M1 型巨噬細(xì)胞衍生納米囊泡介導(dǎo)三陰性乳腺癌光熱-免疫治療的研究

摘要 光熱治療作為一種新型的抗腫瘤治療策略，單獨(dú)用于抗腫瘤治療時靶向性不足，穿透能力有限，無法實(shí)現(xiàn)長期抑制。本研究將M1 型巨噬細(xì)胞外泌體（MEVs）修飾于搭載有CSF1R-siRNA 和光熱劑的載體表面制備多功能基因遞送載體MEVs@RNPs，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型，實(shí)現(xiàn)三陰性乳腺癌（TNBC）的高效光熱-免疫治療。采用納米粒度儀、紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計和測溫?zé)岢上駜x對納米顆粒的理化性質(zhì)進(jìn)行測定。以TNBC 細(xì)胞4T1、內(nèi)皮細(xì)胞Bend3 和巨噬細(xì)胞RAW264.7 為體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，考察了MEVs@RNPs 體外靶向腫瘤細(xì)胞、殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞重編程的能力。選擇Balb/c 小鼠建立皮下移植瘤模型，測定不同處理組腫瘤體積和體重的變化。分離小鼠血液和腫瘤組織，采用蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin（HE））染色、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（Terminal deoxynucleotidyl transferasedUTP nick end labeling， TUNEL）、酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法測定腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果表明， MEVs@RNPs 可優(yōu)先靶向至腫瘤細(xì)胞，并在光熱條件下誘導(dǎo)更強(qiáng)的TNBC 細(xì)胞殺傷效果。流式細(xì)胞術(shù)和ELISA 法測定結(jié)果顯示， MEVs@RNPs 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M2型向抗腫瘤的M1 型轉(zhuǎn)化，并顯著提高抗腫瘤細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）的分泌水平。MEVs@RNPs 的體內(nèi)抗腫瘤治療效果評估結(jié)果顯示，在激光照射條件下， MEVs@RNPs 組可以顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞病理性壞死和凋亡，促進(jìn)巨噬細(xì)胞重編程和CD4+/CD8+ T 細(xì)胞向腫瘤部位浸潤，提高TNF-α和IL-12 的分泌水平，從而全面提高TNBC 的治療效果。

關(guān)鍵詞 光熱治療；免疫治療；外泌體；巨噬細(xì)胞；重編程；三陰性乳腺癌

乳腺癌是女性群體中最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤之首[1]。三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer， TNBC）因缺乏雌激素和孕激素受體以及人類表皮生長因子受體2 的表達(dá)而得名，是乳腺癌中最具侵襲性的亞型[2-3]，其致死率、復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移潛能均高于其它亞型，一直是乳腺癌治療領(lǐng)域的難點(diǎn)，目前臨床尚缺乏有效的治療策略[4]。光熱治療（Photothermal therapy， PTT）作為一種新型微創(chuàng)的治療方式，相較于傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)治療等方式[5-6]，具有治療時間短、療效顯著和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[7]，在腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛的研究和關(guān)注。PTT 療法的關(guān)鍵是將具有光熱轉(zhuǎn)換效率的材料導(dǎo)入至腫瘤部位，在特定波長的光照射下，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特定殺傷[8]。然而，單一的PTT 療法應(yīng)用于腫瘤治療仍面臨諸多限制，如光熱材料的遞送效率和腫瘤組織的穿透性仍有待提升、非特異性殺傷問題需進(jìn)一步優(yōu)化、腫瘤長期抑制效果有待提高等[9]。針對上述問題，研究者將PTT 療法與其它療法聯(lián)合應(yīng)用，在有效克服PTT 療法自身局限性的同時，實(shí)現(xiàn)多種治療方式的協(xié)同增效，為多模式聯(lián)合應(yīng)用策略的開發(fā)提供了新的思路[10]。

