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    基于超聲可連續(xù)進樣的完整單細胞代謝組學質(zhì)譜分析平臺的構(gòu)建

    2025-04-17 00:00:00張文美郭曉凱許太林郭廣生汪夏燕
    分析化學 2025年3期
    關(guān)鍵詞:單細胞超聲

    摘要 單細胞代謝物分析能夠在小分子水平上揭示細胞間異質(zhì)性及其分子多樣性,尤其是活單細胞代謝物分析能夠展示保真度更高的生化信息。本研究建立了基于超聲可連續(xù)進樣的完整單細胞代謝組學質(zhì)譜分析平臺,旨在提升單細胞利用率和質(zhì)譜檢測效率。此平臺基于微型化超聲模塊產(chǎn)生的機械運動實現(xiàn)了長達60 min 的細胞懸浮和分散,并且對細胞的完整性和活性影響較小,細胞存活率高于70%。通過比較靜置組和超聲組的細胞懸浮液密度和質(zhì)譜檢出的單細胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)超聲處理顯著降低了細胞沉降速度,提高了單細胞質(zhì)譜檢出單細胞的數(shù)量。將此分析平臺用于小鼠小腦星形膠質(zhì)細胞(C8D1A)和小鼠膠質(zhì)瘤細胞(GL261)的單細胞分析,實現(xiàn)了不同種類細胞的聚類及差異化分析,顯示了本方法在細胞異質(zhì)性分析以及細胞識別中的應(yīng)用潛力,為單細胞分析提供了新思路及解決方案。

    關(guān)鍵詞 單細胞;質(zhì)譜分析;超聲;窄內(nèi)徑毛細管;代謝物分析

    細胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)及功能單元,傳統(tǒng)的研究方案依據(jù)細胞來源和形態(tài)等特征進行研究,并且多在群體細胞水平上進行[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),隨著細胞分裂增殖變化,細胞呈現(xiàn)出分子或基因方面的改變,從而產(chǎn)生異質(zhì)性[3]。單細胞代謝物分析可以在微觀小分子水平上揭示細胞異質(zhì)性,尤其是活單細胞代謝物分析能夠展示保真度更高的信號傳遞、相互作用和增殖分化等生化信息[4-7],是近年來備受研究者矚目的研究方向。單細胞代謝物分析對于深入了解生物體內(nèi)代謝過程和相關(guān)疾病機制具有重要意義。

    質(zhì)譜(MS)具有檢測速度快、分辨率高以及準確定性鑒定的優(yōu)勢,已成為單細胞代謝物分析的主要研究方法[8-10]。目前用于單細胞代謝物檢測的質(zhì)譜方法有二次離子質(zhì)譜(SIMS)[11-12]、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)[13-14]和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)[15-17],其中, ESI-MS 是活單細胞代謝物分析的主要方法之一。ESI-MS 幾乎不需要對樣品進行預處理,并在大氣壓環(huán)境下實現(xiàn)細胞取樣和離子化,可以實現(xiàn)原位的單細胞代謝物分析。目前,研究者發(fā)展了多種基于ESI-MS 的單細胞分析方法,多方面提升了單細胞質(zhì)譜分析方法的代謝物檢測性能,例如脈沖直流電噴霧質(zhì)譜法[18]、單探針質(zhì)譜法[9]、無標記質(zhì)譜流式細胞術(shù)法[19-20]、電發(fā)射電離質(zhì)譜法[21]以及有機質(zhì)譜流式方法[22]等。其中,電發(fā)射電離質(zhì)譜法實現(xiàn)了完整的活單細胞代謝物分析,避免了由于基質(zhì)干擾和樣品稀釋等導致的檢測靈敏度不足的問題。

    在低流速、小尺度條件下,流體的雷諾數(shù)極小,很難形成湍流,流體間的混合非常緩慢,而聲流場為流體混合提供了一種簡單有效的方法。聲流場能夠誘導流體介質(zhì)中的顆粒進行高效混合,使顆粒在流體中均勻分布。通過優(yōu)化聲流場的參數(shù)(如頻率、強度和作用時間等)可以進一步提高混合效率,縮短混合時間[23-24],應(yīng)用于材料科學納米顆粒的制備中可以防止顆粒團塊化,促進材料均勻分散[25-26]。

