根系分泌物對漆酶誘導(dǎo)17β-雌二醇聚合轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

摘要：以廣泛種植的玉米（Zea mays L.）為代表性農(nóng)作物，選擇17β-雌二醇（E2）為環(huán)境中典型雌激素，采用批量平衡試驗方法，探究了玉米根系分泌物（M-REs）對云芝（Trametes versicolor）漆酶誘導(dǎo)E2轉(zhuǎn)化動力學(xué)、產(chǎn)物分布和植物毒性的影響及機(jī)制。結(jié)果表明：漆酶3 h內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化95%以上E2，其轉(zhuǎn)化動力學(xué)常數(shù)（k）為1.08 h-1。40～80 mg·L-1 M-REs抑制了漆酶誘導(dǎo)的E2轉(zhuǎn)化（k=0.82～0.96 h-1），而5～20 mg·L-1 M-REs對E2轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出促進(jìn)效果（k=1.14～1.45 h-1）。漆酶誘導(dǎo)E2轉(zhuǎn)化的可識別中間產(chǎn)物中不僅含有E2自聚合產(chǎn)物（如二聚體、三聚體和四聚體等低聚物），還包括大量E2和M-REs的共聚合產(chǎn)物（如E2與香草酸、阿魏酸、原兒茶酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的共二聚體）。隨著漆酶誘導(dǎo)聚合反應(yīng)時間的延長，E2和M-REs中特定的小分子代謝物會產(chǎn)生高度復(fù)雜且具有多種功能基團(tuán)的C C、C O C或C N C鍵結(jié)合的共沉淀聚合產(chǎn)物。研究表明，E2和M-REs共沉淀聚合產(chǎn)物不僅有效地緩解了E2對玉米種子的毒害作用，還刺激了玉米根的生長發(fā)育，漆酶誘導(dǎo)共聚合轉(zhuǎn)移有望為農(nóng)作物根際雌激素的凈污和解毒提供新思路和途徑。

關(guān)鍵詞：玉米根系分泌物；真菌漆酶；17β-雌二醇；共聚合轉(zhuǎn)移；植物毒性

中圖分類號：X503.231 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2025）03-0806-09 doi：10.11654/jaes.2024-1145

17β-雌二醇（E2，lg Kow=3.94）作為內(nèi)分泌干擾效應(yīng)最高的雌激素，普遍地存在于環(huán)境中。生物體攝入過量的E2會導(dǎo)致其生殖系統(tǒng)紊亂，甚至引發(fā)遺傳變異和癌癥疾病[1]。隨著我國工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，日益增加的雌激素隨著城市污水排放、畜禽養(yǎng)殖廢水釋放和地表徑流等途徑進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，進(jìn)一步增加了農(nóng)作物的雌激素污染風(fēng)險[2-4]。例如，玉米（Zea maysL.）和小麥（Triticum acstivnm L.）等農(nóng)作物可以吸收環(huán)境中雌激素，并在根、莖葉和可食用部位儲存[5-6]。這些雌激素會隨著膳食攝入而到達(dá)人體中，進(jìn)而干擾人類內(nèi)分泌系統(tǒng)[1]。因此，如何減輕農(nóng)作物中雌激素污染問題已引起了全球的廣泛關(guān)注。根際在農(nóng)作物吸收、運(yùn)輸及分配雌激素方面起到至關(guān)重要的作用[6-7]。根系分泌物能夠增強(qiáng)根際區(qū)域的污染物降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)農(nóng)作物對雌激素的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[8-9]。根系分泌物中含有豐富的糖類、氨基酸和酚類等小分子代謝物，其中某些特定的代謝物可能改變雌激素在根際微域的命運(yùn)，并影響雌激素的根際轉(zhuǎn)化和農(nóng)作物對雌激素的攝取[10-11]。

