摘要 光熱治療作為一種新型的抗腫瘤治療策略,單獨(dú)用于抗腫瘤治療時靶向性不足,穿透能力有限,無法實(shí)現(xiàn)長期抑制。本研究將M1 型巨噬細(xì)胞外泌體(MEVs)修飾于搭載有CSF1R-siRNA 和光熱劑的載體表面制備多功能基因遞送載體MEVs@RNPs,可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型,實(shí)現(xiàn)三陰性乳腺癌(TNBC)的高效光熱-免疫治療。采用納米粒度儀、紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計和測溫?zé)岢上駜x對納米顆粒的理化性質(zhì)進(jìn)行測定。以TNBC 細(xì)胞4T1、內(nèi)皮細(xì)胞Bend3 和巨噬細(xì)胞RAW264.7 為體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型,考察了MEVs@RNPs 體外靶向腫瘤細(xì)胞、殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞重編程的能力。選擇Balb/c 小鼠建立皮下移植瘤模型,測定不同處理組腫瘤體積和體重的變化。分離小鼠血液和腫瘤組織,采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin(HE))染色、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferasedUTP nick end labeling, TUNEL)、酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法測定腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果表明, MEVs@RNPs 可優(yōu)先靶向至腫瘤細(xì)胞,并在光熱條件下誘導(dǎo)更強(qiáng)的TNBC 細(xì)胞殺傷效果。流式細(xì)胞術(shù)和ELISA 法測定結(jié)果顯示, MEVs@RNPs 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M2型向抗腫瘤的M1 型轉(zhuǎn)化,并顯著提高抗腫瘤細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)的分泌水平。MEVs@RNPs 的體內(nèi)抗腫瘤治療效果評估結(jié)果顯示,在激光照射條件下, MEVs@RNPs 組可以顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞病理性壞死和凋亡,促進(jìn)巨噬細(xì)胞重編程和CD4+/CD8+ T 細(xì)胞向腫瘤部位浸潤,提高TNF-α和IL-12 的分泌水平,從而全面提高TNBC 的治療效果。
關(guān)鍵詞 光熱治療;免疫治療;外泌體;巨噬細(xì)胞;重編程;三陰性乳腺癌
乳腺癌是女性群體中最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤之首[1]。三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer, TNBC)因缺乏雌激素和孕激素受體以及人類表皮生長因子受體2 的表達(dá)而得名,是乳腺癌中最具侵襲性的亞型[2-3],其致死率、復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移潛能均高于其它亞型,一直是乳腺癌治療領(lǐng)域的難點(diǎn),目前臨床尚缺乏有效的治療策略[4]。光熱治療(Photothermal therapy, PTT)作為一種新型微創(chuàng)的治療方式,相較于傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)治療等方式[5-6],具有治療時間短、療效顯著和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[7],在腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛的研究和關(guān)注。PTT 療法的關(guān)鍵是將具有光熱轉(zhuǎn)換效率的材料導(dǎo)入至腫瘤部位,在特定波長的光照射下,將光能轉(zhuǎn)化為熱能,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特定殺傷[8]。然而,單一的PTT 療法應(yīng)用于腫瘤治療仍面臨諸多限制,如光熱材料的遞送效率和腫瘤組織的穿透性仍有待提升、非特異性殺傷問題需進(jìn)一步優(yōu)化、腫瘤長期抑制效果有待提高等[9]。針對上述問題,研究者將PTT 療法與其它療法聯(lián)合應(yīng)用,在有效克服PTT 療法自身局限性的同時,實(shí)現(xiàn)多種治療方式的協(xié)同增效,為多模式聯(lián)合應(yīng)用策略的開發(fā)提供了新的思路[10]。
