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    基于引物交換反應(yīng)的非標(biāo)記熒光探針用于脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1 的高靈敏檢測

    2025-04-17 00:00:00王蕓花王樂如楊力改陳佳政杜雨潤侯嘉慧翟翔趙旭華于保鋒
    分析化學(xué) 2025年3期

    摘要 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE 1)是一種多功能蛋白質(zhì),在DNA 修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。由于APE 1 在多種癌癥中過表達(dá),因此可作為癌癥生物標(biāo)志物,用于輔助臨床診斷、指導(dǎo)用藥及預(yù)后監(jiān)測。本研究采用引物交換反應(yīng)(Primer exchange reaction, PER)策略,設(shè)計了一種非標(biāo)記型熒光探針,用于APE 1 活性的高靈敏檢測。當(dāng)體系中不存在APE 1 時,催化發(fā)夾(Catalytic hairpin, HP)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,無G-四鏈體(G-quadruplex)生成。此時,游離的硫磺素T(Thioflavin T,ThT)不發(fā)射熒光,體系的背景熒光很低。加入APE 1 后,催化發(fā)夾上的無嘌呤/嘧啶(Apurinic/apyrimidinic,AP)位點被特異性識別并切割,斷裂生成的短核酸序列可直接作為引物引發(fā)PER 擴增,生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光,導(dǎo)致傳感體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應(yīng)策略和催化發(fā)夾的低背景設(shè)計使此探針展現(xiàn)出很高的靈敏度,線性檢測范圍為0.001~0.07 U/mL,檢出限(3σ)為0.0008 U/mL。此外,引物序列可由APE 1 切割直接生成而不需要額外添加,這不僅提高了反應(yīng)的特異性,還簡化了操作步驟。非標(biāo)記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本,實現(xiàn)了APE 1 的快速檢測。利用此熒光探針檢測人血清樣品中APE 1 的含量,回收率在91%~104%之間,表明其在生物酶研究方面擁有巨大的應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1;引物交換反應(yīng);G-四鏈體;硫磺素T;非標(biāo)記熒光探針

    脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE 1)是一種人體組織中廣泛存在的多功能蛋白質(zhì),在堿基切除修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控中不可或缺[1-2]。作為細(xì)胞中重要的DNA 修復(fù)酶,APE 1 識別并催化切割雙鏈DNA 上的無嘌呤/嘧啶(Apurinic/apyrimidinic, AP)位點并產(chǎn)生缺口,然后通過聚合和連接反應(yīng)完成修復(fù),從而確?;蚣易逋暾鸞3]。此外, APE 1 還可激活氧化應(yīng)激反應(yīng)中幾種重要的轉(zhuǎn)錄因子,如p53、AP-1、NF-κB、HIF-α和PAX-5 等,進而調(diào)控基因表達(dá)[4]。然而,這種在正常生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶,在腫瘤細(xì)胞中卻呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)。這種異常表達(dá)不僅通過促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和增強細(xì)胞侵襲能力來促進多種腫瘤的生長和擴散,還通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性,影響腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性,進而降低治療效果[5-8]。因此, APE 1 可作為重要的癌癥標(biāo)志物輔助臨床診斷、指導(dǎo)用藥及預(yù)后監(jiān)測。

    傳統(tǒng)的APE 1 活性測定方法包括酶聯(lián)免疫吸附分析法、電化學(xué)分析方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。這些方法具有靈敏度高、特異性好且結(jié)果可靠等優(yōu)勢,但存在操作復(fù)雜、耗時長和成本高等缺點[9-11]。熒光分析法具有快速、高時空分辨率以及儀器操作相對簡單等優(yōu)點,引起了廣泛關(guān)注[12-14]。Liu 等[13]將滾環(huán)擴增反應(yīng)(RCA)與G-四鏈體(G-quadruplex)相結(jié)合設(shè)計了一種熒光探針,用于APE 1 的靈敏檢測;Huang 等[14]利用聚合酶和內(nèi)切酶共同作用的等溫擴增技術(shù)與G-四鏈體相結(jié)合開發(fā)了一種可檢測APE 1的高靈敏傳感器。上述傳感器雖然具有較高的靈敏度,但在設(shè)計過程中需要T4 DNA 連接酶、核酸外切酶Ⅰ(ExonucleaseⅠ, ExoⅠ)和核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ, Exo Ⅲ)的共同作用形成環(huán)狀模板,或需要內(nèi)切酶的輔助進行下一輪擴增。多種酶的聯(lián)合使用不僅會引起非特異性識別和假性信號的風(fēng)險,還會增加檢測的成本和操作的復(fù)雜性。因此,發(fā)展靈敏度高、特異性好且操作簡單的APE 1 檢測技術(shù)具有非常重要的意義。

