大腸桿菌胞外多糖/萬古霉素聯(lián)用抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜性能分析

摘要 細(xì)菌生物膜的形成是導(dǎo)致細(xì)菌感染性疾病難以治療的主要原因之一，因此開發(fā)有效的抗生物膜策略對于藥物研發(fā)和臨床治療具有重要的意義。盡管抗生素是臨床治療細(xì)菌感染的重要手段，但在治療與細(xì)菌生物膜相關(guān)的疾病時(shí)，其療效通常不佳。本研究提取并純化了大腸桿菌的胞外多糖（E. coli EPS），其能有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜的形成。為了增強(qiáng)萬古霉素（VAN）對生物膜的抑制效果，考察了E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用的效果。相比于單獨(dú)使用VAN， E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用提高了對MRSA 生物膜形成的抑制率，同時(shí)對成熟生物膜的分散率從10%顯著提升至80%。與單獨(dú)使用相同濃度的VAN 相比， VAN 與E. coli EPS 的聯(lián)合使用能夠使生物膜內(nèi)部細(xì)菌菌落數(shù)減少88%。此外， E. coli EPS 可以顯著下調(diào)MRSA 生物膜相關(guān)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明， E. coli EPS 具有良好的抗生物膜活性，與VAN 聯(lián)合使用可作為MRSA 生物膜感染的潛在治療手段。

關(guān)鍵詞 生物膜；大腸桿菌胞外多糖；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；抗生素；生物膜

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）作為一種致病性顯著的革蘭氏陽性病原菌，會(huì)引起骨髓炎[1]、皮膚感染[2]、心內(nèi)膜炎[3]以及菌血癥[4]等多種感染性疾病[5]。世界衛(wèi)生組織已將MRSA 列為高優(yōu)先級細(xì)菌病原體，并將其列為對人類健康構(gòu)成最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)的14 種耐藥菌之一[6-7]。細(xì)菌生物膜是一種細(xì)菌群落定殖后形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[8]，由細(xì)菌細(xì)胞及其分泌的多組分胞外基質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等）構(gòu)成。這種胞外基質(zhì)構(gòu)建了一道物理屏障[9]，極大增強(qiáng)了細(xì)菌對各類抗菌藥物的抵抗力，其耐受性可提高10～1000 倍[10]，導(dǎo)致治療難度增加。MRSA 生物膜的形成與慢性感染緊密相關(guān)，常規(guī)抗菌藥物難以穿透并根除生物膜內(nèi)的細(xì)菌。因此，開發(fā)能夠有效瓦解生物膜的策略已成為治療MRSA 相關(guān)感染的關(guān)鍵。

萬古霉素（Vancomycin， VAN）作為臨床上針對MRSA 相關(guān)感染的首選治療藥物[5]，通常作為嚴(yán)重感染治療的最后手段。然而，相較于對抗浮游態(tài)的細(xì)菌， VAN 在清除MRSA 生物膜時(shí)所需劑量需提升至10 倍以上[5，11]，其毒性也顯著增強(qiáng)[12]，對患者構(gòu)成額外風(fēng)險(xiǎn)。此外， VAN 的過量使用會(huì)加速M(fèi)RSA 耐藥性的發(fā)展[13]，導(dǎo)致VAN 在治療MRSA 相關(guān)感染時(shí)的失敗率高達(dá)35%，臨床療效遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期效果[14]。盡管已有研究嘗試通過聯(lián)合多種抗生素的方案應(yīng)對MRSA 感染[15-16]，但仍不能從根本上解決細(xì)菌耐藥性的問題，而且可能促使細(xì)菌向多重耐藥的方向進(jìn)一步演變。因此，降低抗生素使用量以延緩耐藥性是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。其中，增強(qiáng)MRSA 對VAN 的敏感性被視為一種極具潛力的策略，旨在通過優(yōu)化治療途徑或開發(fā)輔助手段，提高VAN 對MRSA 生物膜的滲透性和殺菌活性，從而在不增加機(jī)體毒性負(fù)擔(dān)的前提下，實(shí)現(xiàn)對MRSA 相關(guān)感染更有效且持久的控制。