研究表明，腫瘤抗原可誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答能力，與其它治療策略相結(jié)合，可顯著提升抗腫瘤治療效果并實(shí)現(xiàn)長效抗腫瘤作用[11-12]。巨噬細(xì)胞（Macrophage）是一種在血液和組織中分布較廣泛的免疫細(xì)胞，可在不同的信號和微環(huán)境的刺激下進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換，發(fā)揮重要的免疫作用[13]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associated macrophage， TAM）是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞群之一，根據(jù)功能不同分為M1 型和M2 型，其中， M1 型巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞1 型（T helper cell 1， Th1）反應(yīng)，發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤活性；M2 型巨噬細(xì)胞與M1 型作用相反，主要發(fā)揮促腫瘤活性[14]。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞多以M2 型巨噬細(xì)胞為主，可介導(dǎo)免疫抑制性因子的分泌和表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤部位血管生成等，多途徑“主動”發(fā)揮促腫瘤和免疫抑制效應(yīng)[15-18]。因此，針對巨噬細(xì)胞不同表型所呈現(xiàn)的截然不同的功能，采用調(diào)控巨噬細(xì)胞向M1 型重編程或抑制M2 型活性的策略，有望逆轉(zhuǎn)腫瘤部位的免疫抑制微環(huán)境。集落刺激因子1 受體（Colony-stimulating factor 1 receptor， CSF1R）又稱CD115，直接參與巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控，激活TAMs 中M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長[19]。利用CSF1R-小干擾核糖核酸（CSF1R-small interfering RNA， CSF1R-siRNA）抑制CSF1R 的活性，阻斷CSF1/CSF1R 信號通路，可以降低M2 型巨噬細(xì)胞比例，促進(jìn)其向抗腫瘤的M1 型巨噬細(xì)胞重編程[20]，從而增強(qiáng)抗腫瘤治療效果?；诖?，利用siRNA 抑制CSF1R 表達(dá)導(dǎo)致CSF1/CSF1R 信號通路阻斷的原理，將M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型巨噬細(xì)胞，再與PTT 相結(jié)合，有望成為TNBC 的有效治療策略。

如將上述兩種治療策略相結(jié)合，首先需要解決如何將相關(guān)藥物或載體高效靶向遞送至腫瘤部位，并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)釋放等問題[ 21-23]。近年來，仿生策略的發(fā)展為解決上述問題提供了可行性方案。外泌體（Exosomes）來源于活細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷而形成多囊泡體，并與細(xì)胞膜融合后釋放于胞外基質(zhì)中，是粒徑為50～150 nm 的脂質(zhì)雙分子層納米級膜性囊泡[24-25]，其中， TSG101、CD9 和CD81 常作為外泌體分離和鑒定的標(biāo)志物[26]。外泌體繼承了母細(xì)胞的天然靶向和特異識別性能，因具有低免疫原性（可用于同種異體治療）、低毒性、可提高藥物的生物利用度和靶向歸巢特性等優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注，已成功應(yīng)用于腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性腎病等多種疾病的治療研究[27-28]。巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞之一，其來源的外泌體因具有天然的生物相容性和靶向性而被開發(fā)成遞送治療性藥物或載體，用于多種疾病的治療，其中， M1 型巨噬細(xì)胞來源的外泌體具有將藥物精準(zhǔn)遞送至腫瘤部位的潛能[29]，可作為理想的藥物遞送載體助力TNBC 的精準(zhǔn)、高效治療。

本研究基于M1 型巨噬細(xì)胞來源的外泌體的腫瘤歸巢效應(yīng)[30-31]，將其修飾于搭載有近紅外光熱劑IR-820 和CSF1R-siRNA 的顆粒骨架外，形成多功能基因遞送系統(tǒng)MEVs@RNPs （其中， MEVs 代表M1 型巨噬細(xì)胞外泌體；NPs 代表納米顆粒（Nanoparticles）；RNPs 代表包載IR-820 和CSF1R-siRNA 的納米顆粒），可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型，重塑腫瘤部位免疫抑制性微環(huán)境，結(jié)合IR-820的光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對TNBC 的高效光熱-免疫治療。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CS150FNX 型超速離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；ZS90 型納米粒度電位儀（英國Malvern 公司）；UH-100B 型超聲波細(xì)胞破碎儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN 型透射電子顯微鏡（美國FEI 公司，工作電壓200 kV）；Evolution One Plus 紫外可見分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；F-7100 熒光分光光度計（日本日立公司）；HM-TPH11-3AXF 手持測溫?zé)岢上駜x（杭州?？低晹?shù)字技術(shù)股份有限公司）；808 nm 激光器（北京宏藍(lán)光電科技有限公司）；Beckman Moflo-XDP 流式細(xì)胞儀（上海貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）。

磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-胺（DSPE-PEG（2000）Amine，美國Avanit 公司）；琥珀酰亞胺基丙酸酯（N-Succinimidyl 3-（2-pyridyldithio）propionate， SPDP）、DSPE-PEG-Maleimide（DSPE-PEG-MAL）和焦碳酸二乙酯（DEPC）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）；M5Hiper CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒、M5 HiPer Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）；Calcein-AM/PI Double Stinging Kit（東仁化學(xué)科技（上海）有限公司）；VEX ExosomeIsolation Reagent（From cell culture media）、One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit （10%） （南京諾唯贊生物科技有限公司）；IR-820（阿拉丁生化科技股份有限公司）；CSF1R-siRNA 由通用生物（安徽）股份有限公司合成；脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS，美國Sigma 公司）；FITC anti-mouse CD86、PE anti-mouseCD206 和PE anti-mouse CD80（BIOLEGEND 生物科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

