自然土壤中6:2氯代多氟烷基醚磺酸對蚯蚓的毒性效應(yīng)

摘要：為探討6：2氯代多氟烷基醚磺酸（6：2 Cl-PFESA）對蚯蚓的毒性效應(yīng)及其致毒分子機制，本研究采用自然土壤法，研究了不同劑量（0.1、1、10 mg·kg-1）6：2 Cl-PFESA暴露對蚯蚓的28 d毒性效應(yīng)，并聯(lián)合酶學(xué)、擴增子測序和代謝組學(xué)技術(shù)探究其致毒分子機制。結(jié)果表明，暴露28 d后6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)的生物富集因子（BAF28d）為2.43～3.81，僅在高劑量（10 mg·kg-1）暴露下蚯蚓存活率顯著降低。在亞個體水平，不同劑量6：2 Cl-PFESA暴露均誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生氧化應(yīng)激，其中過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）比超氧化物歧化酶（SOD）對6：2 Cl-PFESA的反應(yīng)更為敏感。此外，1、10 mg·kg-1 暴露導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化損傷和神經(jīng)毒性。微生物多樣性分析表明，10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露會降低蚯蚓體內(nèi)益生菌屬（Lactobacillus）的相對豐度，增加致病菌門（Verrucomicrobiota）的相對豐度。代謝組學(xué)分析表明，10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)代謝紊亂，使氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物等關(guān)鍵代謝物豐度顯著上調(diào)，破壞了甘油磷脂代謝等關(guān)鍵代謝通路，損害了蚯蚓正常的生理功能。研究表明，經(jīng)過28 d的暴露，6：2 Cl-PFESA可在蚯蚓體內(nèi)發(fā)生生物富集，土壤較低劑量（0.1 mg·kg-1）6：2 Cl-PFESA污染即可引發(fā)蚯蚓體內(nèi)氧化應(yīng)激，較高劑量（1、10 mg·kg-1）6：2 Cl-PFESA暴露下蚯蚓體內(nèi)發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化損傷和神經(jīng)毒性，10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露可導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)菌群失調(diào)和代謝功能紊亂。

關(guān)鍵詞：6：2 氯代多氟烷基醚磺酸；自然土壤；蚯蚓；毒性；酶學(xué)；微生物多樣性；代謝組學(xué)

中圖分類號：X171.5 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2025）03-0815-14 doi：10.11654/jaes.2024-1164

全氟及多氟化合物（Per- and polyfluoroalkyl sub?stances，簡稱PFASs）是一類碳骨架上全部或部分氫原子被氟原子取代的人工合成有機化合物[1]。由于優(yōu)良的疏水疏油性、高表面活性、耐高溫和耐腐蝕等特性，PFASs被廣泛應(yīng)用于地毯、包裝、紡織、皮革、滅火泡沫、洗發(fā)香波、打磨地板、電鍍等工業(yè)和民用領(lǐng)域[2]。PFASs 分子結(jié)構(gòu)中的碳氟鍵具有極高的穩(wěn)定性，使其難以水解、光解以及生物降解，從而表現(xiàn)出顯著的環(huán)境持久性[3]。全氟辛烷磺酸（PFOS）是生產(chǎn)量最大的PFASs之一，因其具有環(huán)境持久性、高生物累積性以及對生物和人類健康的潛在危害而被高度關(guān)注[4-5]。2009 年，PFOS 及其鹽類被列入國際《斯德哥爾摩公約》，并受到嚴格管控[6]。6：2氯代多氟烷基醚磺酸（6：2 Cl-PFESA）作為一種重要的PFOS新型替代品，早在20世紀70年代便開始在我國金屬電鍍行業(yè)中作為鉻霧抑制劑使用，特別是在PFOS全面淘汰后，6：2 Cl-PFESA 得到了更為廣泛的關(guān)注與應(yīng)用[7]。與PFOS相比，6：2 Cl-PFESA 分子結(jié)構(gòu)中的末端氯取代基和插入碳鏈中的醚鍵使其具有更大的分子尺寸和更高的疏水性，因此6：2 Cl-PFESA 在生物體內(nèi)通常表現(xiàn)出更強的生物累積能力，甚至可能帶來更大的潛在健康風(fēng)險[8-9]。已有毒理學(xué)研究表明，6：2 Cl-PFESA可能會引起更強的肝毒性，并增加致癌風(fēng)險[10-11]。