近年來，細(xì)菌胞外多糖（Exopolysaccharides， EPS）在細(xì)菌生物膜感染防御機(jī)制中的作用受到了廣泛關(guān)注。研究表明，酵母菌上清液中的EPS 具有抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成的能力，并能有效分散已成熟的生物膜[17]。乳酸桿菌通過其自身分泌的EPS 不僅能抑制MRSA 浮游態(tài)細(xì)菌的生長，還能為宿主細(xì)胞提供保護(hù)屏障，抵御MRSA 的侵襲[18]。擁擠棒狀桿菌產(chǎn)生的EPS 同樣展現(xiàn)出對甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌及MRSA（浮游態(tài)或生物膜形式）的顯著抑制作用[19]。因此，鑒于EPS 對MRSA 生物膜的抑制作用以及不易產(chǎn)生抗性的特點(diǎn)[20]，其有望成為抗生素佐劑，為開發(fā)新型抗生物膜策略提供有力支持[21]。通過深入探索EPS 的作用機(jī)制及其與抗生素的協(xié)同作用，有望為MRSA 相關(guān)感染的治療開辟新的途徑。

本課題組前期研究工作[22]已經(jīng)證明了從大腸桿菌（Escherichia coli， E. coli）菌液中提取的EPS 對銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有顯著的抑制作用，并能有效分散已成熟的生物膜。本研究證明E. coli EPS 對MRSA 生物膜具有同樣優(yōu)異的效果。E. coli EPS 能夠顯著下調(diào)MRSA 中與生物膜相關(guān)的基因表達(dá)，從而有效抑制MRSA 生物膜的形成，并破壞已建立的生物膜結(jié)構(gòu)。而且E. coli EPS 能夠顯著增強(qiáng)MRSA 生物膜對抗生素的敏感性（圖1），在聯(lián)合使用E. coli EPS 后， VAN 對MRSA 生物膜的分散率大幅提升。本研究探索了一種針對MRSA 生物膜的有效干預(yù)策略，揭示了E. coli EPS 作為抗生素增效劑的機(jī)理，為治療包括MRSA 在內(nèi)的多種細(xì)菌生物膜感染提供了新的治療思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Avance 400 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；S-4800 掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad Laboratories 公司）；THZ-D 恒溫振蕩器（太倉試驗(yàn)設(shè)備廠）；SPX-150BIII 生化培養(yǎng)箱（泰斯特公司）；MULTISKAN FC 酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-50E 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

LB 肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；乙醇（百靈威科技有限公司）；透析袋（截留分子量8000～14000 Da，北京索萊寶科技有限公司）；重水（D2O，北京伊諾凱科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS， 10 mmol/L， pH=7.4，武漢賽維爾生物科技有限公司）；結(jié)晶紫（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）；戊二醛（上海麥克林生化科技有限公司）；MH 瓊脂（英國Oxoid 公司）；萬古霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TRIzol（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。MRSA（菌株編號(hào)ATCC 43300）和大腸桿菌（菌株編號(hào)ATCC 25922）均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。本研究所用的核酸引物序列見表1，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 浮游態(tài)細(xì)菌的培養(yǎng)

MRSA 和E. coli 浮游態(tài)細(xì)菌的培養(yǎng)均使用LB 培養(yǎng)基。將細(xì)菌菌落接種到無菌培養(yǎng)基中，放置在搖床上（200 r/min， 37 ℃）培養(yǎng)18～24 h，備用。

1.3 E.coli EPS 的提取

將培養(yǎng)的E. coli 浮游態(tài)細(xì)菌離心（9860 r/min， 5 min），取上清液，加入3 倍體積的乙醇，于4 ℃攪拌過夜；離心（9860 r/min， 15 min）后，用Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L， pH=8.0）溶解沉淀，加入蛋白酶K，置于搖床（200 r/min， 37 ℃）上孵育4 h，再于90 ℃水浴中加熱10 min；加入3 倍體積的乙醇，于4 ℃攪拌過夜；離心（9860 r/min， 15 min），用超純水溶解沉淀，使用截留分子量為8000～14000 Da 的透析袋透析處理2～3 d，將透析液冷凍干燥，凍干粉末用PBS（10 mmol/L， pH=7.4）溶解。

1.4 E.coli EPS 的核磁共振表征

稱取3～5 mg 提取純化的E. coli EPS 凍干粉溶解在D2O 中，超聲溶解，用0.22 μm 濾膜過濾。將溶液轉(zhuǎn)移至核磁管中，使用400 MHz 核磁共振波譜儀采集核磁共振譜，設(shè)置采樣次數(shù)為32，使用MestReNova14.0.0 軟件進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正。

