海域中均有抗生素檢出[4–7]，主要為磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類以及大環(huán)內(nèi)酯類4 類[8]。其中磺胺類抗生素作為廣譜型藥物，迄今已有50多年的歷史，其使用方向主要為獸藥以及飼料添加劑，少部分用于人類疾病治療，消耗量巨大[9-10]。磺胺類抗生素的大量使用，導(dǎo)致其在我國水環(huán)境中被廣泛檢出。渤海灣中檢測到四環(huán)素類、氟喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，其中四環(huán)素類的濃度最高（0.6～2.0 μg·L-1）[11]。萊州灣海水養(yǎng)殖區(qū)附近的天然水域和沉積物中均檢出磺胺類抗生素，其中以磺胺甲惡唑為主，濃度在2.71～6.99 μg·L-1之間，冬季濃度明顯高于夏季，但檢出頻率低于夏季[12]。臺州灣海灣水體中抗生素的總濃度為3 126.62～26 531.48ng·L-1，大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類占主導(dǎo)地位（分別占總抗生素濃度的24.4%和74.9%）。其中，克林霉素（平均濃度1 437.59 ng·L-1）和磺胺二甲嘧啶（平均濃度9 107.88 ng·L-1）兩種抗生素濃度最高，海灣水體中的磺胺類抗生素主要來自周圍的工業(yè)活動和海產(chǎn)養(yǎng)殖[13]。北部灣夏季和冬季大范圍水域中，磺胺類抗生素中僅很低濃度的磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑被檢出[14]。海洋環(huán)境中存在的磺胺類抗生素能在海洋生物體內(nèi)富集[15]。有研究發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物對藻類具有毒性作用，能夠影響海洋生態(tài)環(huán)境食物鏈基礎(chǔ)[16]。海洋生物中的磺胺類抗生素存在傳遞現(xiàn)象，對海洋生物具有毒性效應(yīng)，磺胺類抗生素對斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)元功能，以及紫貽貝免疫系統(tǒng)均產(chǎn)生了負(fù)面影響[17-18]。海洋環(huán)境中的磺胺類抗生素潛在影響著海洋生態(tài)環(huán)境，不僅對海洋生物產(chǎn)生影響[19]，還會隨著食物鏈向人類轉(zhuǎn)移，威脅人類生命健康[20]。

牡蠣在世界上分布廣泛，是人類可利用的重要海洋生物資源之一[21]。其中太平洋牡蠣是全球最主要的養(yǎng)殖牡蠣品種，也是我國北方近岸海域最主要的養(yǎng)殖牡蠣品種，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分，深受人們喜愛[22-23]。但牡蠣在養(yǎng)殖過程中容易受到弧菌感染[24]，從而可能會導(dǎo)致個體死亡或攜帶弧菌對食用人群產(chǎn)生健康威脅。為了避免弧菌對牡蠣養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失和保障食用人群的生命健康，在養(yǎng)殖過程中會定期使用磺胺類抗生素預(yù)防和治療弧菌病，如磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶等[25]?，F(xiàn)有研究表明，磺胺類抗生素的過量使用不僅使其在牡蠣體內(nèi)富集[18]，更會降低牡蠣對弧菌的免疫能力，使其易受弧菌感染[26]，進而增加了人們食用太平洋牡蠣的風(fēng)險。因此需要對太平洋牡蠣在磺胺類抗生素暴露下的免疫響應(yīng)和暴露后牡蠣對弧菌的免疫能力進行研究。另外，太平洋牡蠣作為一種理想的海洋環(huán)境監(jiān)測生物，在受到環(huán)境、病菌威脅時，其抗氧化系統(tǒng)，包括酶和非酶參數(shù)，會因應(yīng)激類型的不同而發(fā)生不同的變化[27]。太平洋牡蠣的免疫分為特異性免疫和非特異免疫，非特異免疫又稱先天性免疫，是免疫的第一道防線。溶菌酶是非特異性防御中的重要防御分子，是抵御各種微生物感染的免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，其活性首次被Mori等[28]認(rèn)定為殺菌素。有研究表明溶菌酶在抵御革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌感染過程中發(fā)揮著重要作用[29]。生物體受到真菌或細(xì)菌感染時會激活Toll 通路，使生物生成和釋放溶菌酶[30]，如貽貝受到革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌感染后，體內(nèi)Toll通路的大部分基因被誘導(dǎo)表達，以應(yīng)對細(xì)菌刺激[31]。Imd信號通路是參與體液抗菌免疫的另一方式，能夠控制大部分抗菌肽表達，當(dāng)生物受到病原感染時會激活該通路，釋放抗菌肽[32]。免疫刺激、細(xì)菌感染或其他外部壓力可能會刺激Toll通路和Imd通路調(diào)控LZM 基因表達，進而影響溶菌酶的產(chǎn)生與活性。有研究發(fā)現(xiàn)，鹽度升高會導(dǎo)致對蝦鰓和肝胰腺組織中LZM 基因表達顯著升高[33]，抗生素能夠使刺參幼體中LZM 基因表達顯著下降[34]，LZM 基因表達的上調(diào)或下降被認(rèn)為是生物對氧化應(yīng)激和氧化損傷的一種響應(yīng)[35]。因此分析太平洋牡蠣體內(nèi)的LZM 基因表達水平，能夠探究牡蠣對環(huán)境變化的免疫響應(yīng)。