實(shí)驗(yàn)所用的巨噬細(xì)胞株RAW264.7 和TNBC 細(xì)胞株4T1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；BALB/c 小鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。本研究已獲得煙臺毓璜頂醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞外泌體的提取

將處于對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞RAW264.7 接種于150 mm2 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度約為60%～70%時，向其中加入LPS（50 ng/mL），刺激處理24 h[32]，收集細(xì)胞，使用流式抗體PE-CD80 和FITCCD86進(jìn)行標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測M1 型巨噬細(xì)胞的比例，驗(yàn)證其已被誘導(dǎo)成為M1 型巨噬細(xì)胞。更換新鮮無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為80%～95%，收集上清液并進(jìn)行過濾，離心（4 ℃，5600 r/min， 20 min），去除細(xì)胞碎片殘留。緩慢吸取上清液至新的離心管中，并向其中加入1/3 上清液體積的VEX Exosome Isolation Reagent（from cell culture media），輕輕顛倒混勻至樣本重新恢復(fù)澄清。將混懸液于4 ℃垂直靜置12 h 后進(jìn)行離心（4 ℃，10200 r/min，30 min），棄去上清液，再次離心（4 ℃， 4000 r/min，2 min），完全棄去剩余上清液后，即得到外泌體沉淀，于–80 ℃貯存，備用。采用Western blot 技術(shù)測定外泌體標(biāo)志蛋白CD9、TSG101 及CD81，以確定外泌體成功提取。

1.2.2 仿生納米顆粒MEVs@RNPs 的制備及性能測定

稱取2 mg DSPE-PEG（2000）Amine 和1 mg SPDP 溶于200 μL DMSO 中，向其中加入DEPC 處理的1 ×PBS 緩沖液；在室溫條件下避光振蕩孵育2 h 后，用截留分子量為10 kD的離心超濾管進(jìn)行超濾（4 ℃，4000 r/min，15 min），并用預(yù)冷的DEPC 處理的去離子水離心洗滌3 次；向其中加入DEPC 處理的1 × PBS緩沖液溶解CSF1R-siRNA， 4 ℃反應(yīng)過夜，即得到DSPE-PEG-CSF1R-siRNA。將合成的DSPE-PEG-CSF1RsiRNA與1 mg 光熱劑IR-820、1 mg DSPE-PEG-MAL 溶于1 mL 四氫呋喃（THF）中，迅速將混合物注入2 mL DEPC 處理的去離子水中，在超聲條件下充分混勻，采用10 kD 超濾管超濾離心（4 ℃， 4000 r/min，15 min），用預(yù)冷的DEPC 處理的去離子水離心洗滌3 次，即得到RNPs，于4 ℃貯存，備用。將上述制備提取的RNPs在電轉(zhuǎn)儀的輔助下導(dǎo)入至外泌體中，得到多功能基因遞送載體MEVs@RNPs（圖1）。

1.2.3 MEVs@RNPs 溶液的光熱性能測定

采用測溫?zé)岢上駜x監(jiān)測不同溶液的溫度變化情況。首先，在5 個相同的離心管中，分別加入1 mL0.2 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液，調(diào)整808 nm 激光器的功率分別為0.25、0.50、0.75 和1.00 W/cm2，照射上述溶液，每10 s 記錄一次溶液的溫度，繪制同一濃度的MEVs@RNPs 在不同功率激光照射下的升溫曲線。分別將0.05、0.10、0.20 和0.40 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液置于離心管中，以去離子水作為對照，并用808 nm 激光（0.5 W/cm2）進(jìn)行照射，每10 s 記錄一次溶液溫度，繪制不同濃度的MEVs@RNPs 溶液在同一功率激光照射下的升溫曲線圖。采用測溫?zé)岢上駜x監(jiān)測0.2 mg/mL MEVs@RNPs 溶液經(jīng)過808 nm激光（0.5 W/cm2）照射5 min 的溫度變化，每10 s 記錄一次溶液溫度，繪制時間-溫度曲線圖，并記錄不同時間點(diǎn)的熱成像圖。

1.2.4 MEVs@RNPs 的安全性及抗腫瘤效果的體外驗(yàn)證

將RNPs、MEVs@RNPS和MEVs 分別用含1% PMSF 的RIPA 裂解液進(jìn)行冰浴裂解25 min。將裂解產(chǎn)物離心（4 ℃，12100 r/min，5 min）后棄去沉淀，取上清液與適當(dāng)體積比的蛋白上樣緩沖液充分混合，于100 ℃金屬浴中升溫變性5 min 后，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，測定外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD9、TSG101和CD81。

將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞4T1 細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞Bend 3 接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為50%時，將納米材料RNPs 和MEVs@RNPs 分別加入到上述接種細(xì)胞的共聚焦小皿中，孵育30 min 后，使用DAPI 染液（即用型）染色，隨后置于熒光顯微鏡下觀察。