1.5 VAN 對MRSA 的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration， MIC）的測定

通過微量肉湯稀釋法進(jìn)行浮游細(xì)菌的抗菌性能測試。按照1.2 節(jié)中方法培養(yǎng)MRSA浮游態(tài)細(xì)菌，采用LB 培養(yǎng)基將浮游態(tài)細(xì)菌稀釋至105 CFU/mL。在96 孔板各孔中加入用PBS 梯度稀釋的VAN（100 μL/孔），再加入105 CFU/mL 細(xì)菌懸液（100 μL/孔）。設(shè)置陰性對照組（–）和陽性對照組（+），其中陰性對照組（–）加入100 μL 無菌培養(yǎng)基和100 μL PBS，陽性對照組（+）加入100 μL 細(xì)菌懸液和100 μL PBS。將此96 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，采用酶標(biāo)儀測定620 nm 處的吸光度。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組OD 值與陰性對照組OD 值無顯著差異時(shí)即表明細(xì)菌生長被完全抑制，可以完全抑制細(xì)菌生長的最低濃度即為MIC。

1.6 MRSA 生物膜的培養(yǎng)

1.6.1 抑制MRSA 生物膜形成。

使用LB 培養(yǎng)基將MRSA 浮游菌液稀釋至濃度為107 CFU/mL，在96 孔板中加入100 μL/孔的菌液和100 μL/孔的相應(yīng)樣品。樣品濃度及分組如下：（1）PBS 組，加入10 mmol/L PBS；（2）E. coli EPS 組，加入終濃度為100 mg/mL 的EPS；（3）VAN 組，加入終濃度為0.25～2.00 μg/mL 的VAN；（4）E. coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用組，終濃度分別為100 μg/mL 和2 μg/mL。將96 孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使孔板底部形成細(xì)菌生物膜。采用結(jié)晶紫染色法確定生物膜的量。

1.6.2 分散MRSA 成熟生物膜

使用LB 培養(yǎng)基將MRSA 浮游菌液稀釋至107 CFU/mL，加入96 孔板中（100 μL/孔），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；更換新鮮的無菌LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去孔中的全部菌懸液，此時(shí)在孔板底部形成細(xì)菌生物膜。向各孔中加入150 μL 相應(yīng)樣品，樣品濃度及分組情況如下：（1）PBS 組， 10 mmol/LPBS；（2） E. coli EPS 組，終濃度為100 mg/mL；（3）VAN 組，終濃度為16×MIC、128×MIC 和1024×MIC；（4） E. coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用組，終濃度分別為100 μg/mL 和1024×MIC。向96 孔板各孔中加入相應(yīng)樣品，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。采用結(jié)晶紫染色法確定生物膜量，通過菌落計(jì)數(shù)法確定生物膜內(nèi)的細(xì)菌存活情況。

1.7 MRSA 生物膜的結(jié)晶紫染色

將處理后的96 孔板中的菌液（1.6.1 節(jié)）或樣品（1.6.2 節(jié)）棄去，加入PBS 清洗2 次并晾干；加入2.5%戊二醛溶液，于4 ℃放置4 h 以上；棄去各孔中的戊二醛溶液，用超純水清洗2 次并晾干；各孔加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，使用大量流動(dòng)的超純水進(jìn)行清洗，直至清洗后溶液無顏色；孔板晾干后，各孔加入30%乙酸溶液，靜置5 min，孔內(nèi)液體混合均勻后轉(zhuǎn)至新的96 孔板。采用酶標(biāo)儀測定620 nm 處的吸光度。以PBS 組為對照組，計(jì)算生物膜形成抑制率（I）和生物膜分散率（D）。

1.8 MRSA 生物膜中的菌落計(jì)數(shù)

經(jīng)過1.6.2 節(jié)處理后的96 孔板，棄去孔內(nèi)液體，采用10 mmol/L PBS 清洗2 次；每孔加入150 μL10 mmol/L 的PBS，超聲4 min；將孔板中的菌液梯度稀釋至合適濃度，吸取100 μL 涂于瓊脂培養(yǎng)平板，將瓊脂板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，對瓊脂板表面的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照留存。