研究表明,腫瘤抗原可誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答能力,與其它治療策略相結(jié)合,可顯著提升抗腫瘤治療效果并實(shí)現(xiàn)長效抗腫瘤作用[11-12]。巨噬細(xì)胞(Macrophage)是一種在血液和組織中分布較廣泛的免疫細(xì)胞,可在不同的信號和微環(huán)境的刺激下進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換,發(fā)揮重要的免疫作用[13]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage, TAM)是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞群之一,根據(jù)功能不同分為M1 型和M2 型,其中, M1 型巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞1 型(T helper cell 1, Th1)反應(yīng),發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤活性;M2 型巨噬細(xì)胞與M1 型作用相反,主要發(fā)揮促腫瘤活性[14]。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞多以M2 型巨噬細(xì)胞為主,可介導(dǎo)免疫抑制性因子的分泌和表達(dá),促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤部位血管生成等,多途徑“主動”發(fā)揮促腫瘤和免疫抑制效應(yīng)[15-18]。因此,針對巨噬細(xì)胞不同表型所呈現(xiàn)的截然不同的功能,采用調(diào)控巨噬細(xì)胞向M1 型重編程或抑制M2 型活性的策略,有望逆轉(zhuǎn)腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境。集落刺激因子1 受體(Colony-stimulating factor 1 receptor, CSF1R)又稱CD115,直接參與巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控,激活TAMs 中M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá),促進(jìn)腫瘤生長[19]。利用CSF1R-小干擾核糖核酸(CSF1R-small interfering RNA, CSF1R-siRNA)抑制CSF1R 的活性,阻斷CSF1/CSF1R 信號通路,可以降低M2 型巨噬細(xì)胞比例,促進(jìn)其向抗腫瘤的M1 型巨噬細(xì)胞重編程[20],從而增強(qiáng)抗腫瘤治療效果?;诖?,利用siRNA 抑制CSF1R 表達(dá)導(dǎo)致CSF1/CSF1R 信號通路阻斷的原理,將M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型巨噬細(xì)胞,再與PTT 相結(jié)合,有望成為TNBC 的有效治療策略。
如將上述兩種治療策略相結(jié)合,首先需要解決如何將相關(guān)藥物或載體高效靶向遞送至腫瘤部位,并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)釋放等問題[ 21-23]。近年來,仿生策略的發(fā)展為解決上述問題提供了可行性方案。外泌體(Exosomes)來源于活細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷而形成多囊泡體,并與細(xì)胞膜融合后釋放于胞外基質(zhì)中,是粒徑為50~150 nm 的脂質(zhì)雙分子層納米級膜性囊泡[24-25],其中, TSG101、CD9 和CD81 常作為外泌體分離和鑒定的標(biāo)志物[26]。外泌體繼承了母細(xì)胞的天然靶向和特異識別性能,因具有低免疫原性(可用于同種異體治療)、低毒性、可提高藥物的生物利用度和靶向歸巢特性等優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注,已成功應(yīng)用于腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腎病等多種疾病的治療研究[27-28]。巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞之一,其來源的外泌體因具有天然的生物相容性和靶向性而被開發(fā)成遞送治療性藥物或載體,用于多種疾病的治療,其中, M1 型巨噬細(xì)胞來源的外泌體具有將藥物精準(zhǔn)遞送至腫瘤部位的潛能[29],可作為理想的藥物遞送載體助力TNBC 的精準(zhǔn)、高效治療。
本研究基于M1 型巨噬細(xì)胞來源的外泌體的腫瘤歸巢效應(yīng)[30-31],將其修飾于搭載有近紅外光熱劑IR-820 和CSF1R-siRNA 的顆粒骨架外,形成多功能基因遞送系統(tǒng)MEVs@RNPs (其中, MEVs 代表M1 型巨噬細(xì)胞外泌體;NPs 代表納米顆粒(Nanoparticles);RNPs 代表包載IR-820 和CSF1R-siRNA 的納米顆粒),可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型,重塑腫瘤部位免疫抑制性微環(huán)境,結(jié)合IR-820的光熱效應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對TNBC 的高效光熱-免疫治療。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