綜上，本研究選取太平洋牡蠣為目標(biāo)生物，開展4種磺胺類抗生素暴露實驗，并進行抗生素暴露后的副溶血性弧菌急性刺激實驗。通過測試太平洋牡蠣肝胰腺和鰓組織的LZM 基因表達水平，探究磺胺類抗生素暴露對太平洋牡蠣免疫產(chǎn)生的影響，為更好地了解抗生素輸入對海洋生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害、抗生素誘導(dǎo)對水生生物有害影響的相關(guān)機制，以及篩選抗生素生態(tài)毒性評價的有效生物標(biāo)志物提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

實驗用太平洋牡蠣采自山東煙臺萊山區(qū)附近海岸，實驗室馴養(yǎng)周期為1周。馴養(yǎng)完成后，選擇大小相近[殼長（5.5±0.6）cm，殼寬（3.6±0.8）cm，殼厚（1.5±0.4）cm]的牡蠣以每組30只隨機分為10組，設(shè)置空白對照組（Control）、溶劑對照組（DMSO，二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)0.01%），以及5 μg·L-1（Low）和500 μg·L-1（High）磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）暴露組、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMX）暴露組、磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SMT）暴露組和磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxine，SDX）暴露組，所用抗生素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。根據(jù)渤海灣、萊州灣、臺州灣、北部灣海域（2.71～9.11 μg·L-1）[11–14]和醫(yī)院污水（0.034～1 340 μg·L-1）[18]中的磺胺類抗生素濃度，選擇5 μg·L-1和500 μg·L-1的抗生素濃度代表水生環(huán)境中磺胺類抗生素的低、高濃度，進行太平洋牡蠣的暴露實驗。暴露實驗過程中，海水的平均鹽度、溫度、pH 和溶解氧分別保持在（24.4±0.3）‰、（6.6±0.3）℃、（8.0±0.2）和（8.2±0.2）mg·L-1，并保證充氣泵不斷的充氣，海水每天更換，并在更換前3 h給牡蠣喂食小球藻。每天更換海水后，進行DMSO 和抗生素暴露，14 d停止暴露后，對太平洋牡蠣進行副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）體內(nèi)注射（1×106 CFU·mL-1，0.1 mL），執(zhí)行急性菌刺激實驗。在急性暴露（48 h）、亞慢性暴露（14 d）以及弧菌刺激（Bacterial stimula?tion，BS）24 h后，分別從每組中隨機取出5只太平洋牡蠣采集肝胰腺和鰓組織進行LZM 基因表達檢測分析，樣品經(jīng)處理后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