    本研究構(gòu)建了一種基于超聲的可連續(xù)進樣單細胞質(zhì)譜分析平臺,采用壓電陶瓷片構(gòu)建超聲模塊與離心管連接,實現(xiàn)了簡單且易于操作的無損超聲處理。利用超聲波振動進樣瓶中樣品有效延緩了細胞沉降速度,同時能夠保持細胞的完整性和活性。本方法有助于提高單細胞樣品的利用率和單細胞質(zhì)譜檢測通量,為現(xiàn)有單細胞質(zhì)譜進樣方式提供了一種高效策略。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    Orbitrap Eclipse Tribrid 質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher 公司);ECLIPSE Ti 熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司);TDGC-15K 調(diào)壓器(華通機電公司);BSA323S-CW 分析天平(德國Sartorius 公司);Spectra MaxM5 酶標儀(美國Molecular Devices 公司);1300 SERISE A2 生物安全柜和311 CO2 培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher 公司);TDZ5-WS 低速離心機(德國Eppendorf 公司)。

    甲醇、甲酸、氨和pierceTM水(LC-MS 級,美國Thermo Fisher 公司);氫氧酸(HF,天津福晨化學試劑廠);細胞膜綠色熒光探針(DiO,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);CCK-8(北仁化學科技有限公司);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青-鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)以及L-谷氨酰胺等細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購于Gibco 公司;高純氮氣(99.9%,北京奧康雙泉能源技術(shù)有限公司)。

    1.2 質(zhì)譜條件

    納升電噴霧(nanoESI)離子源;正掃描模式;離子傳輸管溫度350 ℃;離子源電壓3 kV;激活電壓1.5 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 100~1000;分辨率30000,最大注入時間500 ms,AGC(自動增益控制)值為1 × 105。

    1.3 細胞培養(yǎng)

    非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549 細胞和膠質(zhì)瘤細胞GL261 購于中國科學院細胞庫,小鼠星形膠質(zhì)細胞C8D1A 購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。A549 細胞和GL261 細胞使用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),C8D1A 細胞使用低碳酸氫鈉的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞解凍后,使用含有200 μg/mL L-谷氨酰胺、10%(V/V)胎牛血清和100 U/mL 青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 和DMEM 培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長覆蓋度達到80%~90%后,采用PBS 緩沖液清洗,再用胰酶消化進行傳代培養(yǎng),收集傳代2~3 代的細胞進行后續(xù)實驗。

    1.4 細胞染色

    收集對數(shù)生長期的A549 細胞,去除殘留培養(yǎng)基后用PBS 洗滌3 次,加入10 μmol/L DIO 染液,在37 ℃下孵育15 min,1000 r/min 離心5 min,移去細胞染液后,用PBS 洗滌3 次,收集的細胞用PBS 重懸后,采用熒光顯微鏡進行成像分析。

    1.5 細胞活性的檢測

    將A549 細胞收集后進行超聲處理,分別收集超聲處理0、15、30、45 和60 min 的細胞,以6000 個細胞/孔接種到96 孔培養(yǎng)板上,在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中孵育6 h,各孔加入含有10 μL CCK8 的培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育2 h,采用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。

    1.6 窄等內(nèi)徑毛細胞噴針的制備

    采用本研究組建立的重力輔助濕法刻蝕方法[21,27]制備窄等內(nèi)徑毛細管噴針。截取一根內(nèi)徑為25 μm、外徑為360 μm、總長為40 cm的裸熔融石英毛細管(永年銳灃色譜器件有限公司),去除一端的聚酰亞胺涂層后,將毛細管浸入40% HF中靜置50 min??涛g完成后去除尖端部分的涂層,氮氣吹干,備用。

    1.7 單細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

    以細胞膜主要成分磷脂酰膽堿(PC 34∶1, m/z 760.58)為單細胞質(zhì)譜圖篩選標準,利用Python 及R 語言提取扣除背景后信噪比大于5、并且在所有細胞中出現(xiàn)的頻率大于20%的單細胞相關(guān)離子,并進行t-SNE 聚類分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 基于超聲可連續(xù)進樣-窄等內(nèi)徑發(fā)射器的單細胞質(zhì)譜分析平臺的構(gòu)建

