微囊藻毒素-LR暴露對(duì)蚯蚓氧化應(yīng)激及腸道微生物的影響

摘要：為探究微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）對(duì)土壤動(dòng)物的毒性效應(yīng)，本研究采用土壤接觸實(shí)驗(yàn)，利用酶活性檢測(cè)、透射電鏡與高通量測(cè)序等技術(shù)，研究了不同含量MC-LR（50、150、500 μg·kg-1）污染脅迫對(duì)赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）抗氧化防御系統(tǒng)及腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：蚯蚓表皮肌層的損傷程度與MC-LR暴露量之間存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。高含量MC-LR處理組中，蚯蚓丙二醛（MDA）含量最高（34.5 U·g-1），纖維素酶（CL）活性最低（200.5 U·g-1）。隨著MC-LR暴露量的升高，蚯蚓總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性顯著高于周圍土壤（Plt;0.05），其中假單胞菌門（Pseudomonadota）、放線菌門（Actinobacteria）和芽孢桿菌門（Bacillota）為腸道優(yōu)勢(shì)菌群。MC-LR脅迫使得蚯蚓腸道微生物群落的遺傳信息通路和代謝通路豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。研究表明，MC-LR對(duì)蚯蚓的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的脅迫效應(yīng)，降低了蚯蚓腸道的消化能力及腸道微生物豐度，進(jìn)而干擾了蚯蚓正常的遺傳信息傳遞及代謝通路運(yùn)行。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；赤子愛勝蚓；毒性效應(yīng)；腸道微生物；土壤污染

中圖分類號(hào)：X171.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2025）03-0829-10 doi：10.11654/jaes.2025-0015

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是一類由藍(lán)藻（又稱藍(lán)細(xì)菌，包括微囊藻屬、顫藻屬、魚腥藻屬等）產(chǎn)生的、具有生物活性的天然環(huán)七肽化合物[1]。已報(bào)道的MCs變體多達(dá)300余種[2]，其中MC-LR分布廣泛且毒性較強(qiáng)，相關(guān)研究也最多[3]。MCs耐高溫、難水解且不易氧化，因此在自然環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性和持久性[4]。全球各類水體中普遍檢出MCs，其濃度通常超過世界衛(wèi)生組織所推薦的飲用水安全上限（1 μg·L-1），尤其在藍(lán)藻水華頻發(fā)水域其濃度甚至高達(dá)每升水體數(shù)千微克，嚴(yán)重毒害水生生態(tài)系統(tǒng)安全及人體健康[5]。水體中的MCs還可通過灌溉、藍(lán)藻堆肥和氣溶膠等途徑不斷進(jìn)入農(nóng)田土壤，對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)健康與糧食安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[6]。Xiang 等[7]在受藍(lán)藻水華影響的華南地區(qū)農(nóng)田土壤中檢測(cè)到MCs，其含量高達(dá)187 μg·kg-1。MCs可被植物吸收累積，抑制植物的細(xì)胞分裂、光合作用等正常生理過程，從而導(dǎo)致植物葉片黃化、生長(zhǎng)遲緩，使得植物品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響[8]。食用受MCs 污染的植物可食用部分可能會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[9]。對(duì)農(nóng)田土壤而言，MCs是一類“新”污染物。隨著全球氣候變暖與水體富營(yíng)養(yǎng)化程度持續(xù)加劇，藍(lán)藻水華暴發(fā)頻率與持續(xù)時(shí)間不斷上升，由此帶來的土壤MCs污染問題不容忽視。

蚯蚓是重要的土壤生物，占土壤動(dòng)物總生物量的60%～80%[10]，對(duì)土壤形成、結(jié)構(gòu)及生態(tài)服務(wù)功能具有重大影響，是反映土壤健康的生物指標(biāo)[11-12]。此外，蚯蚓腸道微生物在維持其機(jī)體新陳代謝與促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用[13]。蚯蚓腸道內(nèi)大部分細(xì)菌來自于其所生存的環(huán)境介質(zhì)[14]，腸道獨(dú)特的微環(huán)境為厭氧/兼性厭氧菌提供了適宜的生活場(chǎng)所，致使腸道菌群與周圍環(huán)境中的菌群存在著明顯差異[13]。研究表明，蚯蚓腸道中主要營(yíng)養(yǎng)元素（如C、N、P、S等）是周邊土壤中的2～5倍，豐富的營(yíng)養(yǎng)元素有助于蚯蚓腸道菌群的繁殖和代謝活動(dòng)，進(jìn)而有利于對(duì)污染物（包括除草劑、微塑料及抗生素等）的降解[15]。同時(shí)，外界污染物也可能通過影響腸道微生物與蚯蚓的共生關(guān)系，誘發(fā)腸道炎癥等病變，威脅宿主健康[16-17]。