為了研究4種磺胺類抗生素對太平洋牡蠣鰓和肝胰腺中LZM 基因表達水平的影響，選擇LZM 基因進行定量研究，GAPDH 基因為使用的內(nèi)參基因，兩種基因的引物序列見表1。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量方法參照文獻[36-37]。使用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒（DP431），參照說明書對太平洋牡蠣組織全RNA進行提取。提取成功后取RNA樣品用1×TE Buffer稀釋樣品100倍或適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，測定樣品在260 nm和280 nm處的吸收值（分別記作OD260和OD280），確定RNA的濃度（OD260與稀釋倍數(shù)的乘積，再乘以0.04 μg·μL-1），比色皿光徑1 cm，OD260/280 在1.8～2.1 之間。將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為了保證樣品的可靠性，進行Real-time PCR預(yù)實驗，之后再進行Real-time PCR正式實驗，反應(yīng)體系與預(yù)實驗類似。PCR完成后將測得的數(shù)據(jù)導(dǎo)出，定量結(jié)果分析采用2-ΔΔCT法。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果分析使用SPSS 27.0 軟件，繪圖使用MATLAB R2017a 軟件。對結(jié)果進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）結(jié)合Dunnett′s 檢驗比較各暴露組、空白對照組及溶劑對照組間的差異顯著性，運用t-text檢驗分析低、高濃度組48 h、14 d與菌刺激后的差異顯著性。對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney U檢驗進行分析。太平洋牡蠣LZM基因?qū)?種磺胺類抗生素的表達響應(yīng)采用歸一化處理進行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織中LZM 基因表達水平

2.1.1 鰓LZM 基因表達水平

在4種磺胺類抗生素暴露及菌刺激條件下，鰓組織LZM 基因表達水平如圖1所示。急性、亞慢性暴露和菌刺激后，SMM組LZM 基因表達量在0.47～1.61之間，除菌刺激后高濃度暴露組（0.47±0.15）外各濃度處理組均高于空白對照組（0.84～1.08）（Pgt;0.05）。SMX 組各濃度處理LZM 基因表達量在0.52～0.80 之間，均低于空白對照組（Pgt;0.05）。SMT和SDX組各濃度處理LZM 基因表達量分別在0.24～0.36 之間和0.17～0.38之間，在48 h和14 d時與空白對照組相比受到顯著抑制（Plt;0.05），抑制率分別約為69% 和72%。低濃度SMT 急性暴露后LZM 基因表達水平（0.37±0.07）顯著高于亞慢性暴露后LZM 基因表達水平（0.25±0.04）（Plt;0.05），高濃度SDX 急性暴露后LZM 基因表達水平（0.38±0.18）顯著高于亞慢性暴露后LZM 基因表達水平（0.17±0.03）（Plt;0.05）。

2.1.2 肝胰腺LZM 基因表達水平

在4種磺胺類抗生素暴露及菌刺激條件下，肝胰腺組織LZM 基因表達水平如圖2所示。急性、亞慢性暴露和菌刺激后，SMM 組LZM 基因表達量在0.19～1.44之間，除菌刺激后高濃度組（0.19±0.04）外各濃度處理組均高于空白對照組（0.34～1.09）（Pgt;0.05）。SMX 組各濃度處理LZM 基因表達量在0.23～0.77 之間，均低于空白對照組（Pgt;0.05）。SMT和SDX組各濃度處理LZM 基因表達量分別在0.11～0.34 之間和0.10～0.35之間，在48 h和14 d時與空白對照組相比受到顯著抑制（Plt;0.05），抑制率分別約為70% 和74%。低濃度SMT 急性暴露后LZM 基因表達水平（0.35±0.05）顯著高于亞慢性暴露后LZM 基因表達水平（0.26±0.03）（Plt;0.05）。菌刺激后，對照組和SMT、SDX暴露組的LZM 基因表達均被抑制（Plt;0.05），顯著低于亞慢性暴露的表達水平。

2.2 4 種磺胺類抗生素實驗組LZM 基因表達水平的比較

4種磺胺類抗生素急性、亞慢性暴露實驗中，LZM基因表達水平的比較分析如圖3和圖4所示。急性暴露后，SMM實驗組鰓組織LZM 基因表達水平顯著高于其他3種抗生素實驗組，實驗組表達水平由高到低依次為SMM、SMX、SDX 和SMT。亞慢性暴露后，鰓組織LZM 基因表達情況與急性暴露后表現(xiàn)相似，但高濃度暴露實驗組表達水平間不存在顯著差異。肝胰腺組織LZM 基因表達情況與鰓組織表現(xiàn)類似。