土壤是人類賴以生存的基礎(chǔ)，在生物地球化學(xué)循環(huán)和糧食生產(chǎn)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近年來，6：2 Cl-PFESA 在我國各種土壤環(huán)境中被廣泛檢出。有研究表明，6：2 Cl-PFESA在廣東某電鍍工業(yè)園區(qū)內(nèi)部土壤和山東典型氟化工業(yè)園區(qū)周邊土壤中的含量較高，分別可達1.65～52.58 ng·g-1[12] 和1.54～43.10 ng·g-1 [13]，而在我國31個省份的農(nóng)田表層土壤、遠離污染源的居民區(qū)土壤和汾渭平原農(nóng)業(yè)土壤中的含量較低，分別為nd～0.54[14]、nd～1.117 ng·g-1 [15] 和0.009～1.119 ng·g-1 [16]。微生物是土壤環(huán)境的重要組成部分，對維持正常的土壤功能和生產(chǎn)力至關(guān)重要。PFASs可以通過改變土壤細菌群落結(jié)構(gòu)、抑制土壤酶活性和破壞土壤細菌生長從而破壞正常的土壤功能[17-18]。土壤中的6：2 Cl-PFESA 能被動植物吸收并在體內(nèi)累積，進而沿食物鏈進入人體，危害人類健康[19-20]。因此，6：2 Cl-PFESA可能會破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，有必要對受其污染土壤的生態(tài)風(fēng)險開展進一步研究。

蚯蚓屬于環(huán)節(jié)動物門，是生物量最大的土壤無脊椎動物，對土壤形成、土壤結(jié)構(gòu)和肥力保持、環(huán)境保護及陸地食物鏈具有重要的生態(tài)作用。此外，蚯蚓在土壤中廣泛分布，繁殖能力強，對土壤污染敏感，因此被廣泛用作土壤污染的指示生物，是土壤生態(tài)毒理學(xué)測試中的常用受試物種[21]。目前僅有的一項研究表明，蚯蚓暴露于228 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA污染土壤14 d后會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量的顯著增加，且轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)的研究結(jié)果表明蛋白質(zhì)消化和氨基酸吸收、脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)的破壞是6：2 Cl-PFESA誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生毒性的主要機制[22]。然而，該研究設(shè)置的暴露劑量單一且遠高于環(huán)境相關(guān)含量，未考慮不同劑量下的毒性響應(yīng)差異?？偟膩碚f，關(guān)于6：2 Cl-PFESA 對蚯蚓生態(tài)毒性的研究仍非常匱乏，特別是低劑量長期暴露下的毒性研究處于空白。因此，本研究探究了低、中、高3個劑量6：2 Cl-PFESA暴露對蚯蚓的亞急性毒性效應(yīng)及其致毒分子機制，并首次深入探究了該污染物對蚯蚓體內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)的影響，全面揭示了6：2 Cl-PFESA對蚯蚓的毒性效應(yīng)，以期為土壤6：2 Cl-PFESA 污染的生態(tài)風(fēng)險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

供試土壤采自天津市武清區(qū)農(nóng)田（39.34°N，116.97°E），土壤類型為潮土，粒徑組成為黏粒8.15%、粉粒40.81%、砂粒51.05%，pH值為7.37，有機質(zhì)含量為22.2 g·kg-1，堿解氮含量為88.9 mg·kg-1。經(jīng)檢測無6：2 Cl-PFESA背景污染。蚯蚓（Eisenia fetida）購買于天津市靜海區(qū)蚯蚓養(yǎng)殖廠，實驗前將蚯蚓放置于供試土壤中馴化兩周進行預(yù)培養(yǎng)，以適應(yīng)供試土壤環(huán)境。商業(yè)產(chǎn)品6：2 Cl-PFESA（gt;96%）從上海麥昆化工有限公司購買。HPLC 級甲醇（MeOH，gt;99%）購自FisherScientific（加拿大），實驗用水為超純水（Milli-Q水）。

1.2 土壤暴露實驗

土壤暴露實驗設(shè)置4個處理組：空白對照組（CK）和低劑量（0.1 mg·kg-1）、中劑量（1 mg·kg-1）、高劑量（10 mg·kg-1）暴露組，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。其中空白對照組土壤基質(zhì)為未加標的供試土壤，低劑量用于模擬我國典型場地周邊農(nóng)田土壤中6：2 Cl-PFESA的環(huán)境相關(guān)含量，在此基礎(chǔ)上以10倍間隔設(shè)置中劑量和高劑量處理組，以探究不同污染暴露水平對蚯蚓的毒性影響。

以甲醇為溶劑制備相應(yīng)濃度的6：2 Cl-PFESA溶液，將200 μL染毒溶液先添加到50 g供試土壤中，其中對照組添加與暴露組相同量的甲醇，待溶劑完全揮發(fā)混勻后再將剩余的550 g土逐步加入并混合均勻，最后分裝到3個燒杯中（每個燒杯200 g），用超純水調(diào)節(jié)土壤含水量為最大田間持水量的60%。參照OECD[23]和ISO[24]中的要求，選擇濕質(zhì)量在300～600mg、有明顯生殖環(huán)帶的健康成蚓清腸24 h后放入實驗土壤中，每個燒杯10條蚯蚓。用扎有小孔的錫紙包裹燒杯，將燒杯置于人工氣候培養(yǎng)箱中，在20 ℃、75% 濕度的條件下培養(yǎng)28 d，且在暴露期間每隔2 d加水一次以保持土壤含水量穩(wěn)定。28 d實驗結(jié)束后檢查蚯蚓死亡情況，將對照組和暴露組中存活的蚯蚓清洗干凈并清腸，最后用液氮速凍并保存在-80 ℃冰箱中用于后續(xù)生化分析，另外對高劑量暴露組中的存活蚯蚓進行微生物多樣性和代謝組學(xué)測定。