在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)4T1 細(xì)胞至細(xì)胞匯合度約為80%時，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的MEVs@RNPs（0、0.05、0.10、0.20 和0.50 mg/mL）的完全培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；棄去培養(yǎng)基，各孔加入100 μL 含10% CCK-8 的完全培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min 后，使用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 處的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

將4T1 細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞匯合度約為80%時，棄去培養(yǎng)基，分別加入含10 μg/mL RNPs和10 μg/mL MEVs@RNPs 的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h 后，實(shí)驗(yàn)組使用808 nm 激光（0.5 W/cm2）照射10 min（控制溫度低于43 ℃），對照組避光處理。將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)12 h。根據(jù)Calcein-AM/PI Double Stinging Kit 試劑盒說明書對各實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行Calcein-AM/PI 染色處理，使用全自動倒置熒光顯微鏡觀察不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。

將4T1 細(xì)胞以1×106 個/孔接種至12 孔板中，在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入含10 μg/mL RNPs 和10 μg/mL MEVs@RNPs 的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用808 nm 激光（0.5 W/cm2）照射實(shí)驗(yàn)孔10 min，對照組避光處理。繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。收集各組細(xì)胞并使用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗3 次后，按照M5 HiPer Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。

1.2.5 MEVs@RNPs 體外免疫激活實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞RAW264.7 分別接種于含10 μg/mL RNPs 和10 μg/mL MEVs@RNPs完全培養(yǎng)基的6 孔板中，并設(shè)置對照組，于37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集巨噬細(xì)胞并用PBS緩沖液離心清洗3 次。通過流式抗體FITC-CD86 和PE-CD206 對上述分組的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞的比例。收集上述孵育后的上清液，離心去除細(xì)胞碎片，使用ELISAMAXTM Deluxe Set Mouse TNF-α和ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 試劑盒對各組上清液中TNF-α和IL-12 的含量進(jìn)行測定。

1.2.6 MEVs@RNPs 體內(nèi)抗腫瘤和免疫效果評價

小動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分參照煙臺毓璜頂醫(yī)院倫理委員會的相關(guān)制度開展實(shí)驗(yàn)（倫理批準(zhǔn)號：2024-717）。將4T1 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度約為90%時，用胰酶消化；將細(xì)胞收集至15 mL 離心管中，以PBS 清洗2 次后，制成細(xì)胞懸液。將200 μL 細(xì)胞懸液（2 × 107 cell/mL）注入雌性Balb/c 小鼠右側(cè)大腿上部皮下，每3 d 監(jiān)測一次小鼠體表腫瘤體積，并記錄小鼠的體重。腫瘤體積公式：V = L×W2×0.5（其中， L 代表腫瘤的長度， W 代表腫瘤的寬度）。

以上述構(gòu)建的小鼠TNBC 皮下移植瘤模型為基礎(chǔ)，待腫瘤生長至適宜大小（～100 mm3），將其隨機(jī)分為6 組（每組5 只）：PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、RNPs+Laser 組、MEVs@RNPs 組、MEVs@RNPs+Laser 組。所有小鼠均以尾靜脈注射的方式注入0.2 mL 的PBS 或納米顆粒溶液（200 μg/mL），小鼠飼喂24 h 后，激光照射組（+Laser 組）采用808 nm 激光（0.5 W/cm2）照射10 min。光熱治療7 d 后，通過眼眶取血法分離小鼠血液，并麻醉脫頸處死小鼠以分離皮下腫瘤。將上述分離的各組皮下腫瘤組織用多聚甲醛固定，切片處理后分別進(jìn)行HE 染色和TUNEL 熒光染色，并置于熒光顯微鏡下觀察；使用ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse TNF-α和ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 試劑盒檢測各組小鼠血清中的TNF-α和IL-12濃度。此外，將同批次的各處理組分離的皮下腫瘤進(jìn)行組織研磨和消化后，加入含2%胎牛血清的PBS 緩沖液離心清洗（2000 r/min，5 min），并用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞， PBS 緩沖液洗滌沉淀后進(jìn)行重懸。加入流式抗體對重懸后細(xì)胞中的M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞和CD4＋、CD8＋ T 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究涉及的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0 軟件和Origin 2021 軟件進(jìn)行分析和圖形繪制，其中，計數(shù)資料以百分比（%）表示，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不同組之間的比較采用單因素方差分析，plt;0.05 表示差異性顯著且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 MEVs@RNPs 的表征及性能測定

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS 處理后RAW264.7 向M1 型巨噬細(xì)胞極化情況的結(jié)果（見電子版文后支持信息圖S1）表明，經(jīng)過誘導(dǎo)處理后，共孵育體系中M1 型巨噬細(xì)胞比例達(dá)到82.7%。