目前重金屬、微塑料、農(nóng)藥污染對(duì)蚯蚓腸道菌群的影響已有零星研究。例如：蚯蚓腸道細(xì)菌群落對(duì)重金屬的敏感性高于土壤細(xì)菌群落，重金屬富集可刺激蚯蚓腸道中潛在的植物根際促生菌（PGPB）的生長(zhǎng)，有助于蚯蚓-植物協(xié)同修復(fù)重金屬污染土壤[18]。聚乳酸微塑料能夠顯著降低蚯蚓腸道微生物群落豐度和多樣性，通過破壞細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致蚯蚓免疫和代謝功能障礙[19-20]。磷酸三丁酯（TBP）脅迫下，蚯蚓腸道中參與能量代謝的幾種細(xì)菌顯著變化，導(dǎo)致與營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)的跨膜和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中斷[21]。此外，鄰苯二甲酸酯、氟磺胺草醚、吡蟲啉等均可改變蚯蚓腸道微生物組成及多樣性，進(jìn)而影響蚯蚓正常的生理生化過程[22-23]。

當(dāng)前，關(guān)于MCs對(duì)土壤動(dòng)物（例如蚯蚓）生態(tài)毒性方面的研究還很少。已有報(bào)道顯示，MC-LR對(duì)蚯蚓具有神經(jīng)毒性和生殖毒性[24-25]。MC-LR還會(huì)損傷蚯蚓腸道，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)組織病變以及干擾消化酶活性等方式導(dǎo)致腸功能障礙[26]。與上述典型污染物相比，MCs作為一類天然毒素，尚缺乏其與蚯蚓腸道微生物相互作用方面的調(diào)查數(shù)據(jù)，相關(guān)劑量-效應(yīng)關(guān)系不明。鑒于此，本試驗(yàn)選用模式動(dòng)物——赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）為試驗(yàn)對(duì)象，通過開展土壤接觸試驗(yàn)，探究MC-LR暴露對(duì)蚯蚓組織結(jié)構(gòu)、氧化應(yīng)激以及腸道微生物的毒性效應(yīng)。研究結(jié)果將為土壤生態(tài)系統(tǒng)中MCs的遷移轉(zhuǎn)化提供新見解，也為準(zhǔn)確評(píng)估陸地生態(tài)系統(tǒng)中MCs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

為模擬真實(shí)土壤生態(tài)環(huán)境，受試土壤（表層0～20cm）采自華南地區(qū)某試驗(yàn)農(nóng)田土壤（紅壤），預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該土壤中未檢出MCs，其理化性質(zhì)為：pH6.77、有機(jī)質(zhì)29.93 g·kg-1、有機(jī)碳17.36 g·kg-1、總氮3.36 g·kg-1、總磷1.03 g·kg-1、總鉀6.47 g·kg-1。將采集到的土樣自然風(fēng)干后過100目篩。供試蚯蚓為赤子愛勝蚓（E.fetida），購(gòu)自廣州市某蚯蚓生產(chǎn)基地。正式試驗(yàn)開始前，先將蚯蚓在無污染的受試土壤中馴養(yǎng)14 d，隨后選擇大小相近的健康成年蚯蚓開展試驗(yàn)（平均鮮質(zhì)量為500～600 mg·條-1）。本試驗(yàn)使用的MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣藻研公司，其純度≥95%。若無特殊說明，本研究所用的其他試劑藥品均為分析級(jí)純度。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)參照OECD207準(zhǔn)則中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法開展[27]。用純甲醇配制1 mg·mL-1的MC-LR母液，然后稀釋得到一系列濃度的MC-LR 工作液。分別稱取500 g供試土壤于玻璃燒杯中，各加入1 mL工作液。前期野外實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，受污染農(nóng)田土壤中MCs的環(huán)境含量為187 μg·kg-1[7]，因此本研究設(shè)置低（50 μg·kg-1，LR50）、中（150 μg·kg-1，LR150）、高（500 μg·kg-1，LR500）3個(gè)MC-LR含量?？瞻讓?duì)照組（CK）中加入1 mL甲醇?；旌暇鶆蚝笥谕L(fēng)櫥內(nèi)靜置0.5 h以上待甲醇完全揮發(fā)，加入超純水以保持土壤含水量為30%。再次攪拌均勻后，向每個(gè)組培瓶?jī)?nèi)加15條蚯蚓和10 g牛糞飼料，用透氣膜封口后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)箱條件為：濕度80%，溫度（20±1）℃，光照時(shí)間為白天和黑夜各12 h，光照強(qiáng)度600 lx。每周定時(shí)補(bǔ)充6 mL水與10 g牛糞以維持土壤濕度與食物供給。