    引物交換反應(yīng)(Primer exchange reaction, PER)策略是一種新穎而強大的等溫核酸擴增技術(shù),在新一代熒光放大生物傳感器的構(gòu)建方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。該技術(shù)以催化發(fā)夾(Catalytic hairpin, HP)DNA 為模板,在聚合酶的作用下啟動可逆且重復(fù)的鏈置換反應(yīng),最終以自主、可編程和等溫的方式合成多條特定的單鏈DNA[15]。與滾環(huán)擴增等其它擴增技術(shù)相比, PER 發(fā)夾設(shè)計簡單,只需一種聚合酶即可實現(xiàn)特異且快速的信號擴增[16-17]。Xie 等[18]將CRISPR/Cas 體系與PER 技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一種高靈敏的生物探針用于核糖核酸酶H 檢測。Li 等[19]利用PER 技術(shù)開發(fā)了自主DNA 合成器,用于痕量的鼠傷寒沙門菌檢測。這些傳感器顯著提高了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性,但需要復(fù)雜的核酸修飾或標(biāo)記過程。非標(biāo)記熒光探針無需對信號分子進行標(biāo)記,具有操作簡便、成本低以及可實時監(jiān)測生物體系動態(tài)變化等優(yōu)勢。

    利用PER 技術(shù)簡潔的設(shè)計和良好的放大能力,本研究構(gòu)建了一種非標(biāo)記型的熒光探針,用于APE 1活性的快速、高靈敏檢測。由于催化發(fā)夾中的富G 序列被全部固定于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部,且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,硫磺素T(Thioflavin T, ThT)游離于溶液中,體系的背景熒光很低。加入APE 1 后,催化發(fā)夾上的AP 位點被切割,生成的短核酸序列可作為引物引發(fā)PER 擴增,生成大量的G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光,導(dǎo)致體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應(yīng)策略以及催化發(fā)夾的低背景設(shè)計使此傳感體系展現(xiàn)出較高的靈敏度。此外, PER 擴增不需要額外添加引物,簡化了操作步驟,而且非標(biāo)記型熒光信號的使用降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析,結(jié)果令人滿意。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    F-4500 熒光分光光度計(日本Hitachi 公司);FE-28 pH 計(美國Mettler-Toledo 公司)。

    APE 1、ExoⅠ、Exo Ⅲ、Bst DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)和辣根過氧化物酶(HRP)購自美國New England Biolabs 公司;ThT、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和催化發(fā)夾(5′-AAGGGTT/idSp/GGGTTAGGGTTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTT-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;NaCl、MgCl2、Tris-HCl 緩沖液和牛血清白蛋白(BSA)均購自北京索萊寶科技有限公司。1×NEB 2.1 緩沖液(50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L MgCl2,100 μg/mL BSA, pH 7.9, 25 ℃)購自美國New England Biolabs 公司。以上試劑均為分析純,無需其它處理。實驗用水為MILI-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 APE 1 活性的檢測

    將2 μL 不同濃度的APE 1、2 μL 催化發(fā)夾(10 μmol/L)、2 μL 10×NEB 緩沖液4 和4 μL DEPC 水混合均勻。在37 ℃反應(yīng)60 min 后,在65 ℃加熱20 min 使APE 1 失活。然后移取10 μL 上述反應(yīng)體系、2 μL Bst DNA 聚合酶(1 U/mL)、4 μL 10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、4 μL 10×MgSO4溶液、1 mmol/L dNTP(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)各4 μL和2 μL ThT(40 μmol/L)至EP 管中,補加DEPC 水至總體積為40 μL,混勻,于37 ℃孵育120 min。反應(yīng)結(jié)束后,繼續(xù)補加1×NEB 2.1 緩沖液至總體積為100 μL;在激發(fā)波長為425 nm、發(fā)射波長為480 nm 條件下測定體系的熒光強度。