菌刺激后，低濃度暴露條件下，SMM實驗組鰓組織LZM 基因表達水平顯著高于其他3種抗生素實驗組，表達水平由高到低依次為SMM、SMX、SMT、SDX；肝胰腺組織LZM 基因表達變化情況與鰓組織表現(xiàn)類似。高濃度暴露條件下，SMX 實驗組鰓組織LZM 基因表達水平顯著高于SMT 和SDX 實驗組；不同抗生素實驗組肝胰腺組織LZM 基因表達水平由高到低依次為SMX、SMM、SDX 和SMT，各實驗組間未表現(xiàn)出顯著差異。

3 討論

太平洋牡蠣受到環(huán)境威脅時，參與免疫反應(yīng)和能量代謝的基因表達水平會發(fā)生變化[38]。本研究中，太平洋牡蠣LZM 基因?qū)?種磺胺類抗生素暴露表現(xiàn)出了不同的表達響應(yīng)。其中，SMT、SDX抗生素暴露能顯著抑制肝胰腺和鰓組織中LZM 基因的表達。有研究表明抗菌藥物進入海洋生物體中，可能對機體造成一定的脅迫，抑制溶菌酶的合成或分泌，或作用于溶菌酶的活性中心，使其活性降低[39]。Zhao等[34]在3種抗生素（紅霉素、四環(huán)素和諾氟沙星）對刺參幼體影響的研究中發(fā)現(xiàn)，喂食抗生素15 d后，幼體LZM 基因表達水平顯著下降，其認(rèn)為抗生素會造成生物體免疫功能紊亂。雙殼貝類腸道中有豐富的微生物群落，這些腸道微生物和宿主之間存在長期有益（或至少是無害）的代謝適應(yīng)[37]。但貝類腸道微生物常受到外部干擾，宿主及微生物的代謝平衡被打破，因此兩者之間的代謝適應(yīng)并不穩(wěn)定[40]。在氟苯尼考暴露環(huán)境中，斑馬魚腸道中微生物群的多樣性和均勻性顯著下降[41]，低鹽度條件下抗生素暴露對南美白對蝦的腸道微生物群落功能產(chǎn)生負(fù)面影響，引起了免疫響應(yīng)[42]，推斷抗生素暴露改變了牡蠣腸道中的微生物群，從而影響了其代謝作用。于佳佳[43]也在研究中提出文蛤的代謝功能與免疫防御息息相關(guān)。對SMT、SDX的生物富集研究發(fā)現(xiàn)，其在中國對蝦和牙鲆體內(nèi)廣泛分布，且不易排泄，消除半衰期均大于24 h，屬于長效磺胺[44-45]。綜上，本研究初步推斷SMT、SDX 進入牡蠣體內(nèi)后最先影響的是其代謝功能，進而抑制了LZM基因表達。與SMT、SDX不同，本研究中高、低濃度的SMM和SMX對牡蠣LZM 基因表達沒有顯著影響?？股卮x動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，SMM 在海洋生物體中的代謝速度高于本研究中的其余3 種抗生素，SMX 次之[44–47]，推斷是較高的代謝速度降低了SMM 和SMX的生物毒性。抗生素生物效應(yīng)機制研究發(fā)現(xiàn)，磺胺類抗生素大多容易與組織中的乙酰輔酶A結(jié)合生成乙酰化產(chǎn)物，進而減弱其生物效應(yīng)，但暴露在SMX 和SMT中的明蝦組織中并未發(fā)現(xiàn)乙酰化產(chǎn)物[44，46]，認(rèn)為雖然磺胺類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，但其生物效應(yīng)機制仍存在差異。