1.3 分析方法

染毒暴露第14天時(shí)，收集各處理組中的蚯蚓，并用去離子水沖洗干凈；在黑暗環(huán)境中將蚯蚓置于潮濕濾紙上過夜，使其排凈腸道內(nèi)容物；隨后再次用去離子水沖洗干凈，并用濾紙吸干其體表水分，以待后續(xù)分析檢測(cè)。

1.3.1 酶活性分析

稱取0.1 g新鮮蚯蚓組織樣品于1.5 mL EP離心管內(nèi)，加入研磨珠及提取液，放入預(yù)冷的組織勻漿器中，冰浴勻漿15～20 min，并于8 000 g、4 ℃離心10 min后收集上清液。分別檢測(cè)與蚯蚓氧化應(yīng)激抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)[谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）]，以及在蚯蚓腸道中所必需的、參與蚯蚓生長(zhǎng)及代謝的纖維素酶（CL）的活性。相關(guān)檢測(cè)使用購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司的商業(yè)試劑盒完成，具體方法詳見說明書。

1.3.2 透射電鏡觀測(cè)

仔細(xì)收集蚯蚓環(huán)帶下方5～10 mm處新鮮組織樣，將其立即投入裝有電鏡固定液的培養(yǎng)皿內(nèi)，將離體組織切割為1 mm×1 mm×3 mm薄片狀，以保證固定液完全滲透組織。室溫避光條件下固定2 h，將樣品于4 ℃保存，隨后使用透射電鏡（日立，HT7800）進(jìn)行觀察。

1.3.3 蚯蚓腸道微生物提取及高通量測(cè)序

將蚯蚓放置于無水乙醇中殺死，用無菌超純水洗滌干凈，固定在蠟盤上，用剪刀解剖，用鑷子取出大塊內(nèi)容物后（盡量避免取到蚯蚓組織），將組織放入預(yù)冷的PBS緩沖液中輕輕洗滌，-4 ℃離心取沉淀大約1 g，以上操作均在無菌超凈臺(tái)進(jìn)行。樣品液氮速凍置于-80 ℃保存，送測(cè)序公司（諾禾致源）進(jìn)行高通量測(cè)序。將合格的DNA樣品隨機(jī)超聲打斷成長(zhǎng)度為350bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)DNA文庫制備。為確保后續(xù)信息分析結(jié)果的準(zhǔn)確，使用QIIEM2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[28-29]，使用Cutadapt插件去除引物序列后，再用DAD2 插件[30]進(jìn)行擴(kuò)增子序列變異的質(zhì)控和宿主過濾。組裝有效數(shù)據(jù)（Clean Data）后得到Scaftigs，進(jìn)行基因預(yù)測(cè)與去冗余，構(gòu)建Gene catalogue。將Genecatalogue 與Micro_NR 庫進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)基因（unigene）的物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級(jí)的物種豐度表。根據(jù)常用的功能數(shù)據(jù)庫，從Gene catalogue 出發(fā)，使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（RDP）分類器對(duì)物種豐度及代謝通路數(shù)據(jù)庫（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、同源基因簇?cái)?shù)據(jù)庫（Evolutionary genealogy of genes：Non-su?pervised Orthologous Groups，eggNOG）等進(jìn)行功能注釋和豐度分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基本數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，每份實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)平行處理（n=3），數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 13.0（美國(guó)SPSS公司）進(jìn)行單因素方差分析、Duncan′s 檢驗(yàn)和最小顯著性差異檢驗(yàn)，Plt;0.05 代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。微生物數(shù)據(jù)的分析處理主要基于R3.4.3 軟件進(jìn)行。使用Origin 2021（美國(guó)OriginLab 公司）繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC-LR污染脅迫對(duì)赤子愛勝蚓的組織病理學(xué)損傷