    1.2.2 實際樣品中APE 1 的測定

    本研究中的血液樣本由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院提供,并獲得了審查委員會的批準(zhǔn)和參與者的知情同意。血液樣本首先在4 ℃以10000 r/min 離心10 min,獲得上層血清,稀釋3 倍,于65 ℃加熱15 min,使血清中的蛋白酶失活。將不同濃度的APE 1 加入到上述血清中,并按1.2.1 節(jié)的方法測量熒光強度,計算血清樣品中APE 1 的回收率。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 實驗原理

    基于PER 策略的非標(biāo)記熒光探針設(shè)計原理如圖1 所示,靠近催化發(fā)夾的5′端含有AP 位點,便于目標(biāo)物APE 1 的識別;3′端修飾Inverted dT 以避免非特異性擴增[20];靠近環(huán)狀部位含有一段終止序列(3 對G-C 堿基),用于終止擴增反應(yīng)。未加入APE 1 時,催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,處于游離狀態(tài)的ThT 不發(fā)射熒光,傳感體系的背景熒光很低。加入APE 1 后, APE 1 特異性識別并切割催化發(fā)夾上的AP 位點,斷裂生成的短核酸序列(綠色)可作為PER 擴增的引物。隨后,在Bst DNA 聚合酶的催化作用下,引物利用加入的dNTP 進行延伸,直至到達(dá)終止序列時擴增結(jié)束。由于分子內(nèi)競爭雜交的影響,延長的DNA 序列移位并折疊成G-四鏈體,游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)且發(fā)出熒光,傳感體系的熒光信號顯著增強?;赑ER 策略的非標(biāo)記熒光探針為快速、靈敏測定APE 1 活性提供了一種新方法。

    2.2 傳感體系的可行性分析

    為了驗證此傳感體系檢測APE 1 的可行性,考察了不同實驗條件下溶液的熒光變化。如圖2A 所示,染料ThT 游離于溶液中,熒光信號很弱(曲線a)。加入催化發(fā)夾后,溶液的熒光信號幾乎與背景信號持平(曲線b),這表明催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, ThT 不能與之結(jié)合。加入dNTP 和Bst DNA 聚合酶,此傳感體系的熒光信號仍較低(曲線c)。加入APE 1 后,此傳感體系的熒光信號顯著增強(曲線d),這是由于APE 1 特異性地識別并切割催化發(fā)夾上的AP 位點,斷裂生成的短核酸序列直接作為引物引發(fā)PER 擴增,生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光。如圖2B 所示,加入APE 1 之前,在紫外光照射下未觀察到熒光(管1);加入APE 1 后,觀測到明顯的熒光(管2),此結(jié)果與傳感體系熒光光譜的變化一致。上述結(jié)果表明,本傳感體系可用于APE 1 活性檢測。

    2.3 實驗條件的優(yōu)化

    為了使傳感體系的檢測性能達(dá)到最佳,對dNTP、Bst DNA 聚合酶和ThT 的濃度以及PER 擴增反應(yīng)時間等實驗條件進行優(yōu)化。利用傳感體系的熒光強度比值(F/F0)評價傳感體系的性能,其中, F 為存在APE 1 時的熒光強度, F0 為不存在APE 1 時的熒光強度。如圖3A 所示,隨著dNTP 濃度增大, F/F0 逐漸增大,當(dāng)dNTP 濃度增至100 nmol/L 時, F/F0 達(dá)到平臺期。Bst DNA 聚合酶濃度對此傳感體系性能的影響如圖3B 所示,當(dāng)Bst DNA 聚合酶濃度為1.6 U/mL 時, F/F0 達(dá)到最大值。ThT 濃度對此傳感體系性能的影響如圖3C 所示,在ThT 濃度為2 μmol/L 時, F/F0 達(dá)到峰值。PER 擴增反應(yīng)時間對此傳感體系性能的影響如圖3D 所示,隨著反應(yīng)時間延長, F/F0 逐漸增大,并在120 min 時達(dá)到峰值。此外,由于K+對G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有一定影響[21],考察了KCl 濃度對此傳感體系性能的影響。如圖3E 所示,當(dāng)KCl 濃度從0 增至10 mmol/L 時, F/F0 未發(fā)生顯著變化,說明K+的加入對傳感體系的檢測性能基本無影響,這可能由于溶液中的Na+濃度足以使G-四鏈體形成穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)。