將提取的M1 型巨噬細(xì)胞外泌體修飾于搭載了CSF1R-siRNA 和光熱劑IR-820 的納米顆粒表面，形成具有調(diào)控M2 型巨噬細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)化和介導(dǎo)光熱轉(zhuǎn)換能力的多功能基因遞送載體MEVs@RNPs。

由RNPs 和MEVs@RNPs 的TEM 圖（見電子版文后支持信息圖S2）可見，二者均為典型的球狀結(jié)構(gòu)，在MEVs@RNPs 外層有一層膜狀結(jié)構(gòu)。納米粒度電位儀測定結(jié)果顯示， RNPs 的水合粒徑為（102.88±4.19） nm， MEVs@RNPs 的水合粒徑為（123.75±5.07） nm，較RNPs 的粒徑增加約21 nm，并且粒徑分布較集中（圖2A）。RNPs 的Zeta 電位為–（1.59±0.08） mV，而MEVs@RNPs 的Zeta 電位為–（14.67±0.57） mV（圖2B）， Zeta 電位明顯降低，可能由于外泌體帶有更多的負(fù)電荷[33]，外泌體修飾后會使電位的絕對值增加。上述結(jié)果表明， M1 型巨噬細(xì)胞的外泌體已成功修飾在RNPs 表面，成功制備了載體MEVs@RNPs。在納米顆粒的紫外-可見-近紅外吸收光譜（圖2C）中， RNPs 的最大吸收波長約為693 nm，而MEVs@RNPs的最大吸收峰紅移至705 nm。熒光發(fā)射光譜（圖2D）顯示， RNPs 的最大熒光發(fā)射波長約為864.4 nm，MEVs@RNPs 的最大熒光發(fā)射波長紅移至873.2 nm。

2.2 MEVs@RNPs 溶液的光熱性質(zhì)測定

基于MEVs@RNPs 溶液在650～750 nm 范圍內(nèi)有良好的近紅外吸收特性，進(jìn)一步考察了MEVs@RNPs溶液的光熱性質(zhì)。如圖3A 和3B 所示，隨著照射功率增加， 0.2 mg/mL 的MEVs@RNPs 溶液的溫度呈明顯升高趨勢；在同一功率激光照射下，不同濃度（0.05～0.40 mg/mL）的MEVs@RNPs 溶液溫度隨濃度增大也呈現(xiàn)明顯升高趨勢，而對照組去離子水的溫度無明顯變化。為進(jìn)一步研究MEVs@RNPs 溶液的光熱性質(zhì)，監(jiān)測了激光持續(xù)照射下MEVs@RNPs 溶液的升溫-降溫變化。如圖3C 所示，在照射初期，溶液溫度隨照射時間延長而逐步提升，在約220 s 時達(dá)到最高（46.6 ℃），并在此溫度附近維持約100 s，隨后逐漸降低。通過測溫?zé)岢上駜x進(jìn)行更直觀的溫度監(jiān)測，由圖3D 可見，隨著照射時間延長， MEVs@RNPs 溶液的溫度持續(xù)升高。上述結(jié)果證明， MEVs@RNPs 具有良好的光熱性能。

2.3 MEVs@RNPs 的體外抗腫瘤效果評價

為證明外泌體已成功修飾于MEVs@RNPs 表面，分別測定MEVs@RNPs、MEVs 和RNPs 組中的外泌體標(biāo)志蛋白CD9、TSG101 及CD81。如圖4A 所示，除RNPs 組無相關(guān)蛋白條帶外， MEVs@RNPs 組和MEVs 組均可檢測到明顯的標(biāo)志性蛋白，表明外泌體已成功修飾于RNPs 表面。通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞4T1 細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞Bend 3 對MEVs@RNPs 的攝取情況。本研究中， CSF1R-siRNA 帶有CY5紅色熒光標(biāo)簽，因此，可以通過觀察共孵育體系中細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光信號的強(qiáng)弱來評價4T1 細(xì)胞對MEVs@RNPs 的攝取能力。如圖4B 所示，與RNPs 和MEVs@RNPs 共孵育后， Bend 3 細(xì)胞內(nèi)均幾乎未見紅色熒光， RNPs 組4T1 細(xì)胞中有較弱的紅色熒光信號，而MEVs@RNPs 組4T1 細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色熒光信號，這是由于腫瘤細(xì)胞相較于非腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞攝取能力[34]，而外泌體的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步提高了腫瘤細(xì)胞對納米材料的攝取效率。

通過CCK-8 法測定不同濃度的MEVs@RNPs 對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見電子版文后支持信息圖S3，MEVs@RNPs 溶液濃度在0.05～0.50 mg/mL 范圍內(nèi)， 4T1 細(xì)胞的存活率均大于90%，說明MEVs@RNPs 對細(xì)胞具有良好的生物安全性。