生物炭吸附、芬頓氧化和微生物代謝是農(nóng)作物根際有機(jī)污染物修復(fù)的傳統(tǒng)策略。然而，這些方法往往難以徹底去除有機(jī)污染物，且有著修復(fù)周期長、運(yùn)營成本昂貴和使用條件苛刻等不可避免的缺陷[12-15]。生物酶作為一種簡單、綠色、環(huán)保、易操作的根際修復(fù)劑，它不僅可以高效地催化雌激素等多種有機(jī)污染物的氧化和去除，也有望促進(jìn)環(huán)境中有機(jī)碳的聚合和腐殖化，生成具有刺激農(nóng)作物生長發(fā)育的類腐殖質(zhì)產(chǎn)品[16-18]。漆酶（EC 1.10.3.2）是自然界中廣泛分布的一種藍(lán)色含銅多酚氧化還原酶，該類酶對酚類和非酚類污染物均有很強(qiáng)的氧化效果[19-20]。漆酶在T1-Cu 位點引發(fā)底物的單電子氧化轉(zhuǎn)移，并快速地產(chǎn)生不穩(wěn)定的活性自由基中間體；同時，氧氣在三核銅簇中心（T2-Cu/T3-Cu位點）被還原成水[19]。緊接著，這些活性中間體通過自聚合或共聚合途徑自發(fā)地相互連接，形成低溶解度和生物可利用性的聚合產(chǎn)物。該過程不僅有助于降低污染物的生物毒性，也可以增加環(huán)境中有機(jī)碳的存儲[10，17]?？梢姡崦刚T導(dǎo)的雌激素聚合轉(zhuǎn)移反應(yīng)有望消除農(nóng)作物根際有機(jī)污染風(fēng)險。盡管如此，農(nóng)作物根系分泌物在漆酶調(diào)控雌激素聚合轉(zhuǎn)移中扮演何種角色仍不清楚。

本研究以全球廣泛種植的玉米為模式農(nóng)作物，選擇具有高氧化還原電位（約760 mV）的云芝（Trametesversicolor）漆酶為催化劑、雌激素中毒性最高的E2為目標(biāo)污染物，研究玉米根系分泌物（M-REs）中小分子代謝物對漆酶誘導(dǎo)E2 氧化和聚合轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制[21]。采用批量平衡試驗方法，探索M-REs 對漆酶誘導(dǎo)E2轉(zhuǎn)化動力學(xué)的影響；借助高分辨質(zhì)譜（HRMS）檢測手段，鑒定漆酶誘導(dǎo)E2和M-REs中特定的小分子代謝物形成的主要中間產(chǎn)物，并定量地分析E2自聚合產(chǎn)物的時間變化趨勢；通過掃描電子顯微鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和13C核磁共振（13C-NMR）等技術(shù)，表征E2自/共沉淀聚合產(chǎn)物的微觀形態(tài)、官能團(tuán)和化學(xué)結(jié)構(gòu)特性；利用小型盆栽試驗，評估E2和M-REs 共聚合產(chǎn)物對玉米種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)（GI）的影響。研究結(jié)果有助于揭示漆酶誘導(dǎo)聚合轉(zhuǎn)移中E2和玉米根系釋放的小分子代謝物的互作機(jī)制，旨在為農(nóng)作物根際雌激素污染的酶促凈污和解毒提供創(chuàng)新思路。

1 材料與方法

1.1 生物材料和化學(xué)試劑

玉米種子購自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。T. versicolor漆酶（淺褐色，活性≥0.5 U·mg-1）、E2（C18H24O2）、2，6-二甲氧基苯酚（DMP，C8H10O3）和Hoagland 培養(yǎng)液購自Sigma - Aldrich 試劑公司（上海）。色譜級甲醇（CH3OH）和乙腈（C2H3N）購自Aladdin 試劑公司（上海）。所制備的E2（1 mmol·L-1）、M-REs（5 g·L-1）、漆酶（100 U·mL-1）和檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液（CPBS，10 mmol·L-1）等母液儲存于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2 玉米根系分泌物的收集

玉米種子經(jīng)過75%乙醇表面消毒殺菌5 min，采用滅菌的去離子水充分清洗3次并浸泡8 h后，置于人工氣候箱（HBRG-500LED）中催芽，預(yù)培養(yǎng)至株高8～10 cm。選擇40株長勢均勻、大小一致的玉米幼苗重新移栽到2 000 mL滅菌的新鮮Hoagland培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15 d。通過0.45 μm水系微孔濾膜過濾培養(yǎng)液并冷凍干燥，獲得玉米根系分泌物（M-REs）。人工氣候箱的光照和黑暗培養(yǎng)時間為14 h/10 h，晝夜溫度為25 ℃/20 ℃，相對濕度為60%～70%，日間光照強(qiáng)度約為180 μmol·m-2·s-1。