1.3 6：2 Cl-PFESA的提取和測定方法

1.3.1 土壤中6：2 Cl-PFESA的提取

稱取1.00 g 土壤樣品裝入50 mL 聚丙烯離心管中，再加入8 mL 甲醇，在2 500 r·min-1 下渦旋振蕩5min，超聲20 min，在8 000 r·min-1下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管中。再加入8 mL 甲醇，重復(fù)提取1次，最終將2次提取液合并約15 mL，氮吹至5 mL。提取液過Clearnert Pesticarb-SPE 柱（500mg，6 mL，博納艾杰爾）進行凈化。首先用5 mL甲醇以每秒1滴的流速活化SPE柱，然后將5 mL樣品提取液通過活化后的SPE柱，收集流出液，再用5 mL甲醇進行洗脫，合并兩次流出液約10 mL，氮吹至1 mL，過0.2 μm尼龍濾膜，置于進樣小瓶中待測。

1.3.2 蚯蚓體內(nèi)6：2 Cl-PFESA的提取

稱取約50 mg（干質(zhì)量）蚯蚓樣品裝入50 mL聚丙烯離心管，加入5 mL 10 mmol·L-1 NaOH甲醇溶液，在2 500 r·min-1下渦旋振蕩10 min，超聲20 min，然后在3 500 r·min-1下離心15 min，收集上層萃取清液于新的50 mL離心管中，重復(fù)提取3次后，合并提取液，用氮氣吹至2 mL。將濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL水中稀釋，用2%乙酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4。以每秒1滴的速度將10 mL 0.1%氨水甲醇、10 mL甲醇及10 mL水先后通過PWAX-SPE 柱對其進行活化，將水稀釋后的樣品以每秒1滴的流速通過活化后的SPE柱，然后分別用10mL 2% 的乙酸溶液和10 mL 水沖洗SPE 柱以去除雜質(zhì)，目標物分別用6 mL甲醇和6 mL 0.1%氨水甲醇進行洗脫，合并兩部分洗脫液并用氮氣吹至1 mL，在12 000r·min-1下離心30 min，上清液定容至1 mL，過0.2 μm尼龍濾膜后置于進樣小瓶中待測。

1.3.3 6：2 Cl-PFESA的測定

使用超高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀（SCIEXQTRAP 4500，美國）測定6：2 Cl-PFESA 含量，所使用的色譜柱為Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，美國），流動相A為0.1%乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇，流速為0.30 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。使用電噴霧離子源（ESI-）對分析物進行電離，并用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行分析。ESI 條件如下：離子源GS1和GS2的氣壓分別為345 kPa 和310 kPa，氣簾氣壓力為138kPa，碰撞氣為Medium（中級），離子源溫度為500 ℃，離子噴霧電壓為-4 000 V，碰撞室入口和出口電壓均為-10 V。

1.3.4 質(zhì)量控制

方法檢測限（MDLs）確定為信噪比為3的6：2 Cl-PFESA 含量，約為0.009 ng·g-1。以濃度為0.1、1.0、10、50、100、150、200 ng·mL-1的7個標準溶液建立相應(yīng)的標準曲線（相關(guān)系數(shù)≥0.99），用于定量6：2 Cl-PFESA。在測樣的同時設(shè)置加標回收率實驗組和程序空白。結(jié)果表明，土壤和蚯蚓體內(nèi)6：2 Cl-PFESA的加標回收率分別為95%和92%，相對標準偏差均為6%。在任何程序空白（n=3）中均未檢出6：2 Cl-PFESA，表明潛在背景污染可忽略不計。

1.4 蚯蚓組織生化指標測定

將待測蚯蚓用手持勻漿機（F6/10，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）在冰浴條件下充分研磨，按質(zhì)量與提取液體積比為1∶9 向蚯蚓勻漿中加入提取液，于12 000 r·min-1、4 ℃下離心15 min，保留上清液用于生化指標測定。蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT、POD、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性和MDA含量均按試劑盒方法進行測定，所用試劑盒均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.5 蚯蚓體內(nèi)微生物群落分析

1.5.1 樣品DNA抽提

用DNA 提取試劑盒對對照組和10 mg·kg-1 6：2Cl-PFESA暴露組中仍存活的整條蚯蚓體內(nèi)微生物群落總基因組DNA進行抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA 的質(zhì)量，使用NanoDrop2000（美國Thermo Scientific公司）測定DNA濃度和純度。