使用流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行定量檢測，以評價納米材料的促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。如圖4C 所示，未給予激光照射的RNPs 組和MEVs@RNPs 組細(xì)胞凋亡比例均較低，分別為0.75%和0.98%；給予激光照射后， RNPs 組和MEVs@RNPs 組細(xì)胞凋亡比例分別為16.1%和28.6%，相較于對照組（0.78%）明顯增高，并且MEVs@RNPs 組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果更佳，進(jìn)一步證明了MEVs@RNPs 在體外對腫瘤細(xì)胞具有良好的光熱殺傷效果。

進(jìn)一步考察了MEVs@RNPs 介導(dǎo)的光熱治療效果。采用鈣黃綠素/碘化丙啶（AM/PI）染色法對納米材料處理后的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光顯微鏡觀察納米顆粒在體外對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。鈣黃綠素（AM）只對活細(xì)胞進(jìn)行染色，呈現(xiàn)綠色熒光；碘化丙啶（PI）只對凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，呈現(xiàn)紅色熒光。如圖4D 所示，在無激光照射條件下， RNPs 組和MEVs@RNPs 組的腫瘤細(xì)胞與PBS 對照組一致，均呈現(xiàn)綠色熒光，說明RNPs 組和MEVs@RNPs 組均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞殺傷能力。經(jīng)808 nm 激光照射后， RNPs組和MEVs@RNPs 組均出現(xiàn)明顯的紅色熒光，并且MEVs@RNPs 組的紅色熒光更明顯，表明MEVs@RNPs介導(dǎo)的光熱治療對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。

2.4 體外免疫調(diào)節(jié)效果評價

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一，而腫瘤部位的巨噬細(xì)胞主要以M2 型為主，這也是導(dǎo)致腫瘤部位巨噬細(xì)胞“不作為”的主要原因。因此，將巨噬細(xì)胞由促腫瘤的M2 型重編程為抗腫瘤的M1 型，是實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤的關(guān)鍵[35]。在體外抗腫瘤效果評價的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評價了MEVs@RNPs 的免疫調(diào)節(jié)能力。通過流式細(xì)胞儀檢測不同處理組巨噬細(xì)胞RAW264.7 的表型變化，以評價其對巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)的作用。如圖5A 所示， MEVs@RNPs 組中的M1 型巨噬細(xì)胞比例顯著高于RNPs 組和PBS 組，MEVs@RNPs 組的M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯低于RNPs 組和PBS 組。上述結(jié)果表明，搭載CSF1R-siRNA的MEVs@RNPs 可使M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型。

為了進(jìn)一步評價MEVs@RNPs 的免疫調(diào)節(jié)功能，測定了不同處理組巨噬細(xì)胞RAW 264.7 促炎因子（TNF-α和IL-12 等）的分泌情況。通過ELISA 法測定不同處理組RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TNF-α和IL-12 的濃度。如圖5B 所示， RNPs 組的TNF-α和IL-12 的表達(dá)量分別為191.39 和217.23 pg/mL，MEVs@RNPs 組的TNF-α和IL-12 的表達(dá)量分別為315.56 和427.62 pg/mL，均較PBS 組明顯增高，并且MEVs@RNPs 組的細(xì)胞因子濃度較RNPs 組更高，表明MEVs@RNPs 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌和釋放促炎因子，從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2.5 MEV@RNPs 體內(nèi)抗腫瘤治療和免疫調(diào)節(jié)效果評價

為了進(jìn)一步考察基于MEVs@RNPs 的光熱免疫療法在體內(nèi)的治療效果，對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組處理，結(jié)果如圖6A 所示。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理后的24 d 內(nèi)， PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs 組小鼠的腫瘤體積呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，但MEVs@RNPs+Laser 組的小鼠腫瘤體積明顯被抑制并呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因?yàn)镸1 型巨噬細(xì)胞外泌體的腫瘤歸巢效應(yīng)，使得MEVs@RNPs 高效聚集于小鼠腫瘤部位，其攜帶的光熱劑IR-820 和CSF1R-siRNA 有效富集并在激光照射下發(fā)揮良好的腫瘤殺傷和免疫激活作用。如圖6B 所示， 24 d 內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重均沒有明顯下降，說明納米顆粒對小鼠相對安全，小鼠對此治療方法具有較好的耐受。

各組小鼠腫瘤組織的HE 染色結(jié)果（圖6C）顯示， RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser 組有明顯的腫瘤細(xì)胞核碎裂和溶解，其中， MEVs@RNPs+Laser 組的腫瘤細(xì)胞凋亡更明顯。采用TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡情況，可將凋亡細(xì)胞核標(biāo)記為紅色熒光。各組小鼠腫瘤組織的TUNEL 熒光染色結(jié)果顯示， PBS 組、PBS+Laser 組、RNPs 組、MEVs@RNPs 組均沒有明顯的紅色熒光， RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser組可見明顯的紅色熒光標(biāo)記，并且MEVs@RNPs+Laser 組的紅色熒光分布更強(qiáng)，表明凋亡細(xì)胞數(shù)量更多。上述研究結(jié)果表明， MEV@RNPs 介導(dǎo)的光熱免疫療法對腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用，能夠有效增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。