通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MC-LR暴露導(dǎo)致蚯蚓表皮肌層損傷，其損傷程度與MC-LR脅迫量之間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。無污染對(duì)照組中，蚯蚓表皮肌肉完整且排列緊密，無明顯組織病變（圖1a）。50 μg·kg-1處理組中，蚯蚓肌層開始出現(xiàn)輕微裂縫（圖1b），150 μg·kg-1處理組中肌層出現(xiàn)裂縫且肌層紋路紊亂（圖1c），而暴露于500 μg·kg-1 MC-LR時(shí)肌層的裂縫增多，且出現(xiàn)了明顯的空泡化現(xiàn)象（圖1d）。

2.2 MC-LR污染脅迫對(duì)赤子愛勝蚓的氧化脅迫及酶活性的影響

由圖2a可知，蚯蚓體內(nèi)MDA含量隨著MC-LR暴露量的升高而增加，其在500 μg·kg-1 處理組中的含量為34.5 U·g-1，是對(duì)照組中的2倍（Plt;0.05）。與對(duì)照組相比，MC-LR處理組蚯蚓體內(nèi)T-AOC水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在150 μg·kg-1 處理組中達(dá)到最大，是對(duì)照組的1.5倍（圖2b）。相反，各處理組的蚯蚓體內(nèi)CL活性與MC-LR暴露量呈顯著負(fù)相關(guān)性（Plt;0.05），在500 μg·kg-1處理組中其活性最低（200.5 U·g-1），僅為對(duì)照組的35.4%（圖2c）。由圖2d可以看出，GST 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在50、150 μg·kg-1 處理中其活性分別為對(duì)照的1.3 倍和1.5 倍（Plt;0.05），但在500 μg·kg-1 時(shí)與對(duì)照組無顯著差異。GSH是細(xì)胞內(nèi)的解毒物質(zhì)，與對(duì)照組相比，在50 μg·kg-1 MC-LR暴露量時(shí)無顯著變化，但在150、500 μg·kg-1暴露量時(shí)其含量均顯著降低（Plt;0.05）。

2.3 MC-LR污染脅迫對(duì)土壤和赤子愛勝蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 土壤和蚯蚓腸道微生物群落多樣性變化

α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物的Chao1指數(shù)明顯低于蚯蚓腸道中的（Plt;0.05），不同MC-LR處理組蚯蚓腸道微生物多樣性呈先上升后下降的趨勢(shì)，但各組之間并無顯著差異（圖3a）?；贐ray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與50 μg·kg-1 處理組中蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在PCoA 1軸上明顯分離，而其他各處理組之間則無顯著差異（圖3b）。

2.3.2 土壤和蚯蚓腸道微生物群落組成變化

如圖4a所示，在門分類水平上，各處理組及土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌門（Pseudomonadota）、放線菌門（Actinomycetota）、芽孢桿菌門（Bacillota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）和擬桿菌門（Bacteroidota）。與對(duì)照組相比，MC-LR污染脅迫導(dǎo)致假單胞菌門和疣微菌門的相對(duì)豐度顯著降低（Plt;0.05），而放線菌門和浮霉?fàn)罹T（Planctomycetota）的相對(duì)豐度增加。蚯蚓腸道中擬桿菌門的相對(duì)豐度低于土壤，50、150 μg·kg-1MC-LR處理下其豐度上升，而500 μg·kg-1處理下則降低。此外，土壤黏球菌門（Myxococcota）和尾噬菌體門（Uroviricota）的相對(duì)豐度分別為0.015%和0.013%，明顯高于蚯蚓腸道中的（分別為lt;0.003%和lt;0.002%），而熱脫硫桿菌門（Thermodesulfobacteriota）的豐度則較低（Plt;0.05）。相關(guān)性分析證實(shí)，MC-LR污染脅迫降低了芽孢桿菌、假單胞菌和疣微菌的相對(duì)豐度，且浮霉?fàn)罹cMC-LR暴露量呈明顯正相關(guān)關(guān)系（圖4b）。