對比分析4種抗生素暴露后的牡蠣LZM 基因表達水平發(fā)現(xiàn)，除SMM 外，SMT、SDX 和SMX 實驗組的基因表達水平?jīng)]有出現(xiàn)組間顯著差異；低濃度SMM組基因表達水平顯著高于其他抗生素，亞慢性高濃度暴露時未呈現(xiàn)組間顯著差異；但高濃度SMM組基因表達水平低于低濃度SMM組，且隨著暴露時間的推移，其基因表達水平出現(xiàn)明顯的先上升再下降的現(xiàn)象，這與孫銘等[26]對中國明對蝦研究的結(jié)果類似，推測持續(xù)投喂免疫增強劑，可能會導(dǎo)致牡蠣出現(xiàn)“免疫疲勞”現(xiàn)象，從而降低其免疫能力。另外，張曉晗等[48]研究發(fā)現(xiàn)，SMM對小球藻生長表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，SMM 濃度小于5 μg·mL-1 時促進藻類生長，大于5 μg·mL-1時抑制藻類生長；Ming等[49]發(fā)現(xiàn)對尼羅口孵魚進行低劑量（200 mg·kg-1）SMM混飼并不會影響其體內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)和致病菌數(shù)量，在高劑量（300 mg·kg-1）處理下，微生物群落豐富度隨著暴露時間的推移而降低。推斷較之浮游植物，底棲動物太平洋牡蠣對SMM具有更好的生物免疫適應(yīng)性，但在高濃度、長時間暴露條件下，其生物毒性效應(yīng)明顯增加。

針對牡蠣體內(nèi)磺胺類抗生素過量富集會降低其對弧菌的免疫能力這一研究發(fā)現(xiàn)[18，26]，本研究在抗生素暴露結(jié)束后，進行了牡蠣的急性弧菌刺激實驗，結(jié)果表明，菌刺激后對照組、SMT及SDX組牡蠣肝胰腺LZM 基因表達均受到了顯著抑制，且各組表達水平無顯著差異；SMM、SMX組基因表達未出現(xiàn)顯著變化。文蛤菌刺激實驗發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌感染能夠影響文蛤的免疫系統(tǒng)和代謝過程，抑制其SOD、LZM基因表達[43]，由此推斷本次研究的SMT 和SDX 暴露并未降低牡蠣對弧菌的免疫能力。而SMM 和SMX可能提高了牡蠣對弧菌的免疫能力，但其對牡蠣免疫能力的影響閾值仍需進一步研究。另外，本次研究中所有實驗組牡蠣鰓組織LZM 基因表達均未受到顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，泥蚶受到哈維氏弧菌感染后，各組織弧菌載量不同，肝胰腺中弧菌載量遠(yuǎn)高于鰓[50]，由此說明牡蠣對弧菌的免疫響應(yīng)存在組織差異性，且相較于鰓組織，肝胰腺LZM 基因表達響應(yīng)更為明顯。

4 結(jié)論

（1）4種磺胺類抗生素對太平洋牡蠣LZM 基因表達的影響及其表現(xiàn)出的生物毒性效應(yīng)均存在差異。磺胺二甲基（SMT）和磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDX）對牡蠣鰓（SMT和SDX抑制率分別約為69%和72%）和肝胰腺（SMT 和SDX 抑制率分別約為70% 和74%）中LZM 基因表達具有顯著抑制作用；磺胺間甲氧嘧啶（SMM）和磺胺甲惡唑（SMX）組LZM 基因表達未出現(xiàn)顯著性變化；SMM具有更好的生物免疫適應(yīng)性，且在高濃度、長時間暴露條件下，其生物毒性效應(yīng)明顯增加。

（2）SMT 和SDX 暴露并未降低牡蠣對弧菌的免疫能力，而SMM和SMX可能提高了牡蠣對弧菌的免疫能力。

（3）牡蠣對弧菌的免疫響應(yīng)存在組織差異性，且相較于鰓組織，肝胰腺中的LZM 基因表達響應(yīng)更為明顯。

（4）對于磺胺類抗生素對牡蠣的生物效應(yīng)機制及對牡蠣免疫能力的影響閾值仍需進一步研究。

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（責(zé)任編輯：李丹）