CS150FNX 型超速離心機(jī)(日本Hitachi 公司);ZS90 型納米粒度電位儀(英國Malvern 公司);UH-100B 型超聲波細(xì)胞破碎儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);Tecnai G2 F20 S-TWIN 型透射電子顯微鏡(美國FEI 公司,工作電壓200 kV);Evolution One Plus 紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);F-7100 熒光分光光度計(日本日立公司);HM-TPH11-3AXF 手持測溫?zé)岢上駜x(杭州??低晹?shù)字技術(shù)股份有限公司);808 nm 激光器(北京宏藍(lán)光電科技有限公司);Beckman Moflo-XDP 流式細(xì)胞儀(上海貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)。
磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-胺(DSPE-PEG(2000)Amine,美國Avanit 公司);琥珀酰亞胺基丙酸酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP)、DSPE-PEG-Maleimide(DSPE-PEG-MAL)和焦碳酸二乙酯(DEPC)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司);M5Hiper CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒、M5 HiPer Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司);Calcein-AM/PI Double Stinging Kit(東仁化學(xué)科技(上海)有限公司);VEX ExosomeIsolation Reagent(From cell culture media)、One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit (10%) (南京諾唯贊生物科技有限公司);IR-820(阿拉丁生化科技股份有限公司);CSF1R-siRNA 由通用生物(安徽)股份有限公司合成;脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS,美國Sigma 公司);FITC anti-mouse CD86、PE anti-mouseCD206 和PE anti-mouse CD80(BIOLEGEND 生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。
實(shí)驗(yàn)所用的巨噬細(xì)胞株RAW264.7 和TNBC 細(xì)胞株4T1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;BALB/c 小鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。本研究已獲得煙臺毓璜頂醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 巨噬細(xì)胞外泌體的提取
將處于對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞RAW264.7 接種于150 mm2 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞匯合度約為60%~70%時,向其中加入LPS(50 ng/mL),刺激處理24 h[32],收集細(xì)胞,使用流式抗體PE-CD80 和FITCCD86進(jìn)行標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀檢測M1 型巨噬細(xì)胞的比例,驗(yàn)證其已被誘導(dǎo)成為M1 型巨噬細(xì)胞。更換新鮮無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為80%~95%,收集上清液并進(jìn)行過濾,離心(4 ℃,5600 r/min, 20 min),去除細(xì)胞碎片殘留。緩慢吸取上清液至新的離心管中,并向其中加入1/3 上清液體積的VEX Exosome Isolation Reagent(from cell culture media),輕輕顛倒混勻至樣本重新恢復(fù)澄清。將混懸液于4 ℃垂直靜置12 h 后進(jìn)行離心(4 ℃,10200 r/min,30 min),棄去上清液,再次離心(4 ℃, 4000 r/min,2 min),完全棄去剩余上清液后,即得到外泌體沉淀,于–80 ℃貯存,備用。采用Western blot 技術(shù)測定外泌體標(biāo)志蛋白CD9、TSG101 及CD81,以確定外泌體成功提取。
1.2.2 仿生納米顆粒MEVs@RNPs 的制備及性能測定