腫瘤微環(huán)境中的M1 型巨噬細(xì)胞比例的增加會促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子TNF-α和IL-12 分泌，同時也會進(jìn)一步促進(jìn)T 細(xì)胞激活和增殖，從而發(fā)揮強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)作用。分離小鼠皮下瘤組織并通過流式細(xì)胞儀測定腫瘤組織中M1 型巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示（圖7A 和7B）， MEVs@RNPs+Laser 組中M1 型巨噬細(xì)胞占比明顯高于RNPs+Laser 組和PBS+Laser 組，而MEVs@RNPs+Laser 組中M2 型巨噬細(xì)胞明顯低于RNPs+Laser 組和PBS+Laser 組，說明MEVs@RNPs向腫瘤部位聚集，搭載的CSF1R-siRNA成功釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化，從而更好地激活機(jī)體免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。同時， MEVs@RNPs+Laser 組中CD4＋和CD8＋ T 細(xì)胞的比例也高于其它組，進(jìn)一步證實(shí)了MEVs@RNPs 具有調(diào)控免疫微環(huán)境的功能。

采用ELISA 法測定各組小鼠外周血中TNF-α和IL-12 的濃度，結(jié)果如圖7C 所示。RNPs+Laser 組和MEVs@RNPs+Laser 組中T 細(xì)胞活化相關(guān)因子TNF-α和IL-12 的濃度均高于PBS+Laser 組，并且MEVs@RNPs+Laser 組高于RNPs+Laser 組，證明外泌體修飾后可以更好地促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子的分泌，激活抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能。

3 結(jié)論

本研究基于M1 型巨噬細(xì)胞來源外泌體的生物相容性和腫瘤歸巢效應(yīng)，成功地將其修飾于搭載有光熱劑IR-820 和CSF-1R-siRNA 的顆粒骨架上，制備了兼具光熱治療和免疫調(diào)控效應(yīng)的多功能基因遞送系統(tǒng)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明， MEVs@RNPs 借助其表面的M1 型巨噬細(xì)胞外泌體顯著提高了治療性載體的腫瘤細(xì)胞靶向性，同時其攜帶的CSF1R-siRNA 可有效促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞重編程為M1 型，促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子TNF-α和IL-12 的分泌，激活T 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，從而進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤光熱治療效果。本研究為TNBC 治療型藥物的研發(fā)提供了新思路。

References

[1] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Ca-Cancer J. Clin. ， 2020， 70（1）： 7-30.

[2] FOULKES W D， SMITH I E， REIS-FILHO J S. N. Engl. J. Med. ， 2010， 363（20）： 1938-1948.

[3] PRAT A， PINEDA E， ADAMO B， GALVáN P， FERNANDEZ A， GABA L， DIEZ M， VILADOT M， ARANCE A， MUNOZ M. Breast， 2015， 24： S26-S35.

[4] GUPTA G K， COLLIER A L， LEE D， HOEFER R A， ZHELEVA V， REESEMA L， VAN REESEMA L S L TANG-TAN A M， GUYE M L， CHANG D Z， WINSTON J S， SAMLI B， JANSEN R J， PETRICOIN E F， GOETZ M P， BEAR H D， TANG A H. Cancers， 2020， 12（9）： 2392.

[5] AGHANEJAD A， JALILIAN A R， FAZAELI Y， BEIKI D， FATEH B， KHALAJ A. J. Radioanal. Nucl. Chem. ， 2014， 299（3）：1635-1644.

[6] AGHANEJAD A， JALILIAN A R， MAUS S， YOUSEFNIA H. Iran. J. Nucl. Med. ， 2016， 24（1）： 29-36.

[7] BARDHAN R， LAL S， JOSHI A， HALAS N J. Acc. Chem. Res. ， 2011， 44（10）： 936-946.

[8] HUANG X， JAIN P K， EL-SAYED I H， EL-SAYED M A. Lasers Med. Sci. ， 2008， 23（3）： 217-228.

[9] YANG Q， PENG J， SHI K， XIAO Y， LIU Q， HAN R， QIAN Z. J. Controlled Release， 2019， 308： 29-43.

[10] QIU Q， LI C， YAN X， ZHANG H， LUO X， GAO X， LIU X， SONG Y， DENG Y. Biomaterials， 2021， 269： 120652.

[11] XU P， LIANG F. Int. J. Nanomed. ， 2020， 15： 9159-9180.