1.5.2 PCR擴增

使用攜帶Barcode 序列的338F 和806R 引物對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。

1.5.3 PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收純化試劑盒（PCR Clean-Up Kit，中國逾華）純化回收產(chǎn)物，并用Qubit 4.0（Thermo Fisher Scientific，美國）進行檢測定量。

1.5.4 文庫構(gòu)建與測序

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit對純化后的PCR產(chǎn)物進行建庫，利用Illumina Nextseq2000平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.6 代謝組學(xué)測定

1.6.1 樣品提取

取50 mg蚯蚓樣本于2 mL離心管中，加入一顆直徑6 mm的研磨珠和400 μL含20 μg·mL-1內(nèi)標（L-2-氯苯丙氨酸）的甲醇水提取液（甲醇與水的體積比為4∶1）。樣本溶液用冷凍組織研磨儀研磨6 min（-10 ℃，50 Hz），然后低溫超聲提取30 min（5 ℃，40 kHz）。最后將樣品于-20 ℃下靜置30 min，離心15 min（4 ℃，13 000 g），移取上清液至帶內(nèi)插管的進樣小瓶中上機分析。

1.6.2 LC-MS分析

采用賽默飛公司的超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive HF-X測定（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.6.3 物質(zhì)鑒定及分析

測定完成后，將LC-MS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，美國）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到保留時間、質(zhì)荷比和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣，將MS和MSMS質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www.hmdb.ca/）和Metlin（https：//metlin.scripps.edu/）及美吉自建庫進行匹配，得到代謝物信息。將搜庫后的數(shù)據(jù)矩陣上傳到美吉云平臺（cloud.major?bio.com）進行后續(xù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)以下公式計算生物富集因子（BAF）：

使用Excel 2021 計算所有處理的平均值和標準差（SD），并進行單因素方差分析（ANOVA，Plt;0.05）以評估各處理組之間的顯著性差異。采用Tukey′s 多重比較進行組間兩兩比較。使用Origin 2021軟件對統(tǒng)計結(jié)果進行圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 6：2 Cl-PFESA對蚯蚓生存與生長的影響

在蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域，蚯蚓生物量和存活率常被作為表征毒性程度大小的個體指標。本研究探究了6：2 Cl-PFESA暴露對蚯蚓體質(zhì)量和存活率的影響。結(jié)果表明，6：2 Cl-PFESA暴露28 d后，所有處理組蚯蚓體質(zhì)量均有所降低，但暴露組與對照組相比體質(zhì)量降低率均無顯著差異（圖1a）。與對照組相比，低、中劑量暴露組蚯蚓存活率無顯著變化，但高劑量暴露下蚯蚓存活率顯著降低（Plt;0.05，圖1b）。這與Ge等[22]發(fā)現(xiàn)暴露于228 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA污染土壤14 d后未觀察到任何蚯蚓死亡現(xiàn)象相矛盾。上述研究與本研究中所采用的供試土壤均為采自天津市的農(nóng)田土壤，土壤理化性質(zhì)相近，故蚯蚓死亡率的差異與供試土壤的關(guān)系可能不大，產(chǎn)生這種差異的原因很可能與不同批次蚯蚓的個體差異和暴露持續(xù)時間的不同有關(guān)。本研究中設(shè)置的暴露周期為28 d，更長的暴露時間增加了毒性表現(xiàn)的機會。

2.2 6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)的富集狀況

28 d暴露實驗結(jié)束后6：2 Cl-PFESA在土壤中的含量以及在蚯蚓體內(nèi)的富集量如圖1c和圖1d所示。結(jié)果表明，暴露結(jié)束后低、中、高劑量暴露組土壤中6：2 Cl-PFESA 的含量分別為0.07、0.75、7.64 mg·kg-1（圖1c），6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)的富集量分別可達0.17、2.86、27.11 mg·kg-1（圖1d）。隨土壤暴露劑量的增加，6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)的富集量逐漸升高，顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。此外，通過計算生物富集因子進一步量化了6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)的富集能力。本研究中0.1、1、10 mg·kg-1 3個暴露組的生物富集因子分別為2.43、3.81、3.55，因子值均大于1，表明6：2 Cl-PFESA在蚯蚓體內(nèi)具有顯著的生物富集效應(yīng)。

2.3 6：2 Cl-PFESA對蚯蚓的氧化應(yīng)激效應(yīng)

蚯蚓體內(nèi)的氧化應(yīng)激是由于過量活性氧（ROS）產(chǎn)生并超出其自身抗氧化系統(tǒng)的防御能力而引發(fā)的毒性效應(yīng)[25]?？寡趸到y(tǒng)是保護蚯蚓機體免受氧化損傷的屏障，包括抗氧化酶和非酶物質(zhì)?？寡趸钢饕⊿OD、POD、CAT、GST。6：2 Cl-PFESA 污染脅迫28 d后蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性的變化情況如圖2a至圖2d所示。