稱取2 mg DSPE-PEG(2000)Amine 和1 mg SPDP 溶于200 μL DMSO 中,向其中加入DEPC 處理的1 ×PBS 緩沖液;在室溫條件下避光振蕩孵育2 h 后,用截留分子量為10 kD的離心超濾管進(jìn)行超濾(4 ℃,4000 r/min,15 min),并用預(yù)冷的DEPC 處理的去離子水離心洗滌3 次;向其中加入DEPC 處理的1 × PBS緩沖液溶解CSF1R-siRNA, 4 ℃反應(yīng)過夜,即得到DSPE-PEG-CSF1R-siRNA。將合成的DSPE-PEG-CSF1RsiRNA與1 mg 光熱劑IR-820、1 mg DSPE-PEG-MAL 溶于1 mL 四氫呋喃(THF)中,迅速將混合物注入2 mL DEPC 處理的去離子水中,在超聲條件下充分混勻,采用10 kD 超濾管超濾離心(4 ℃, 4000 r/min,15 min),用預(yù)冷的DEPC 處理的去離子水離心洗滌3 次,即得到RNPs,于4 ℃貯存,備用。將上述制備提取的RNPs在電轉(zhuǎn)儀的輔助下導(dǎo)入至外泌體中,得到多功能基因遞送載體MEVs@RNPs(圖1)。
1.2.3 MEVs@RNPs 溶液的光熱性能測定
采用測溫?zé)岢上駜x監(jiān)測不同溶液的溫度變化情況。首先,在5 個相同的離心管中,分別加入1 mL0.2 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液,調(diào)整808 nm 激光器的功率分別為0.25、0.50、0.75 和1.00 W/cm2,照射上述溶液,每10 s 記錄一次溶液的溫度,繪制同一濃度的MEVs@RNPs 在不同功率激光照射下的升溫曲線。分別將0.05、0.10、0.20 和0.40 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液置于離心管中,以去離子水作為對照,并用808 nm 激光(0.5 W/cm2)進(jìn)行照射,每10 s 記錄一次溶液溫度,繪制不同濃度的MEVs@RNPs 溶液在同一功率激光照射下的升溫曲線圖。采用測溫?zé)岢上駜x監(jiān)測0.2 mg/mL MEVs@RNPs 溶液經(jīng)過808 nm激光(0.5 W/cm2)照射5 min 的溫度變化,每10 s 記錄一次溶液溫度,繪制時間-溫度曲線圖,并記錄不同時間點(diǎn)的熱成像圖。
1.2.4 MEVs@RNPs 的安全性及抗腫瘤效果的體外驗(yàn)證
將RNPs、MEVs@RNPS和MEVs 分別用含1% PMSF 的RIPA 裂解液進(jìn)行冰浴裂解25 min。將裂解產(chǎn)物離心(4 ℃,12100 r/min,5 min)后棄去沉淀,取上清液與適當(dāng)體積比的蛋白上樣緩沖液充分混合,于100 ℃金屬浴中升溫變性5 min 后,進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析,測定外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD9、TSG101和CD81。
將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞4T1 細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞Bend 3 接種于共聚焦小皿中,培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為50%時,將納米材料RNPs 和MEVs@RNPs 分別加入到上述接種細(xì)胞的共聚焦小皿中,孵育30 min 后,使用DAPI 染液(即用型)染色,隨后置于熒光顯微鏡下觀察。
在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)4T1 細(xì)胞至細(xì)胞匯合度約為80%時,棄去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度的MEVs@RNPs(0、0.05、0.10、0.20 和0.50 mg/mL)的完全培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;棄去培養(yǎng)基,各孔加入100 μL 含10% CCK-8 的完全培養(yǎng)基,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min 后,使用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 處的吸光度,計算細(xì)胞存活率。
將4T1 細(xì)胞接種于96 孔板中,待細(xì)胞匯合度約為80%時,棄去培養(yǎng)基,分別加入含10 μg/mL RNPs和10 μg/mL MEVs@RNPs 的完全培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h 后,實(shí)驗(yàn)組使用808 nm 激光(0.5 W/cm2)照射10 min(控制溫度低于43 ℃),對照組避光處理。將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)12 h。根據(jù)Calcein-AM/PI Double Stinging Kit 試劑盒說明書對各實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行Calcein-AM/PI 染色處理,使用全自動倒置熒光顯微鏡觀察不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