[12] ZHANG M， DAI Z， THEIVENDRAN S， GU Z， ZHAO L， SONG H， YANG Y， YU C. Nano Today， 2021， 36： 101035.

[13] ALLAVENA P， SICA A， SOLINAS G， PORTA C， MANTOVANI A. Crit. Rev. Oncol. Hematol. ， 2008， 66（1）： 1-9.

[14] HAN C， ZHANG C， WANG H， ZHAO L. Oncoimmunology， 2021， 10（1）： 1887552.

[15] FUJIWARA T， FUKUSHI J， YAMAMOTO S， MATSUMOTO Y， SETSU N， ODA Y， YAMADA H， OKADA S， WATARI K，ONO M， KUWANO M， KAMURA S， IIDA K， OKADA Y， KOGA M， IWAMOTO Y. Am. J. Pathol. ， 2011， 179（3）： 1157-1170.

[16] BERGHUIS D， SANTOS S J， BAELDE H J， TAMINIAU A H， EGELER R M， SCHILHAM M W， HOGENDOORN P C，LANKESTER A C. J. Pathol. ， 2011， 223（3）： 347-357.

[17] MAJZNER R G， SIMON J S， GROSSO J F， MARTINEZ D， PAWEL B R， SANTI M， MERCHANT M S， GEOERGER B，HEZAM I， MARTY V， VIELH P， DAUGAARD M， SORENSEN P H， MACKALL C L， MARIS J M. Cancer， 2017， 123（19）：3807-3815.

[18] STAHL D， GENTLES A J， THIELE R， GUTGEMANN I. Oncoimmunology， 2019， 8（12）： e1674113.

[19] STANLEY E R， CHITU V. Cold Spring Harbor Perspect. Biol. ， 2014， 6（6）： a021857.

[20] DUAN Z， LUO Y. Signal Transduction Targeted Ther. ， 2021， 6（1）： 127.

[21] WOLFRAM J， ZHU M， YANG Y， SHEN J， GENTILE E， PAOLINO D， FRESTA M， NIE G， CHEN C， SHEN H， FERRARI M， ZHAO Y. Curr. Drug Targets， 2015， 16（14）： 1671-1681.

[22] KIM M， LEE J H， NAM J M. Adv. Sci. ， 2019， 6（17）： 1900471.

[23] FENG X， XU W， LI Z， SONG W， DING J， CHEN X. Adv. Sci. ， 2019， 6（17）： 1900101.

[24] CABY MP， LANKAR D， VINCENDEAU-SCHERRER C， RAPOSO G， BONNEROT C. Int. Immunol. ， 2005， 17（7）： 879-887.

[25] PISITKUN T， SHEN R F， KNEPPER M A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ， 2004， 101（36）： 13368-13373.

[26] ZHANG W， WEN L， DU L， LIU T， SUN Y， CHEN Y， LU Y X， CHENG X， SUN H， XIAO F J， WANG L. J. Nanobiotechnol. ，2024， 22（1）： 662.

[27] BATRAKOVA E V， KIM M S. J. Controlled Release， 2015， 219： 396-405.

[28] RANA S， Z?LLER M. Biochem. Soc. Trans. ， 2011， 39： 559-562.

[29] RAYAMAJHI S， NGUYEN T D T， MARASINI R， ARYAL S. Acta Biomater. ， 2019， 94： 482-494.

[30] WANG S， LI F， YE T， WANG J， LYU C， QING S， DING Z， GAO X， JIA R， YU D， REN J， WEI W， MA G. Sci. Transl. Med. ，2021， 13（615）： eabb6981.

[31] CHEN J， TAN Q， YANG Z， JIN Y. J. Nanobiotechnol. ， 2022， 20（1）： 132.

[32] HE P C， DAI M X， LI Z P， WANG X Y， LIU H Y， HE Y X， JIANG H. Medicine， 2024， 103（15）： e37811.

[33] CHEN J， ZHENG M， XIAO Q， WANG H， CHI C， LIN T， WANG Y， YI X， ZHU L. Micromachines， 2024， 15（5）： 630.

[34] URBANO-GAMEZ J D， GUZZI C， BERNAL M， SOLIVERA J， MARTINEZ-ZUBIAURRE I， CARO C， GARCIAMARTIN M L. Int. J. Mol. Sci. ， 2024， 52（10）： 5213.

[35] CHEN T， WANG M， CHEN Y， LIU Y. Cancer Cell Int. ， 2024， 24（1）： 133.

煙臺市科技計劃項(xiàng)目（No. 2022MSGY074）資助。

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M1型巨噬細(xì)胞衍生納米囊泡介導(dǎo)三陰性乳腺癌光熱-免疫治療的研究

郭彥敏 劉杰 李瑋 王鴻玲