SOD是一類能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，從而減輕超氧陰離子對生命體危害的金屬類酶。由于能有效減輕超氧自由基及其形成的ROS 對細胞的氧化損傷，SOD 被稱為細胞內(nèi)的第一解毒酶，是抗氧化能力最強的酶[26]。與對照組相比，0.1 mg·kg-1 和1 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA 暴露28 d后蚯蚓體內(nèi)SOD活性未表現(xiàn)出顯著變化（圖2a）。然而，在10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露下SOD活性顯著升高（Plt;0.05）。

CAT通過將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O并進一步氧化為O2來保護細胞免受氧化損傷，在生物防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。POD作為一類催化過氧化物氧化的酶，也具有清除H2O2的作用[27]。CAT與POD之間存在協(xié)同作用，共同清除SOD催化歧化反應(yīng)生成的H2O2，從而有效減輕H2O2對機體的毒害。6：2 Cl-PFESA暴露28 d后，0.1 mg·kg-1暴露組蚯蚓體內(nèi)CAT活性顯著升高（Plt;0.05），之后隨暴露劑量升高呈降低趨勢（圖2b）。1 mg·kg-1 暴露組蚯蚓體內(nèi)POD 活性顯著高于對照、0.1 mg·kg-1和10 mg·kg-1組（Plt;0.05），整體上也隨暴露劑量升高呈先上升后下降的趨勢（圖2c）。以往的研究表明，抗氧化系統(tǒng)在低脅迫水平下被激活，而在高脅迫水平下被抑制[28]。因此，本研究中CAT和POD活性均隨暴露劑量升高呈先增加后降低的趨勢，可能是由于在較低暴露劑量下被激活，而隨暴露劑量的升高，H2O2 的過度積累超出了CAT 和POD 的清除能力，進而損害了這兩種酶的合成或結(jié)構(gòu)[29]。但SOD活性在最高暴露劑量時才表現(xiàn)為顯著升高，對暴露劑量的響應(yīng)滯后于CAT、POD。這可能是因為超氧陰離子的半衰期較短[30]，在較低水平脅迫下超氧陰離子的產(chǎn)生未超過蚯蚓自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力，被迅速轉(zhuǎn)化為H2O2。而H2O2 的半衰期相對較長，穩(wěn)定性較強。因此，盡管產(chǎn)生的H2O2量可能較少，但其能在細胞內(nèi)積累，從而誘導(dǎo)CAT和POD 的活性升高。在高劑量污染脅迫下，蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子超出其自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力，引發(fā)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步激活SOD以清除過量超氧陰離子，防止氧化損傷的產(chǎn)生。

GST是一類既能清除自由基，又能催化谷胱甘肽（GSH）結(jié)構(gòu)上的巰基（—SH）與外源或內(nèi)源污染物的親電子基團發(fā)生結(jié)合，從而進行解毒的小分子水溶性蛋白[31]。與對照組相比，蚯蚓體內(nèi)GST 活性在0.1mg·kg-1和1 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露下未見顯著變化，而在10 mg·kg-1暴露下顯著降低（Plt;0.05，圖2d），在以前有關(guān)全氟化合物對蚯蚓的毒性研究中也觀察到了類似的結(jié)果[32-34]。GST活性受到抑制可能是ROS的過度積累超出了GST的清除能力，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞所致。

2.4 6：2 Cl-PFESA對蚯蚓細胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

MDA是生物膜內(nèi)自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物[35]。MDA含量可以直接反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映自由基的水平，是氧化損傷的較好預(yù)測指標之一[36-37]。本研究中，暴露于不同劑量6：2 Cl-PFESA污染土壤28 d后，蚯蚓體內(nèi)MDA含量隨暴露劑量升高呈逐漸上升的變化趨勢，1 mg·kg-1和10 mg·kg-1暴露劑量時與對照達顯著差異水平（Plt;0.05），表明此時蚯蚓體內(nèi)發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化損傷（圖2e），在之前一項關(guān)于228 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露對蚯蚓的14 d毒性研究中也觀察到相同的現(xiàn)象[22]。

2.5 6：2 Cl-PFESA對蚯蚓的神經(jīng)毒性

乙酰膽堿酯酶（AChE）是一種主要作用于神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶。乙酰膽堿在神經(jīng)末梢釋放后，與突觸后膜的受體結(jié)合，從而完成神經(jīng)信號的傳遞。隨后，AChE迅速將乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，從而終止乙酰膽堿的信號作用，這一過程是神經(jīng)遞質(zhì)清除的關(guān)鍵機制。因此，AChE常被作為評估神經(jīng)毒性的敏感生物標志物[38]。在暴露于6：2 Cl-PFESA 污染土壤28 d 后，與對照組相比，蚯蚓體內(nèi)AChE 活性在0.1mg·kg-1暴露組無明顯變化，而在1 mg·kg-1和10 mg·kg-1暴露組中顯著降低（Plt;0.05，圖2f），這意味著乙酰膽堿的水解可能受到抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸間隙中積累，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[39]。