將4T1 細(xì)胞以1×106 個/孔接種至12 孔板中,在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,棄去培養(yǎng)液,分別加入含10 μg/mL RNPs 和10 μg/mL MEVs@RNPs 的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用808 nm 激光(0.5 W/cm2)照射實(shí)驗(yàn)孔10 min,對照組避光處理。繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。收集各組細(xì)胞并使用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗3 次后,按照M5 HiPer Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞染色,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。
1.2.5 MEVs@RNPs 體外免疫激活實(shí)驗(yàn)
將處于對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞RAW264.7 分別接種于含10 μg/mL RNPs 和10 μg/mL MEVs@RNPs完全培養(yǎng)基的6 孔板中,并設(shè)置對照組,于37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集巨噬細(xì)胞并用PBS緩沖液離心清洗3 次。通過流式抗體FITC-CD86 和PE-CD206 對上述分組的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀檢測M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞的比例。收集上述孵育后的上清液,離心去除細(xì)胞碎片,使用ELISAMAXTM Deluxe Set Mouse TNF-α和ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 試劑盒對各組上清液中TNF-α和IL-12 的含量進(jìn)行測定。
1.2.6 MEVs@RNPs 體內(nèi)抗腫瘤和免疫效果評價
小動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分參照煙臺毓璜頂醫(yī)院倫理委員會的相關(guān)制度開展實(shí)驗(yàn)(倫理批準(zhǔn)號:2024-717)。將4T1 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞匯合度約為90%時,用胰酶消化;將細(xì)胞收集至15 mL 離心管中,以PBS 清洗2 次后,制成細(xì)胞懸液。將200 μL 細(xì)胞懸液(2 × 107 cell/mL)注入雌性Balb/c 小鼠右側(cè)大腿上部皮下,每3 d 監(jiān)測一次小鼠體表腫瘤體積,并記錄小鼠的體重。腫瘤體積公式:V = L×W2×0.5(其中, L 代表腫瘤的長度, W 代表腫瘤的寬度)。
以上述構(gòu)建的小鼠TNBC 皮下移植瘤模型為基礎(chǔ),待腫瘤生長至適宜大小(~100 mm3),將其隨機(jī)分為6 組(每組5 只):PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、RNPs+Laser 組、MEVs@RNPs 組、MEVs@RNPs+Laser 組。所有小鼠均以尾靜脈注射的方式注入0.2 mL 的PBS 或納米顆粒溶液(200 μg/mL),小鼠飼喂24 h 后,激光照射組(+Laser 組)采用808 nm 激光(0.5 W/cm2)照射10 min。光熱治療7 d 后,通過眼眶取血法分離小鼠血液,并麻醉脫頸處死小鼠以分離皮下腫瘤。將上述分離的各組皮下腫瘤組織用多聚甲醛固定,切片處理后分別進(jìn)行HE 染色和TUNEL 熒光染色,并置于熒光顯微鏡下觀察;使用ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse TNF-α和ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 試劑盒檢測各組小鼠血清中的TNF-α和IL-12濃度。此外,將同批次的各處理組分離的皮下腫瘤進(jìn)行組織研磨和消化后,加入含2%胎牛血清的PBS 緩沖液離心清洗(2000 r/min,5 min),并用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞, PBS 緩沖液洗滌沉淀后進(jìn)行重懸。加入流式抗體對重懸后細(xì)胞中的M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞和CD4+、CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
本研究涉及的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0 軟件和Origin 2021 軟件進(jìn)行分析和圖形繪制,其中,計數(shù)資料以百分比(%)表示,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;不同組之間的比較采用單因素方差分析,plt;0.05 表示差異性顯著且具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果與討論
2.1 MEVs@RNPs 的表征及性能測定