采用Linear discriminant analysis Effect Size（LEfSe）可以檢測(cè)不同處理之間具有顯著豐度差異的微生物類群，確定各處理組的生物標(biāo)志物。由圖4c可以看出，土壤中的細(xì)菌大部分屬于擬桿菌；對(duì)照組中，對(duì)蚯蚓腸道環(huán)境影響最顯著的微生物類群包括微枝形桿菌屬（Microvirga）、隱真菌屬（Paramicrosporidi?um）、甲基桿菌科（Methylobacteriaceae）及淤泥卡斯特蘭尼氏菌（Castellaniella_caeni），表明這些微生物是蚯蚓腸道原始環(huán)境中的功能微生物。50 μg·kg-1處理組中的特異性顯著微生物為鞘氨醇單胞菌屬（Sphin?gomonas）和成對(duì)桿菌屬（Dyadobacter）。150 μg·kg-1處理組中顯著貢獻(xiàn)的微生物類群最多，如噬幾丁質(zhì)菌目（Chitinophaga）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）、厭氧黏細(xì)菌科（Anaeromyxobactera?ceae）、弗拉特氏菌屬（Frateuria）、希瓦氏菌屬（She?wanella）、馬賽菌屬（Massilia）、叢毛單胞菌屬（Coma?monadaceae）。在500 μg·kg-1 MC-LR脅迫下，顯著性貢獻(xiàn)的微生物較少，主要包括未分類的螺旋菌門（Spirochaetota）類群。

2.4 蚯蚓腸道微生物與生化指標(biāo)相關(guān)性分析

選取蚯蚓腸道微生物相對(duì)豐度前10的門類與上述5 種氧化活性指標(biāo)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，揭示兩者之間的相互作用關(guān)系。由圖5可知，T-AOC水平與蚯蚓腸道中黏球菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)性（Plt;0.01 和Plt;0.05），而與芽孢桿菌門的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。此外，MDA 含量與疣微菌門相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），而GST 活性與黏球菌門相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（Plt;0.001）。

2.5 蚯蚓腸道菌群功能對(duì)MC-LR污染脅迫的響應(yīng)

通過PICRUSt 2 預(yù)測(cè)蚯蚓腸道微生物組的功能特征，結(jié)果顯示：代謝（Metabolism）和遺傳信息處理（Genetic information processing）是KEGG Level-1水平上富集程度最高的兩類通路，其中代謝相關(guān)通路占主要部分，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔因子和維生素代謝、核苷酸代謝等。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，不同處理組之間的通路豐度差異雖未達(dá)到顯著水平，但相較于對(duì)照組均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中對(duì)氨基酸代謝的影響最大，指示不同程度的MC-LR污染脅迫會(huì)損害蚯蚓代謝和遺傳信息處理能力。核苷酸代謝中的嘧啶代謝在所有代謝途徑中最為豐富。

3 討論

蚯蚓通過皮膚或腸道吸收環(huán)境基質(zhì)中存在的各類污染物，進(jìn)而對(duì)蚯蚓產(chǎn)生多種毒性效應(yīng)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露于MC-LR的赤子愛勝蚓表皮肌層出現(xiàn)明顯空泡化現(xiàn)象（圖1），這與前期調(diào)查結(jié)果一致[6]，表明MC-LR暴露會(huì)造成蚯蚓表皮撕裂，甚至導(dǎo)致出血和組織糜爛。Liu等的研究表明，MC-LR暴露導(dǎo)致蚯蚓腸道組織發(fā)生了明顯病變，包括肌肉纖維化、消化道降解、盲腸脫落、上皮和黃原組織異常[26]。本研究中CL活性顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)MC-LR對(duì)蚯蚓的腸道組織與功能造成了損害。CL作為蚯蚓體內(nèi)重要的消化酶，直接參與蚯蚓正常生長(zhǎng)及代謝[26]。這也解釋了為何MC-LR污染暴露會(huì)顯著抑制赤子愛勝蚓生長(zhǎng)[6，26]。