2.6 6：2 Cl-PFESA誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)菌群失調(diào)

在自然界中，動物與微生物常以共生關(guān)系共存。環(huán)境污染物不僅會直接影響宿主動物的生理功能，還可能通過改變其體內(nèi)微生物群落的組成或功能，間接對宿主動物造成毒性損傷[40]。因此，為探究6：2 Cl-PFESA暴露對蚯蚓體內(nèi)微生物群落的影響，本研究還測定了暴露于高劑量6：2 Cl-PFESA污染土壤28 d后蚯蚓體內(nèi)的微生物多樣性。結(jié)果顯示，暴露組和對照組的Coverage 覆蓋指數(shù)均大于0.998，表明測序結(jié)果能較好地反映樣品中的微生物多樣性。與對照組相比，暴露于10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA 28 d后，蚯蚓體內(nèi)微生物群落α多樣性無明顯差異，但總OTU數(shù)目、門和屬水平上的細菌物種數(shù)目均降低，即總OTU 數(shù)目從1 450降低到1 355、門水平物種數(shù)從31種降低到23 種、屬水平物種數(shù)從601 種降低到500 種（圖3a）。這些缺失的物種絕大多數(shù)為相對豐度小于0.1% 的稀有物種，這可能與稀有物種由于資源限制和種群規(guī)模小等因素而對環(huán)境變化更加敏感有關(guān)[41-42]。

如圖3b所示，蚯蚓體內(nèi)細菌群落的優(yōu)勢菌門包括Firmicutes（53.35%～60.17%）、Proteobacteria（17.29%～18.98%）、Actinobacteriota（13.91%～19.38%）、Myxococcota（3.11%～3.31%）和Chloroflex（i 1.51%～2.78%）。10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA 污染暴露后，蚯蚓體內(nèi)Firmicutes相對豐度降低了11.33%，而Actinobacteriota 和Chloroflexi 相對豐度分別升高了39.32% 和84.11%。由于Actinobacteriota（放線菌門）代謝的多樣性和對環(huán)境污染物的耐受性，其成為一種潛在的生物修復(fù)微生物，在石油烴、碳氫化合物、農(nóng)藥和其他異生物質(zhì)化合物等污染物降解以及重金屬解毒方面表現(xiàn)出良好的潛力[43-46]。此外，也有研究表明Chloroflexi（綠彎菌門）含有參與有機硫降解、亞硫酸鹽氧化、環(huán)烷烴和芳香族化合物等頑固物質(zhì)代謝的基因[47-50]。更值得注意的是Chloroflexi 中似乎廣泛存在還原性脫鹵酶，其能夠催化還原脫鹵反應(yīng)去除有機鹵素化合物中的鹵素原子[51]。鑒于6：2 Cl-PFESA作為一種氯代全氟化合物，已被報道其在虹鱒魚和大鼠體內(nèi)可以通過還原脫氯反應(yīng)生成6：2 H-PFESA[4，52]。因此，污染暴露后蚯蚓體內(nèi)Actinobacteriota 和Chloroflexi相對豐度的升高很可能是6：2 Cl-PFESA污染刺激的適應(yīng)性反應(yīng)或6：2 Cl-PFESA降解菌的富集所致。

此外，與對照組相比，暴露組蚯蚓體內(nèi)致病菌門Verrucomicrobiota（0.22%～0.49%）的相對豐度顯著升高（Plt;0.05，圖3c）。Sait 等[53]在研究中將Verrucomi?crobiota分別注射或喂食給黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲后發(fā)現(xiàn)其死亡率均顯著增加，且在對病原體感染高度敏感的線蟲中表現(xiàn)得更為嚴重。另一項關(guān)于微塑料對蚯蚓毒性的研究發(fā)現(xiàn)，暴露于原始和老化塑料后的蚯蚓死亡率及存活蚯蚓體內(nèi)Verrucomicrobiota 相對豐度也均顯著高于對照，且老化塑料誘發(fā)的毒性更為顯著[54]。因此，10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA污染暴露28d后蚯蚓存活率顯著降低可能與該暴露劑量下蚯蚓體內(nèi)Verrucomicrobiota相對豐度顯著升高有關(guān)。