采用流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS 處理后RAW264.7 向M1 型巨噬細(xì)胞極化情況的結(jié)果(見電子版文后支持信息圖S1)表明,經(jīng)過誘導(dǎo)處理后,共孵育體系中M1 型巨噬細(xì)胞比例達(dá)到82.7%。
將提取的M1 型巨噬細(xì)胞外泌體修飾于搭載了CSF1R-siRNA 和光熱劑IR-820 的納米顆粒表面,形成具有調(diào)控M2 型巨噬細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)化和介導(dǎo)光熱轉(zhuǎn)換能力的多功能基因遞送載體MEVs@RNPs。
由RNPs 和MEVs@RNPs 的TEM 圖(見電子版文后支持信息圖S2)可見,二者均為典型的球狀結(jié)構(gòu),在MEVs@RNPs 外層有一層膜狀結(jié)構(gòu)。納米粒度電位儀測定結(jié)果顯示, RNPs 的水合粒徑為(102.88±4.19) nm, MEVs@RNPs 的水合粒徑為(123.75±5.07) nm,較RNPs 的粒徑增加約21 nm,并且粒徑分布較集中(圖2A)。RNPs 的Zeta 電位為–(1.59±0.08) mV,而MEVs@RNPs 的Zeta 電位為–(14.67±0.57) mV(圖2B), Zeta 電位明顯降低,可能由于外泌體帶有更多的負(fù)電荷[33],外泌體修飾后會使電位的絕對值增加。上述結(jié)果表明, M1 型巨噬細(xì)胞的外泌體已成功修飾在RNPs 表面,成功制備了載體MEVs@RNPs。在納米顆粒的紫外-可見-近紅外吸收光譜(圖2C)中, RNPs 的最大吸收波長約為693 nm,而MEVs@RNPs的最大吸收峰紅移至705 nm。熒光發(fā)射光譜(圖2D)顯示, RNPs 的最大熒光發(fā)射波長約為864.4 nm,MEVs@RNPs 的最大熒光發(fā)射波長紅移至873.2 nm。
2.2 MEVs@RNPs 溶液的光熱性質(zhì)測定
基于MEVs@RNPs 溶液在650~750 nm 范圍內(nèi)有良好的近紅外吸收特性,進(jìn)一步考察了MEVs@RNPs溶液的光熱性質(zhì)。如圖3A 和3B 所示,隨著照射功率增加, 0.2 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液的溫度呈明顯升高趨勢;在同一功率激光照射下,不同濃度(0.05~0.40 mg/mL)的MEVs@RNPs 溶液溫度隨濃度增大也呈現(xiàn)明顯升高趨勢,而對照組去離子水的溫度無明顯變化。為進(jìn)一步研究MEVs@RNPs 溶液的光熱性質(zhì),監(jiān)測了激光持續(xù)照射下MEVs@RNPs 溶液的升溫-降溫變化。如圖3C 所示,在照射初期,溶液溫度隨照射時間延長而逐步提升,在約220 s 時達(dá)到最高(46.6 ℃),并在此溫度附近維持約100 s,隨后逐漸降低。通過測溫?zé)岢上駜x進(jìn)行更直觀的溫度監(jiān)測,由圖3D 可見,隨著照射時間延長, MEVs@RNPs 溶液的溫度持續(xù)升高。上述結(jié)果證明, MEVs@RNPs 具有良好的光熱性能。
2.3 MEVs@RNPs 的體外抗腫瘤效果評價
為證明外泌體已成功修飾于MEVs@RNPs 表面,分別測定MEVs@RNPs、MEVs 和RNPs 組中的外泌體標(biāo)志蛋白CD9、TSG101 及CD81。如圖4A 所示,除RNPs 組無相關(guān)蛋白條帶外, MEVs@RNPs 組和MEVs 組均可檢測到明顯的標(biāo)志性蛋白,表明外泌體已成功修飾于RNPs 表面。通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞4T1 細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞Bend 3 對MEVs@RNPs 的攝取情況。本研究中, CSF1R-siRNA 帶有CY5紅色熒光標(biāo)簽,因此,可以通過觀察共孵育體系中細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光信號的強(qiáng)弱來評價4T1 細(xì)胞對MEVs@RNPs 的攝取能力。如圖4B 所示,與RNPs 和MEVs@RNPs 共孵育后, Bend 3 細(xì)胞內(nèi)均幾乎未見紅色熒光, RNPs 組4T1 細(xì)胞中有較弱的紅色熒光信號,而MEVs@RNPs 組4T1 細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色熒光信號,這是由于腫瘤細(xì)胞相較于非腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞攝取能力[34],而外泌體的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步提高了腫瘤細(xì)胞對納米材料的攝取效率。
通過CCK-8 法測定不同濃度的MEVs@RNPs 對細(xì)胞活力的影響,結(jié)果見電子版文后支持信息圖S3,MEVs@RNPs 溶液濃度在0.05~0.50 mg/mL 范圍內(nèi), 4T1 細(xì)胞的存活率均大于90%,說明MEVs@RNPs 對細(xì)胞具有良好的生物安全性。