    將此探針在4 ℃環(huán)境下保存不同時間后,測定其對APE 1 的熒光響應(yīng),以評估探針的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3F 所示,探針在4 ℃環(huán)境中保存24 h 后, F/F0 只略微下降,表明其具有一定的穩(wěn)定性。

    綜上所述,本研究選擇在傳感體系中加入100 nmol/L dNTP、1.6 U/mL Bst DNA 聚合酶和2 μmol/LThT,反應(yīng)120 min 后進行后續(xù)實驗。

    2.4 傳感體系的分析性能

    在最優(yōu)實驗條件下,評估了此傳感體系對不同濃度APE 1 的響應(yīng)性能,如圖4A 所示,不存在APE 1時,催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此ThT 游離于溶液中,無熒光發(fā)射,傳感體系的背景熒光很低。隨著APE 1濃度增大,傳感體系的熒光強度隨之增強。這主要由于APE 1 切割催化發(fā)夾上的AP 位點,生成的引物經(jīng)PER 擴增后折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)并與ThT 結(jié)合,顯著提升了熒光響應(yīng)。此傳感體系的F/F0 與APE 1濃度的關(guān)系如圖4B 所示,當(dāng)APE 1 濃度達(dá)到1 U/mL 時, F/F0 趨于穩(wěn)定。圖4B 插圖為此傳感體系檢測APE 1 的校正曲線,線性檢測范圍為0.001~0.07 U/mL,線性方程為y = 52.06x + 0.91,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.995,檢出限(3σ)為0.0008 U/mL,與文獻報道的標(biāo)記性熒光傳感器(表1)靈敏度相當(dāng)甚至更優(yōu),這主要歸因于發(fā)夾探針的低背景設(shè)計和PER 的高效擴增。

    2.5 傳感體系的選擇性

    為了考察此傳感體系對APE 1活性檢測的特異性,測定了其在ExoⅠ、ExoⅢ、DnaseⅠ、HRP以及BSA等干擾物存在時的熒光響應(yīng)。如圖5 所示,加入目標(biāo)物APE 1 時,傳感器顯示出較高的響應(yīng)信號(F/F0);加入其它干擾物時,傳感器的熒光響應(yīng)與空白樣品相近,上述結(jié)果表明,此傳感體系對APE 1 具有良好的選擇性。

    2.6 實際樣品中APE 1 的測定

    采用本方法對人血清樣品中的APE 1 活性進行測定。向稀釋3 倍的人血清樣品中添加不同濃度的APE1,測定結(jié)果如表2 所示,血清樣品中APE 1 的加標(biāo)回收率為91%~104%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差lt;5.2%,表明此傳感體系可用于實際樣品中APE 1 活性分析。

    3 結(jié)論

    基于PER 擴增策略構(gòu)建了一種非標(biāo)記型熒光探針,用于APE 1 活性的高靈敏測定。催化發(fā)夾的低背景設(shè)計以及PER 的高效擴增使此探針展現(xiàn)出很高的靈敏度,檢出限低至0.0008 U/mL。此外, PER 擴增不需額外添加引物,簡化了操作步驟,而且非標(biāo)記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析,結(jié)果令人滿意。

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    山西省自然科學(xué)基金項目(Nos. 202303021221139,202203021222259)、中國博士后科學(xué)基金項目(No. 2024M761887)和山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點實驗室開放基金項目(No. CPOF202301)資助。

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