    基于超聲可連續(xù)進樣-窄等內(nèi)徑發(fā)射器的單細胞質(zhì)譜分析平臺如圖1 所示,包括超聲模塊、進樣模塊和可視化調(diào)整模塊。超聲模塊由深圳大學許太林研究組自制的電子設(shè)備構(gòu)成[28],主要部件有圓形壓電陶瓷片、功率調(diào)節(jié)電路板以及電源開關(guān)。工作原理為驅(qū)動裝置輸出的信號經(jīng)壓電陶瓷片轉(zhuǎn)化為正弦波,疊加在裝有細胞的離心管上形成聲波場,實現(xiàn)對離心管內(nèi)細胞懸液的聲波振動。進樣模塊首先將窄等內(nèi)徑毛細管噴針的樣品端插入進樣艙內(nèi)的離心管底部,然后利用高純氮氣氣壓驅(qū)動細胞進入毛細管中;此外,將高導電銅線一端插入離心管底部,另一端與質(zhì)譜儀高壓正極相連,形成一條導電路徑,允許毛細管尖端在高壓下放電??梢暬{(diào)整模塊借助電子顯微鏡實時觀察并調(diào)節(jié)窄等內(nèi)徑毛細管發(fā)射器出口端與質(zhì)譜儀進樣口之間的相對位置并使之對齊,確保在放電發(fā)射過程中樣品能夠成功進入質(zhì)譜儀。

    2.2 超聲處理對細胞的影響

    超聲是一種波長極短的機械波,可能會影響細胞狀態(tài),因此采用CCK8 法對超聲后的細胞活性進行檢測??疾觳煌晻r間(15、30、45 和60 min)處理后的A549 細胞的活性,結(jié)果如圖2 所示。隨著超聲時間延長,細胞的存活率逐漸降低,表明長時間暴露在超聲波中會對細胞產(chǎn)生負面影響。盡管存活率有所下降,但經(jīng)過60 min 超聲處理后,細胞存活率仍保持在70%以上,滿足檢測需求。此外,采用顯微成像對超聲處理前后的細胞完整性進行表征,圖3 為不同處理條件下A549 細胞經(jīng)DIO 染色后的成像圖,與培養(yǎng)基中的細胞相比,大部分經(jīng)甲酸銨溶液浸泡及超聲處理40 min 的細胞仍保持完整的細胞形態(tài),表明超聲處理對細胞的影響較小。

    通過觀察經(jīng)不同時長超聲處理的細胞懸液的密度以表征超聲延緩細胞沉降的作用。取對數(shù)期生長的A549 細胞配制成4.5×105 cells/mL 的單細胞懸液,每100 μL 細胞懸液作為一個樣本加入到0.2 mL 離心管中,靜置組和超聲組各5 個樣本,分別在超聲處理0、10、20、40 和60 min 后取5 μL 上層液體進行成像觀察。如圖4 所示,隨著超聲處理時間的延長,兩組樣本中細胞數(shù)量逐漸減少,然而相對于靜置組,超聲組在60 min 后的上層液體仍有部分細胞均勻地懸浮和分散,表明超聲具有延緩細胞沉降的作用。這是由于超聲波的振動效應(yīng),產(chǎn)生局部劇烈擾動并增加液體混合程度,這種擾動和混合效應(yīng)有助于保持或恢復細胞的懸浮狀態(tài)。

    2.3 單細胞質(zhì)譜檢測

    采用構(gòu)建的超聲可連續(xù)進樣-窄等內(nèi)徑噴針單細胞質(zhì)譜分析平臺對單細胞進行檢測。首先考察了質(zhì)譜檢測前流經(jīng)窄內(nèi)徑毛細管噴針的細胞數(shù)量。圖5A 為離線檢測細胞收集方式,在窄等內(nèi)徑毛細管噴針出口處以離心管收集流經(jīng)通道的細胞,并統(tǒng)計收集到的細胞數(shù)量;圖5B為初始密度為4.5×105 cells/mL 的細胞在氮氣驅(qū)動下注入窄等內(nèi)徑毛細管,流經(jīng)噴針后收集30 min 所得細胞量的統(tǒng)計情況。結(jié)果顯示,超聲組收集到的細胞數(shù)量遠大于靜置組,表明超聲處理能夠有效提高細胞進入毛細管的效率,提高了細胞的利用率。