使用流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行定量檢測,以評價納米材料的促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。如圖4C 所示,未給予激光照射的RNPs 組和MEVs@RNPs 組細(xì)胞凋亡比例均較低,分別為0.75%和0.98%;給予激光照射后, RNPs 組和MEVs@RNPs 組細(xì)胞凋亡比例分別為16.1%和28.6%,相較于對照組(0.78%)明顯增高,并且MEVs@RNPs 組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果更佳,進(jìn)一步證明了MEVs@RNPs 在體外對腫瘤細(xì)胞具有良好的光熱殺傷效果。
進(jìn)一步考察了MEVs@RNPs 介導(dǎo)的光熱治療效果。采用鈣黃綠素/碘化丙啶(AM/PI)染色法對納米材料處理后的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,利用熒光顯微鏡觀察納米顆粒在體外對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。鈣黃綠素(AM)只對活細(xì)胞進(jìn)行染色,呈現(xiàn)綠色熒光;碘化丙啶(PI)只對凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色,呈現(xiàn)紅色熒光。如圖4D 所示,在無激光照射條件下, RNPs 組和MEVs@RNPs 組的腫瘤細(xì)胞與PBS 對照組一致,均呈現(xiàn)綠色熒光,說明RNPs 組和MEVs@RNPs 組均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞殺傷能力。經(jīng)808 nm 激光照射后, RNPs組和MEVs@RNPs 組均出現(xiàn)明顯的紅色熒光,并且MEVs@RNPs 組的紅色熒光更明顯,表明MEVs@RNPs介導(dǎo)的光熱治療對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。
2.4 體外免疫調(diào)節(jié)效果評價
巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一,而腫瘤部位的巨噬細(xì)胞主要以M2 型為主,這也是導(dǎo)致腫瘤部位巨噬細(xì)胞“不作為”的主要原因。因此,將巨噬細(xì)胞由促腫瘤的M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型,是實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤的關(guān)鍵[35]。在體外抗腫瘤效果評價的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步評價了MEVs@RNPs 的免疫調(diào)節(jié)能力。通過流式細(xì)胞儀檢測不同處理組巨噬細(xì)胞RAW264.7 的表型變化,以評價其對巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)的作用。如圖5A 所示, MEVs@RNPs 組中的M1 型巨噬細(xì)胞比例顯著高于RNPs 組和PBS 組,MEVs@RNPs 組的M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯低于RNPs 組和PBS 組。上述結(jié)果表明,搭載CSF1R-siRNA的MEVs@RNPs 可使M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型。
為了進(jìn)一步評價MEVs@RNPs 的免疫調(diào)節(jié)功能,測定了不同處理組巨噬細(xì)胞RAW 264.7 促炎因子(TNF-α和IL-12 等)的分泌情況。通過ELISA 法測定不同處理組RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TNF-α和IL-12 的濃度。如圖5B 所示, RNPs 組的TNF-α和IL-12 的表達(dá)量分別為191.39 和217.23 pg/mL,MEVs@RNPs 組的TNF-α和IL-12 的表達(dá)量分別為315.56 和427.62 pg/mL,均較PBS 組明顯增高,并且MEVs@RNPs 組的細(xì)胞因子濃度較RNPs 組更高,表明MEVs@RNPs 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌和釋放促炎因子,從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
2.5 MEV@RNPs 體內(nèi)抗腫瘤治療和免疫調(diào)節(jié)效果評價
為了進(jìn)一步考察基于MEVs@RNPs 的光熱免疫療法在體內(nèi)的治療效果,對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組處理,結(jié)果如圖6A 所示。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理后的24 d 內(nèi), PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs 組小鼠的腫瘤體積呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,但MEVs@RNPs+Laser 組的小鼠腫瘤體積明顯被抑制并呈現(xiàn)下降趨勢,這可能是因?yàn)镸1 型巨噬細(xì)胞外泌體的腫瘤歸巢效應(yīng),使得MEVs@RNPs 高效聚集于小鼠腫瘤部位,其攜帶的光熱劑IR-820 和CSF1R-siRNA 有效富集并在激光照射下發(fā)揮良好的腫瘤殺傷和免疫激活作用。如圖6B 所示, 24 d 內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重均沒有明顯下降,說明納米顆粒對小鼠相對安全,小鼠對此治療方法具有較好的耐受。