在屬水平（圖3b），乳桿菌屬（Lactobacillus）對6：2Cl-PFESA 暴露最為敏感，從對照組中的優(yōu)勢物種（14.24%）減少為暴露組中的稀有物種（0.04%）。6：2Cl-PFESA是PFOS的新型替代品，之前的研究曾發(fā)現(xiàn)PFOS 污染暴露28 d 后紅爪螯蝦體內(nèi)的Lactobacillus相對豐度顯著降低[55]。Lactobacillus 是常見于人和動物腸道中的益生菌，能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，在改善腸道炎癥和抗氧化能力方面發(fā)揮作用[56-57]。6：2 Cl-PFESA 暴露后蚯蚓體內(nèi)Lactobacillus相對豐度的顯著降低可能導(dǎo)致蚯蚓抗氧化能力的減弱，從而加劇氧化損傷的發(fā)生。

2.7 6：2 Cl-PFESA誘導(dǎo)蚯蚓代謝紊亂

代謝組學(xué)主要通過研究生物體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的變化，結(jié)合生物信息學(xué)的統(tǒng)計方法，能夠全面系統(tǒng)地揭示外源污染物對機體的毒性效應(yīng)及其作用機制。為研究6：2 Cl-PFESA暴露后蚯蚓體內(nèi)的潛在代謝變化，本研究對暴露于10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA的蚯蚓進行了基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)分析。負離子模式下代謝物的OPLS-DA 判別分析結(jié)果顯示（圖4a），6：2 Cl-PFESA暴露組與對照組的代謝物在第一主坐標軸上明顯分離，且通過置換檢驗驗證了該模型的可靠性（圖4b），表明暴露組和對照組之間存在顯著的代謝物差異。以Plt;0.05、VIPgt;1、| lg 2FC |≥1為條件篩選出186種差異代謝物，其中包括148種上調(diào)代謝物和38種下調(diào)代謝物（圖4c）?；谌祟惔x數(shù)據(jù)庫（HMDB）進行分類鑒定，發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要包括氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物（圖4d）。為了進一步挖掘這些差異代謝物所蘊含的生物學(xué)意義，對氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物這兩類主要差異代謝物進行VIP值分析，結(jié)果顯示絕大多數(shù)代謝物表現(xiàn)為上調(diào)（圖4e和圖4f），這可能反映了蚯蚓在遭受6：2 Cl-PFESA污染脅迫后發(fā)生了氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，并通過上調(diào)關(guān)鍵代謝物來激活保護性應(yīng)答機制，以減輕或修復(fù)由此產(chǎn)生的氧化損傷。氨基酸作為各種次級代謝產(chǎn)物的前體，在動物生理過程中發(fā)揮重要作用，因此被譽為生命的基石。纈氨酸（Valylvaline）作為一種支鏈氨基酸，能夠通過增強機體的抗氧化酶活性、促進轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的表達并增加還原型谷胱甘肽的含量，提高細胞的抗氧化能力。已有多項研究表明，纈氨酸能通過增強抗氧化和免疫能力幫助動物應(yīng)對環(huán)境脅迫[58-61]。因此，6：2 Cl-PFESA暴露后蚯蚓體內(nèi)纈氨酸水平的顯著上升可能是增強抗氧化能力來應(yīng)對6：2 Cl-PFESA 誘導(dǎo)的氧化損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)。N-乙酰胞壁酸（N-Acetylmuramate）作為肽聚糖的核心成分，是由N-乙酰葡萄糖胺和短肽鏈構(gòu)成的碳水化合物結(jié)合物。肽聚糖廣泛存在于細菌細胞壁中，形成保護屏障以維持細菌結(jié)構(gòu)的完整性，并抵御各種環(huán)境損害和滲透壓變化[62-63]。6：2 Cl-PFESA 暴露后蚯蚓體內(nèi)N-乙酰胞壁酸含量的顯著升高可能是蚯蚓通過增強細胞壁的穩(wěn)定性來應(yīng)對污染脅迫的一種自我保護機制。

進一步將差異代謝物進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路有15條，包括甘油磷脂代謝、癌癥中的膽堿代謝、抗葉酸抗性、cAMP信號通路、胰腺癌、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、味覺傳導(dǎo)、PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、FOX0信號通路、GnRH信號通路、嗎啡成癮、嗅覺傳導(dǎo)、壽命調(diào)節(jié)途徑及FcγR介導(dǎo)的吞噬作用（圖4g）。拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示只有甘油磷脂和葉酸介導(dǎo)的單碳代謝兩條通路顯著富集（圖4h）。由于PFAS與天然脂肪酸在結(jié)構(gòu)上具有相似性，其對脂質(zhì)代謝的干擾被視為PFAS影響健康的主要機制之一[22，64]。在6：2 Cl-PFESA污染暴露下，蚯蚓體內(nèi)甘油磷脂代謝通路在KEGG通路和拓撲學(xué)分析結(jié)果中均顯著富集，且注釋出PGP（a-13：0/a-25：0）、CDPDG（i-21：0/a-15：0）、Choline和PA（10：0/8：0）4種差異代謝物（圖4i）。甘油磷脂作為細胞膜的基本組成成分，其代謝途徑失調(diào)可能是6：2 Cl-PFESA 暴露誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)發(fā)生細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷后的應(yīng)激和修復(fù)反應(yīng)[65-66]。