污染脅迫會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基（ROS），生物體通過各種抗氧化酶與非酶抗氧化物作用將ROS保持在較低水平，以防止產(chǎn)生氧化損傷[32]。GST 作為一種多功能解毒酶，可以催化GSH 與有毒物質(zhì)耦聯(lián)而增加其親水性，有助于有毒物質(zhì)排出體外，從而發(fā)揮解毒功能[33]。本研究中，MC-LR污染脅迫下蚯蚓體內(nèi)GST 活性顯著升高，促使更多的GSH與MC-LR結(jié)合，造成GSH含量顯著降低（圖2d和圖2e），這一過程是維持細(xì)胞內(nèi)部氧化還原穩(wěn)態(tài)所必須的。T-AOC代表體內(nèi)整體抗氧化水平對(duì)ROS的消除能力，是機(jī)體抗氧化防御能力的標(biāo)志[34]。與對(duì)照組相比，MC-LR 污染脅迫下蚯蚓體內(nèi)T-AOC 均顯著上升，并在高含量處理組中略微下降（圖2b）。這些現(xiàn)象表明，當(dāng)外源物脅迫程度過高時(shí)，ROS蓄積可能導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)損傷，因此T-AOC水平下降。高含量處理組中MDA含量顯著增加（圖2a），進(jìn)一步證實(shí)此時(shí)蚯蚓體內(nèi)已積累過量ROS并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。

蚯蚓以土壤中的有機(jī)物為食，其腸道中的很多微生物來源于土壤。但與土壤環(huán)境不同，蚯蚓腸道具有厭氧、pH中性、濕度高等特殊性質(zhì)，可能會(huì)選擇性地過濾周圍土壤中的部分微生物。此外，隨著蚯蚓的生理活動(dòng)，有些微生物還會(huì)在其腸道內(nèi)增殖、變異或富集，從而形成與外部環(huán)境差異明顯的獨(dú)特微生物群落結(jié)構(gòu)與功能[35-36]。因此，蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性通常較周圍土壤中要高（圖3a）。蚯蚓攝入的土壤有機(jī)殘?jiān)?，?jīng)腸道微生物同化后再次排出體外，土壤與蚯蚓腸道微生物存在相同的優(yōu)勢(shì)群落[37-38]。

盡管存在不同程度的MC-LR污染脅迫，但蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)仍保持部分相同（圖3b），表明蚯蚓腸道內(nèi)存在核心微生物組，面對(duì)外界污染脅迫能夠保持相對(duì)穩(wěn)定[39]，其以假單胞菌、放線菌、擬桿菌等為主[40]。假單胞菌中許多種細(xì)菌都具有分解蛋白質(zhì)與脂肪的能力。MC-LR 脅迫使得放線菌相對(duì)豐度增加，表明MC-LR污染脅迫下蚯蚓腸道篩選出了更多的兼性/專性厭氧菌[15]。浮霉?fàn)罹哂薪到鈴?fù)雜碳水化合物（例如木質(zhì)纖維素）的能力[41]，高濃度MC-LR暴露時(shí)其相對(duì)豐度最高，這可能是因?yàn)槠鋵?duì)MC-LR污染脅迫具有較高的抵抗能力。疣微菌在蚯蚓腸道中參與多種物質(zhì)循環(huán)，可以降解半纖維素聚合物[42]。本實(shí)驗(yàn)中蚯蚓受到脅迫產(chǎn)生氧化損傷，引起MDA含量上升，降低了疣微菌的相對(duì)豐度，說明MC-LR會(huì)削弱蚯蚓腸道分解、吸收營(yíng)養(yǎng)元素的能力，從而抑制蚯蚓正常生長(zhǎng)發(fā)育[43]。與此同時(shí)，為了適應(yīng)MC-LR 污染脅迫，蚯蚓體內(nèi)T-AOC和GST含量與腸道內(nèi)黏球菌豐度同時(shí)升高。黏球菌門作為蚯蚓腸道中重要的抗性微生物[44]，可能參與MC-LR降解，因此二者呈正相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果表明蚯蚓腸道菌群和酶等物質(zhì)可相互影響以應(yīng)對(duì)MC-LR的污染脅迫。