各組小鼠腫瘤組織的HE 染色結(jié)果(圖6C)顯示, RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser 組有明顯的腫瘤細(xì)胞核碎裂和溶解,其中, MEVs@RNPs+Laser 組的腫瘤細(xì)胞凋亡更明顯。采用TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡情況,可將凋亡細(xì)胞核標(biāo)記為紅色熒光。各組小鼠腫瘤組織的TUNEL 熒光染色結(jié)果顯示, PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、MEVs@RNPs 組均沒有明顯的紅色熒光, RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser組可見明顯的紅色熒光標(biāo)記,并且MEVs@RNPs+Laser 組的紅色熒光分布更強(qiáng),表明凋亡細(xì)胞數(shù)量更多。上述研究結(jié)果表明, MEV@RNPs 介導(dǎo)的光熱免疫療法對腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用,能夠有效增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。
腫瘤微環(huán)境中的M1 型巨噬細(xì)胞比例的增加會促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子TNF-α和IL-12 分泌,同時也會進(jìn)一步促進(jìn)T 細(xì)胞激活和增殖,從而發(fā)揮強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)作用。分離小鼠皮下瘤組織并通過流式細(xì)胞儀測定腫瘤組織中M1 型巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞的比例,結(jié)果顯示(圖7A 和7B), MEVs@RNPs+Laser 組中M1 型巨噬細(xì)胞占比明顯高于RNPs+Laser 組和PBS+Laser 組,而MEVs@RNPs+Laser 組中M2 型巨噬細(xì)胞明顯低于RNPs+Laser 組和PBS+Laser 組,說明MEVs@RNPs向腫瘤部位聚集,搭載的CSF1R-siRNA成功釋放,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化,從而更好地激活機(jī)體免疫功能,發(fā)揮抗腫瘤作用。同時, MEVs@RNPs+Laser 組中CD4+和CD8+ T 細(xì)胞的比例也高于其它組,進(jìn)一步證實(shí)了MEVs@RNPs 具有調(diào)控免疫微環(huán)境的功能。
采用ELISA 法測定各組小鼠外周血中TNF-α和IL-12 的濃度,結(jié)果如圖7C 所示。RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser 組中T 細(xì)胞活化相關(guān)因子TNF-α和IL-12 的濃度均高于PBS+Laser 組,并且MEVs@RNPs+Laser 組高于RNPs+Laser 組,證明外泌體修飾后可以更好地促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子的分泌,激活抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能。
3 結(jié)論
本研究基于M1 型巨噬細(xì)胞來源外泌體的生物相容性和腫瘤歸巢效應(yīng),成功地將其修飾于搭載有光熱劑IR-820 和CSF-1R-siRNA 的顆粒骨架上,制備了兼具光熱治療和免疫調(diào)控效應(yīng)的多功能基因遞送系統(tǒng)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明, MEVs@RNPs 借助其表面的M1 型巨噬細(xì)胞外泌體顯著提高了治療性載體的腫瘤細(xì)胞靶向性,同時其攜帶的CSF1R-siRNA 可有效促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型,促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子TNF-α和IL-12 的分泌,激活T 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,從而進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤光熱治療效果。本研究為TNBC 治療型藥物的研發(fā)提供了新思路。
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M1型巨噬細(xì)胞衍生納米囊泡介導(dǎo)三陰性乳腺癌光熱-免疫治療的研究
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