2.8 6：2 Cl-PFESA 暴露下蚯蚓體內(nèi)微生物與代謝組學(xué)的關(guān)聯(lián)分析

上述代謝組學(xué)結(jié)果已經(jīng)表明暴露于10 mg·kg-16：2 Cl-PFESA 28 d后蚯蚓體內(nèi)的差異代謝物主要包括氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物兩大類，且絕大多數(shù)為顯著上調(diào)。這兩類差異代謝物的異常累積可能與蚯蚓體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化密切相關(guān)。因此，本研究將這兩類差異代謝物與差異菌屬進行了Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果表明，Lac?tobacillus 和unclassified_f__Ruminococcaceae 與大多數(shù)顯著上調(diào)的氨基酸/肽及其類似物呈顯著負相關(guān)（圖5a）。研究表明，Ruminococcaceae科細菌通常具有降解復(fù)雜多糖的能力，能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對維持腸道屏障功能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和改善炎癥具有重要作用[67]。由此推測，unclassified_f__Ruminococcaceae 很可能也是一種潛在的有益菌，對維持動物腸道健康有重要意義。6：2 Cl-PFESA 暴露后，蚯蚓體內(nèi)有益菌Lactobacillus 和unclassified_f__Ruminococcaceae 豐度的顯著降低表明蚯蚓腸道環(huán)境紊亂。同時，抗氧化酶的變化以及MDA含量的顯著升高表明蚯蚓體內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷。為減輕或修復(fù)這些損傷，蚯蚓可能通過上調(diào)關(guān)鍵代謝物來激活保護性應(yīng)答機制，例如谷胱甘肽代謝相關(guān)肽類（Gamma-Gluta?mylleucine、Gamma-Glutamylglutamic acid、Gamma -Glutamylserine、Glutamylmethionine、Glutamylgluta?mine）的顯著上調(diào)。

除豐度顯著降低的有益菌Lactobacillus 和unclas?sified_f__Ruminococcaceae 外，其余豐度顯著升高的菌屬主要來自放線菌門Actinobacteriota（norank_f__67-14、Mycobacterium、Streptomyces、norank_f__Propioni?bacteriaceae、Conexibacter、norank_f__norank_o__PeM15、unclassified_f__Promicromonosporaceae、Smaragdicoc?cus、Isoptericola、Patulibacter）和厚壁菌門Firmicutes（Planococcus、Herbinix、norank_f__Thermoactinomyceta?ceae、Family_ _AD3011_group、unclassified_f__Gra?cilibacteraceae、norank_f__Syntrophomonadaceae），其中Mycobacterium[68-69]、Streptomyces[70]、norank_f__Propioni?bacteriaceae[71]、Conexibacter[72] 和Planococcus[73] 在以往研究中被報道具備降解微塑料、多環(huán)芳烴和碳氫化合物等污染物的潛力。相關(guān)性分析結(jié)果表明，這些豐度顯著升高的菌屬與氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物這兩類主要差異代謝物大多呈顯著正相關(guān)（圖5a 和圖5b）。這些上調(diào)的氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物可能為6：2 Cl-PFESA暴露環(huán)境下的耐受菌和潛在降解菌提供營養(yǎng)和能量來源，最終導(dǎo)致了這些菌屬豐度升高。

3 結(jié)論

（1）暴露于6：2 Cl-PFESA 28 d 后，較對照組相比，蚯蚓存活率在高劑量（10 mg·kg-1）暴露組中顯著降低，而在中、低劑量（0.1 mg·kg-1和1 mg·kg-1）暴露組中無明顯變化；6：2 Cl-PFESA 能夠在蚯蚓體內(nèi)富集，暴露28 d的生物富集因子（BAF28d）為2.43～3.81。

（2）不同暴露劑量6：2 Cl-PFESA（0.1、1、10 mg·kg-1）均能誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性隨暴露劑量升高呈先激活后抑制的變化規(guī)律，且相較于超氧化物歧化酶（SOD），這兩種酶對6：2 Cl-PFESA暴露更為敏感。1mg·kg-1和10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露下蚯蚓體內(nèi)發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化損傷與神經(jīng)功能障礙。

（3）10 mg·kg-1 6：2 Cl-PFESA暴露誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)菌群失調(diào)，降低了蚯蚓體內(nèi)有益菌（Lactobacillus）的相對豐度，增加了致病菌門（Verrucomicrobiota）的相對豐度；同時導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)代謝功能紊亂，破壞了甘油磷脂代謝等關(guān)鍵代謝通路，體內(nèi)氨基酸/肽及其類似物、碳水化合物及其結(jié)合物等關(guān)鍵代謝物顯著上調(diào)。

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（責(zé)任編輯：李丹）