1.9 MRSA 生物膜掃描電鏡樣品的制備與觀察

在24 孔板底部放置玻璃片（長1 cm×寬1 cm×厚0.1 cm）。使用LB 培養(yǎng)基將MRSA 菌液濃度稀釋至107 CFU/mL，加入至24 孔板（2 mL/孔）中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；更換新鮮的無菌LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去孔板中的菌液，此時(shí)在孔板底部的玻璃片表面形成生物膜。每個(gè)孔中加入1 mL 相應(yīng)樣品。樣品濃度及分組如下：（1）PBS 組， 10 mmol/L PBS；（2）E. coli EPS 組，終濃度為100 mg/mL；（3）VAN 組，終濃度為1 mg/mL；（4）E. coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用組，終濃度分別為100 μg/mL 和1 mg/mL。向24 孔板中加入相應(yīng)樣品，于37 ℃恒溫孵育12 h 后，棄去孔中的樣品，加入PBS 清洗2 次并晾干，加入2.5%戊二醛溶液，于4℃放置4 h 以上；棄去孔板中的戊二醛溶液，使用乙醇進(jìn)行梯度脫水，乙醇濃度梯度為30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%，每個(gè)梯度脫水10 min。脫水結(jié)束后的樣品使用導(dǎo)電膠粘在掃描電鏡樣品臺(tái)后進(jìn)行觀察。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定MRSA 的基因表達(dá)

取1 mL MRSA 浮游態(tài)菌懸液離心（12000 r/min， 5 min），棄去上清液，向細(xì)菌沉淀中加入1 mL 相應(yīng)樣品，樣品濃度及分組如下：（1）PBS 組， 10 mmol/L PBS；（2）E. coli EPS 組，濃度為100 mg/mL；（3）VAN組，濃度為2 μg/mL；（4）E. coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用組，濃度分別為100 μg/mL 和2 μg/mL。在37 ℃恒溫孵育3 h 后離心（12000 r/min， 5 min），棄去上清液，每個(gè)離心管中加入500 μL TE 緩沖液（Tris-EDTA，pH=8.0）配制的10 mg/mL 溶菌酶溶液；于37 ℃水浴中孵育30 min，離心（12000 r/min， 1 min），根據(jù)說明書采用TRIzol 法提取RNA。使用TaKaRa 公司的試劑盒RR047A 和RR820A，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)圖數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD，每組包含至少3 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。通過單向方差分析one-way ANOVA 計(jì)算顯著性，*plt;0.05，**plt;0.01，***plt;0.001， ns 代表無顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli EPS 的成分表征

在本研究組的前期工作[22]中，對E. coli EPS 的基本性質(zhì)、分子量和單糖組成進(jìn)行了初步表征。為進(jìn)一步探究E. coli EPS 的結(jié)構(gòu)，測定了其核磁共振氫譜（1H NMR）。多糖NMR 譜的測定通常使用D2O 作為溶劑，可以降低信號(hào)密度和共振重疊趨勢，便于峰的鑒定和結(jié)構(gòu)測定。如圖2 所示， δ 3.3～4.7 ppm 區(qū)域內(nèi)密集的峰為多糖的特征峰[25]；δ 4.4～4.9 ppm 范圍內(nèi)的信號(hào)表明存在β 構(gòu)型的單糖；δ 5.1～5.8 ppm區(qū)域內(nèi)沒有明顯的峰，說明E. coli EPS 中α 構(gòu)型的單糖較少[26]；δ 5.4 ppm 處未出現(xiàn)信號(hào)，表明所有糖殘基均為吡喃糖[27]；在CH3COO—的出峰位置（δ 1.8～2.2 ppm）有很強(qiáng)的信號(hào)[26]，這可能來源于天然多糖分子鏈上的烷基；在δ 3.3～3.5 ppm 處的信號(hào)較強(qiáng)，表明存在一定量的CH3O—[26]；在δ 1.0～1.3 ppm 處有很弱的信號(hào)，說明E. coli EPS 中與C—O 鍵相連的甲基很少。

2.2 E.coli EPS 的抗生物膜性能研究

生物膜的形成是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，包括初始黏附、細(xì)胞聚集與生長、成熟結(jié)構(gòu)構(gòu)建及最終的分散脫落等多個(gè)步驟[28]。針對這一動(dòng)態(tài)過程，抗生物膜策略可以聚焦于2 個(gè)關(guān)鍵干預(yù)階段：（1）在生物膜形成的初期階段實(shí)施抑制措施，以阻斷或削弱細(xì)菌在表面的初步黏附及隨后的聚集增殖；（2）在生物膜達(dá)到成熟狀態(tài)后，采取有效手段促進(jìn)其分散，從而瓦解已建立的生物膜結(jié)構(gòu)。