    對超聲處理前后的細胞進行質(zhì)譜分析,評估了質(zhì)譜檢測細胞的通量。選用內(nèi)徑為25 μm 的毛細管噴針對不同密度的A549 細胞懸浮液(1×104、5×104、1×105、5×105 和1×106 cells/mL)進行檢測。圖6 為以特征脂質(zhì)信號磷脂酰膽堿(m/z 760.58)提取的單細胞離子流圖,從圖中可知,超聲組呈現(xiàn)更均勻的單細胞質(zhì)譜峰分布。在連續(xù)20 min 進樣過程中,超聲組始終可以檢測到細胞信號;靜置組存在大量未檢測到細胞的空白區(qū)。這可能是細胞沉降導致其未能進入毛細管中,因而未被質(zhì)譜檢測到。實驗結(jié)果證實了超聲對于延緩細胞沉降速度的效果,并成功提高了質(zhì)譜分析中的單細胞利用率和檢測通量。

    2.4 C8D1A 和GL261 細胞分類分析

    將構(gòu)建的超聲可連續(xù)進樣-窄等內(nèi)徑噴針單細胞質(zhì)譜分析平臺用于不同類型的膠質(zhì)細胞分析(C8D1A 和GL261 分別為小鼠星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞)。采用本研究組開發(fā)的單細胞數(shù)據(jù)分析平臺,以細胞膜主要成分磷脂酰膽堿(m/z 760.58)作為細胞信號篩選標準,提取扣除背景后信噪比大于5 且在所有細胞中出現(xiàn)頻率大于20% 的單細胞相關(guān)離子進行分析,在C8D1A 和GL261 樣品中分別檢測到了1194 和1210 個單細胞。圖7A 為可視化的統(tǒng)一流形逼近與投影(UMAP)聚類分析圖,圖中的1 個點代表1 個細胞,不同種類細胞由不同顏色表示。此圖展示了C8D1A 和GL261 單細胞代謝輪廓差異,可以明顯觀察到不同種類的細胞匯聚成不同團簇,表現(xiàn)出細胞差異及單細胞異質(zhì)性的特點。圖7B 和圖7C 的小提琴圖展示了兩類細胞中每個細胞被檢測到的總強度分布和每個細胞被檢測到的代謝物相關(guān)離子數(shù),C8D1A 和GL261 的平均強度分別為1.9×108 和1.5×108,相關(guān)離子數(shù)為190 個。綜上,本分析平臺成功檢測到了待測細胞的多種代謝物,并實現(xiàn)了不同類型細胞的分類分型分析。

    3 結(jié)論

    本研究將基于壓電陶瓷建立的微型化超聲模塊用于樣品中單細胞的分散與懸浮,超聲模塊產(chǎn)生的機械運動對單細胞的完整性及活性的影響均較小,在超聲60 min 后,細胞存活率高于70%?;诖藰?gòu)建了超聲可連續(xù)進樣-窄等內(nèi)徑噴針的單細胞質(zhì)譜分析平臺,顯著改善了細胞沉降導致的單細胞檢測通量低的問題,實現(xiàn)了同源的星形膠質(zhì)細胞(C8D1A 和GL261)的分類分析,展現(xiàn)出其在細胞異質(zhì)性分析中的潛力。本平臺為單細胞分析提供了新的思路和方案,有望用于不同種類細胞、細胞不同亞型和分型不明確的復雜細胞體系的分類及差異化分析,以及細胞量較少且不能實現(xiàn)增殖的珍貴臨床或組織分離樣品的代謝分析,為探究疾病及生物體的發(fā)展提供了新的分析手段。

    References

    [1] ZENOBI R. Science, 2013, 342(6163): 1243259.

    [2] BALU?KA F, MILLER JR W B, REBER A S. J. Physiol. , 2024, 602(11): 2491-2501.

    [3] KUMAR R M, CAHAN P, SHALEK A K, SATIJA R, DALEYKEYSER A, LI H, ZHANG J, PARDEE K, GENNERT D,TROMBETTA J J, FERRANTE T C, REGEV A, DALEY G Q, COLLINS J J. Nature, 2014, 516(7529): 56-61.

    [4] ABOULEILA Y, ONIDANI K, ALI A, SHOJI H, KAWAI T, LIM C T, KUMAR V, OKAYA S, KATO K, HIYAMA E,YANAGIDA T, MASUJIMA T, SHIMIZU Y, HONDA K. Cancer Sci. , 2019, 110(2): 697-706.