研究表明，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致生物相關(guān)代謝途徑發(fā)生變化[45]。氨基酸代謝途徑參與機(jī)體多種基本生理活動(dòng)，包括能量?jī)?chǔ)存、先天免疫激活和蛋白質(zhì)合成等[46]。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝途徑豐度下降，會(huì)導(dǎo)致宿主與微生物相互作用的重要信號(hào)分子——芳香氨基酸含量下降，其在調(diào)節(jié)胃腸道和遠(yuǎn)端器官的局部及全身免疫、代謝和神經(jīng)元反應(yīng)中發(fā)揮作用，影響疾病發(fā)生[47]。MC-LR 污染脅迫下，蚯蚓腸道中這3類重要芳香氨基酸合成途徑豐度的降低，可能是由于蚯蚓腸道微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，造成芳香氨基酸含量減少，最終影響蚯蚓正常生理活動(dòng)。精氨酸可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，通過降低反應(yīng)蛋白等標(biāo)志物來減輕炎癥[48]。MC-LR 暴露后，蚯蚓腸道微生物的精氨酸代謝途徑豐度降低（圖6），進(jìn)一步揭示炎癥可能是誘發(fā)其腸道損傷的重要因素之一。賴氨酸、色氨酸及異亮氨酸等的合成與代謝途徑豐度的下降（圖6），表明蚯蚓處于MC-LR脅迫時(shí)蛋白質(zhì)消化和吸收能力受到抑制[49]。上述氨基酸代謝通路的紊亂，反映蚯蚓腸道微生物能量代謝功能受到了擾動(dòng)，而這也是機(jī)體在污染脅迫下的普遍反映特征[50]。MC-LR暴露還導(dǎo)致蚯蚓腸道微生物的泛酸和CoA生物合成途徑水平下降，表明蚯蚓脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)能力受到抑制，從而進(jìn)一步影響能量的調(diào)節(jié)補(bǔ)充[51]。GSH作為一種重要的抗氧化因子，參與MC-LR解毒的第一步[52]，其代謝途徑的降低與GSH 含量的降低趨勢(shì)一致（圖2e和圖4），表明蚯蚓腸道微生物菌群的解毒能力下降。此外，嘧啶代謝途徑的降低表示在一定程度上MC-LR抑制了蚯蚓能量代謝、糖基化反應(yīng)以及DNA合成[53]。

4 結(jié)論

（1）微囊藻毒素-LR（MC-LR）脅迫對(duì)蚯蚓表皮肌層產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的病理學(xué)損傷。同時(shí)顯著影響蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，丙二醛（MDA）含量顯著上升，總抗氧化水平（T-AOC）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）先上升后下降，纖維素酶（LC）與谷胱甘肽（GSH）顯著下降。

（2）腸道微生物群落多樣性顯著高于土壤，但豐度前10物種的相對(duì)豐度低于土壤，且MC-LR脅迫也降低了微生物群落的相對(duì)豐度，而假單胞菌門、放線菌門、擬桿菌門作為腸道微生物核心群落，即使在MC-LR脅迫下，也保持較高的豐度。

（3）T-AOC、GST與黏球菌門呈現(xiàn)正相關(guān)，T-AOC與擬桿菌門呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。黏球菌門和擬桿菌門在蚯蚓的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可能參與MC-LR 的降解。MDA 與疣微菌門呈負(fù)相關(guān)，說明MC-LR抑制蚯蚓腸道降解纖維素的能力。

（4）MC-LR脅迫使得蚯蚓腸道遺傳信息處理途徑與代謝途徑呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，且對(duì)代謝途徑影響更大，進(jìn)而影響蚯蚓能量?jī)?chǔ)存、蛋白質(zhì)合成、炎癥反應(yīng)等。

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（責(zé)任編輯：潘淑君）