圖3A 顯示了E. coli EPS 在抑制MRSA 生物膜形成方面的效果。當(dāng)E. coli EPS 濃度為25 μg/mL 時(shí)，對生物膜的抑制率為40%；當(dāng)E. coli EPS 濃度增至100 μg/mL 時(shí)，抑制率提升至73%。此結(jié)果表明，E. coli EPS 對MRSA 生物膜的形成具有濃度依賴的顯著抑制作用。圖3B 顯示了E. coli EPS 在促進(jìn)生物膜分散方面的作用。E. coli EPS 濃度為25 μg/mL 時(shí)，生物膜分散率為18%；當(dāng)E. coli EPS 濃度增至100 μg/mL 時(shí)，分散率顯著提升至48%，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴的增強(qiáng)效果。上述結(jié)果表明， E. coli EPS 不僅能在細(xì)菌初始黏附階段有效抑制生物膜的形成，還能夠在生物膜成熟后促進(jìn)其分散，展現(xiàn)出雙重的抗生物膜活性。

2.3 VAN 對MRSA 生物膜的作用

盡管VAN 是治療MRSA 感染的首選藥物，但其在應(yīng)對MRSA 生物膜相關(guān)疾病方面的臨床療效卻頗為有限[11，29]。首先，通過微量肉湯稀釋法測定了VAN 對MRSA 的MIC 為1 μg/mL（圖4A）?；诖?，進(jìn)一步評估了VAN 對MRSA 生物膜的抗性特征。在MRSA 生物膜形成的初期，當(dāng)與MRSA 共同培養(yǎng)的VAN濃度接近其MIC 時(shí)，并未觀察到顯著的抑制效應(yīng)（圖4B）。對于成熟MRSA 生物膜的分散能力，即使將VAN 濃度提升至遠(yuǎn)超MIC 的水平（包括16×MIC、128×MIC 和1024×MIC），各濃度組間的成熟生物膜總量也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，且未展現(xiàn)出濃度依賴的下降趨勢（圖4C）。此結(jié)果表明，即便是在高濃度條件下， VAN 依然難以有效分散成熟的生物膜。根據(jù)現(xiàn)有的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果， VAN 被認(rèn)為是一種具有時(shí)間依賴性的抗生素[30]。因此，本研究設(shè)計(jì)了不同時(shí)間點(diǎn)的VAN 處理實(shí)驗(yàn)，對MRSA 生物膜持續(xù)處理2、12 和24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， VAN 對生物膜的分散效果并未展現(xiàn)出時(shí)間依賴性，各時(shí)間組之間的分散效果也無顯著性差異。綜上，通過增大VAN 濃度和延長作用時(shí)間，無法滿足MRSA 生物膜相關(guān)感染治療的需求，需要探索更有效的針對MRSA 生物膜的策略。

2.4 E.coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用的抗生物膜性能研究

考察了E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用對MRSA 生物膜的作用效果。如圖5A 所示，在濃度為2×MIC的VAN 單獨(dú)作用下，對生物膜形成的抑制率僅為30%；與E. coli EPS 聯(lián)合使用時(shí)，抑制率顯著提升至50%以上。這表明E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用可顯著提高對生物膜形成的抑制效果。對成熟生物膜的分散效果進(jìn)行了考察（圖5B），發(fā)現(xiàn)即使采用高濃度（1024×MIC）的VAN 處理，生物膜的分散率也僅達(dá)到10%，且與PBS 對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異；然而，當(dāng)VAN 與E. coli EPS 聯(lián)合使用后，生物膜的分散率顯著增至80%。這說明VAN 與E. coli EPS 聯(lián)合使用顯著提高了成熟生物膜的分散效果。為了更深入地探究VAN 與E. coli EPS 聯(lián)合使用對生物膜內(nèi)細(xì)菌存活情況的影響，對生物膜內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行了計(jì)數(shù)（圖5C）。在相同濃度的VAN 處理?xiàng)l件下，與單獨(dú)使用VAN 相比， VAN 與E. coli EPS 聯(lián)合使用能夠額外減少生物膜內(nèi)部88%的細(xì)菌數(shù)，這說明E. coli EPS 能夠增強(qiáng)生物膜內(nèi)細(xì)菌對VAN 的敏感性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用顯著提高了抗生素的抗MRSA 生物膜的能力。