    [5] ALI A, ABOULEILA Y, SHIMIZU Y, HIYAMA E, EMARA S, MASHAGHI A, HANKEMEIER T. TrAC, Trends Anal.Chem. , 2019, 120: 115436.

    [6] FESSENDEN M. Nature, 2016, 540(7631): 153-155.

    [7] HANAHAN D, WEINBERG R A. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

    [8] QIN S J, MIAO D, ZHANG X, ZHANG Y, BAI Y. TrAC, Trends Anal. Chem. , 2023, 164: 117086.

    [9] LI Z, CHENG S, LIN Q, CAO W, YANG J, ZHANG M, SHEN A, ZHANG W, XIA Y, MA X, OUYANG Z. Nat. Commun. ,2021, 12(1): 2869.

    [10] WANG Ju-Duo, SONG Jia-Feng, LI Chang, DAI Xin-Hua, FANG Xiang, GONG Xiao-Yun, YE Zi-Hong. Chin. J. Anal.Chem. , 2020, 48(8): 969-980.

    王舉鐸, 宋佳峰, 李暢, 戴新華, 方向, 龔曉云, 葉子弘. 分析化學, 2020, 48(8): 969-980.

    [11] WüTHRICH C, FAN Z, VERGèRES G, WAHL F, ZENOBI R, GIANNOUKOS S. Anal. Methods, 2023, 15(5): 553-561.

    [12] PAREEK V, TIAN H, WINOGRAD N, BENKOVIC S J. Science, 2020, 368(6488): 283-290.

    [13] NEUMANN E K, COMI T J, RUBAKHIN S S, SWEEDLER J V. Angew. Chem. Int. Ed. , 2019, 58(18): 5910-5914.

    [14] KOMPAUER M, HEILES S, SPENGLER B. Nat. Methods, 2017, 14(1): 90-96.

    [15] VAN BERKEL G J, MCLUCKEY S A, GLISH G L. Anal. Chem. , 1991, 63(18): 2064-2068.

    [16] FENG D, XU T, LI H, SHI X, XU G. J. Anal. Test. , 2020, 4(3): 198-209.

    [17] XU S, XUE J, BAI Y, LIU H. Anal. Chem. , 2020, 92(24): 15854-15861.

    [18] WEI Z, XIONG X, GUO C, SI X, ZHAO Y, HE M, YANG C, XU W, TANG F, FANG X, ZHANG S, ZHANG X. Anal.Chem. , 2015, 87(22): 11242-11248.

    [19] YAO H, ZHAO H, ZHAO X, PAN X, FENG J, XU F, ZHANG S, ZHANG X. Anal. Chem. , 2019, 91(15): 9777-9783.

    [20] YAO H, ZHAO H, PAN X, ZHAO X, FENG J, YANG C, ZHANG S, ZHANG X. Anal. Chem. , 2021, 93(29): 10282-10291.

    [21] SHAO Y, ZHOU Y, LIU Y, ZHANG W, ZHU G, ZHAO Y, ZHANG Q, YAO H, ZHAO H, GUO G, ZHANG S, ZHANG X,WANG X. Chem. Sci. , 2022, 13(27): 8065-8073.

    [22] QIN S, ZHANG Y, SHI M, MIAO D, LU J, WEN L, BAI Y. Nat. Commun. , 2024, 15(1): 4387.

    [23] GLYNNE-JONES P, HILL M. Lab Chip, 2013, 13(6): 1003-1010.

    [24] LAURELL T, PETERSSON F, NILSSON A. Chem. Soc. Rev. , 2007, 36(3): 492-506.

    [25] CHEN G, GUO S, LI H. J. Appl. Polym. Sci. , 2002, 86(1): 23-32.

    [26] TIAN W, YUNG K L, XU Y, HUANG L, KONG J, XIE Y. Nanoscale, 2011, 3(10): 4094-4100.

    [27] LI R, SHAO Y, YU Y, WANG X, GUO G. Chem. Commun. , 2017, 53(29): 4104-4107.

    [28] LUO Y, GAO H, ZHOU M, XIAO L, XU T, ZHANG X. ACS Sens. , 2022, 7(9): 2654-2660.

    國家自然科學基金項目(Nos. 22127805, 22206008)資助。

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