通過掃描電鏡直觀表征MRSA 生物膜量的變化以及生物膜內(nèi)細(xì)菌的存活情況。由圖6A 可見，經(jīng)PBS 處理后，細(xì)菌依然覆蓋整個(gè)表面，并且被胞外基質(zhì)包裹，保持完整的生物膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)存在一定的厚度。相比之下，使用1024×MIC 的VAN 處理生物膜后（圖6B），并未觀察到生物膜結(jié)構(gòu)被顯著破壞，細(xì)菌形態(tài)保持完整，與對照組的形貌特征基本一致。這表明即便是在高濃度條件下， VAN 依然難以有效分散生物膜結(jié)構(gòu)。值得注意的是，經(jīng)E. coli EPS 處理后的表面（圖6C）細(xì)菌數(shù)量明顯減少，且原本完整的生物膜結(jié)構(gòu)被顯著破壞。局部放大圖進(jìn)一步表明，盡管E. coli EPS 展現(xiàn)出了對生物膜的顯著分散作用，但細(xì)菌表面光滑且結(jié)構(gòu)保持相對完整，因此并未對MRSA 展現(xiàn)出直接殺滅能力。當(dāng)E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用時(shí)（圖6D），生物膜的整體結(jié)構(gòu)被徹底破壞，細(xì)菌數(shù)量顯著下降。局部放大圖顯示，大部分細(xì)菌形態(tài)不再完整，伴隨著細(xì)菌內(nèi)容物外泄；少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞膜呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)塌陷；僅有極少數(shù)細(xì)菌能夠維持表面光滑以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。上述結(jié)果表明，相較于單獨(dú)使用VAN， E. coli EPS 與VAN 聯(lián)合使用能夠更有效地破壞成熟的MRSA 生物膜結(jié)構(gòu)，并且可以輔助VAN 殺死生物膜內(nèi)部MRSA 菌，進(jìn)一步證實(shí)了E. coli EPS 能提升VAN 的抗MRSA 生物膜的能力。

2.5 E.coli EPS 和VAN 聯(lián)合使用對MRSA 基因表達(dá)的影響

為了探究E. coli EPS 抗生物膜的機(jī)理，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對MRSA 的基因表達(dá)進(jìn)行分析，測定了4 種MRSA 生物膜相關(guān)基因agrA、icaA、sarA 和strA 的表達(dá)[23-24]。argA 是MRSA 協(xié)調(diào)關(guān)鍵毒力成分合成的輔助基因調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)毒力因子、生物膜形成和MRSA 的耐藥性機(jī)制中起關(guān)鍵作用[31]；icaA 和sarA 是金黃色葡萄球菌胞外多糖PIA 以及PNAG 產(chǎn)生和生物膜形成必需的基因[32-33]；strA 是毒力因子相關(guān)基因，可使革蘭氏陽性菌毒性更強(qiáng)[34]。如圖7 所示，以16S rRNA 為管家基因，相對于PBS 組，VAN 對icaA 和strA 的表達(dá)沒有影響，能略微降低argA 的表達(dá)，但會(huì)使sarA 的表達(dá)增加，這表明VAN 對細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)生可能有一定的促進(jìn)作用，不利于生物膜相關(guān)疾病的治療。E. coli EPS 可以同時(shí)顯著降低這4 種基因的表達(dá)，相比于VAN 組， E. coli EPS 對于agrA 基因的抑制程度更大。將VAN 與E. coli EPS 聯(lián)合使用時(shí)， E. coli EPS 的加入逆轉(zhuǎn)了VAN 導(dǎo)致的sarA 基因過表達(dá)。上述結(jié)果表明，E. coli EPS 及E. coli EPS/VAN 聯(lián)合使用可以有效抑制MRSA 生物膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抵抗生物膜的效果。

3 結(jié)論

天然細(xì)菌EPS 作為一種抗生物膜多糖，在抗生物膜領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)E. coli EPS 對MRSA 生物膜的形成具有抑制作用，對成熟生物膜具有分散能力。將E. coli EPS 與VAN聯(lián)合使用，能夠增強(qiáng)VAN 對生物膜形成的抑制效率，同時(shí)提升VAN 對成熟生物膜的分散效果，顯著增強(qiáng)了VAN 殺滅生物膜內(nèi)部MRSA 的能力。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法探究E. coli EPS 抗MRSA 生物膜的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)E. coli EPS 能夠顯著降低MRSA 生物膜相關(guān)基因的表達(dá)水平。這一發(fā)現(xiàn)為理解E. coli EPS的抗生物膜作用提供了重要的分子水平上的證據(jù)，也進(jìn)一步證實(shí)了其在抗生物膜應(yīng)用中的有效性。E. coli EPS 作為一種有效的抗生物膜物質(zhì)，不僅能夠單獨(dú)發(fā)揮抗生物膜作用，還能顯著增強(qiáng)生物膜對抗生素的敏感性，在治療生物膜相關(guān)疾病方面擁有巨大的應(yīng)用潛力。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos. 52073293，82204326，52273160）和中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所所長基金資助。