腦神經(jīng)活體原位電化學(xué)分析在臨床應(yīng)用中的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

摘要 腦科學(xué)作為多學(xué)科研究的前沿交叉領(lǐng)域之一，長期以來備受關(guān)注。其中，開展腦科學(xué)領(lǐng)域的化學(xué)基礎(chǔ)研究（以下簡稱為腦化學(xué)）不僅有助于理解腦功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時對于探索腦疾病發(fā)病機(jī)制及開發(fā)治療方法具有重要意義。活體原位電化學(xué)分析具有高時空分辨率、免標(biāo)記以及電極/溶液界面可調(diào)控等特點(diǎn)，為開展活體層次的腦神經(jīng)化學(xué)信號監(jiān)測與調(diào)控研究提供了可能。其中，快速掃描伏安法結(jié)合微電極技術(shù)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)多巴胺等神經(jīng)分子的活體檢測，還能與現(xiàn)有的神經(jīng)外科設(shè)備兼容并用，為活體原位電化學(xué)分析方法的臨床應(yīng)用提供了新的機(jī)遇，也為相關(guān)疾病的診斷和治療開辟了新的途徑。本文綜述了活體原位電化學(xué)分析方法在腦化學(xué)研究和臨床應(yīng)用中的最新進(jìn)展，闡述了該技術(shù)在臨床應(yīng)用中所面臨的挑戰(zhàn)及可能的解決途徑。

關(guān)鍵詞 活體電化學(xué)分析；臨床應(yīng)用；快速掃描伏安法；腦神經(jīng)化學(xué)；評述

神經(jīng)信號是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的基礎(chǔ)，包括電信號和化學(xué)信號。其中，化學(xué)信號是由神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、能量物質(zhì)、自由基和離子等一系列活性神經(jīng)分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它們不僅是大腦功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與形成和調(diào)控認(rèn)知、運(yùn)動、情緒等復(fù)雜生理過程，同時也是眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物[1]。在生理?xiàng)l件下，神經(jīng)分子水平處于動態(tài)平衡，一旦失衡則會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的形成、發(fā)生和發(fā)展。因此，實(shí)時監(jiān)測神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)動態(tài)變化，不僅有助于對腦功能的認(rèn)識和理解，也可以為腦疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)[2]。

目前，研究者已經(jīng)開發(fā)出基于電化學(xué)、光學(xué)、質(zhì)譜、核磁共振和拉曼光譜等原理的多種活體分析方法，部分方法已被應(yīng)用于腦內(nèi)神經(jīng)分子的檢測[3]。其中，非侵入式成像技術(shù)能夠無創(chuàng)監(jiān)測神經(jīng)分子的動態(tài)變化，為腦結(jié)構(gòu)、功能、代謝和分子特征的研究提供活體可視化的信息。然而，這些技術(shù)通常需要借助特殊的化學(xué)試劑或遺傳性熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)特定神經(jīng)分子的選擇性檢測，限制了其在人腦研究中的應(yīng)用[4]。電化學(xué)分析可利用神經(jīng)分子的電化學(xué)性質(zhì)實(shí)現(xiàn)腦化學(xué)分子的活體檢測，在神經(jīng)科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用[5]。其中，基于植入式微電極或微透析探針的電化學(xué)分析方法，因其高時空分辨率、免標(biāo)記、可實(shí)現(xiàn)活體原位實(shí)時分析以及設(shè)備易集成和微型化等優(yōu)勢，在腦化學(xué)基礎(chǔ)研究中備受關(guān)注，也在神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕Y和抑郁癥等）的臨床研究和早期診斷等方面顯示出潛在的應(yīng)用前景。而且，電化學(xué)分析方法也適合長期監(jiān)測慢性疾病，為疾病進(jìn)展和治療效果的評估提供連續(xù)的數(shù)據(jù)支持[6]。

近年來，隨著全球腦計(jì)劃的推進(jìn)，研究人員通過跨學(xué)科整合化學(xué)、材料學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)及人工智能等領(lǐng)域的先進(jìn)技術(shù)，推動了腦神經(jīng)活體電化學(xué)分析原理和方法的發(fā)展，并將其應(yīng)用于臨床研究，為腦疾病的診斷和治療提供了重要途徑。此前，研究人員針對部分活體原位電化學(xué)分析的原理、方法及其在腦神經(jīng)化學(xué)研究中的進(jìn)展進(jìn)行了綜述[7-12]。本文對近年來電化學(xué)活體原位分析的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述，討論了其在臨床應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)和可能的解決方案。

1 活體原位電化學(xué)分析

活體原位電化學(xué)分析通過將表面功能化的微電極直接植入生物活體的特定腦區(qū)，實(shí)現(xiàn)對待測神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的實(shí)時動態(tài)分析[13]。在系統(tǒng)研究目標(biāo)神經(jīng)化學(xué)分子結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，研究者通過合理設(shè)計(jì)和調(diào)控電極/溶液界面，采用合適的電化學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了對腦神經(jīng)系統(tǒng)中一些生理活性分子的選擇性活體檢測[14]。

1.1 安培法

安培法是通過測量在電極上施加恒定電壓產(chǎn)生的電流而實(shí)現(xiàn)電活性物質(zhì)定量檢測的電化學(xué)方法。安培法的基本原理如下：向工作電極施加恒定電位，電活性物質(zhì)在電極界面發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)，基于產(chǎn)生的電流可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)分子的定量分析。該方法具備毫秒級的時間分辨率，能夠?qū)崟r監(jiān)測神經(jīng)分子的動態(tài)變化。然而，安培法能夠記錄在施加電位下所有能夠參與氧化還原反應(yīng)的分子產(chǎn)生的電流信息，故在實(shí)際活體應(yīng)用中需考慮其它電活性物質(zhì)的干擾等問題。鑒于此，為了實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)重要神經(jīng)化學(xué)分子的選擇性分析， Wu 等[10]提出了按照神經(jīng)分子形式電位（E0’）排序，結(jié)合分子固有的物理化學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，指導(dǎo)界面設(shè)計(jì)的思路（圖1）。根據(jù)目標(biāo)物與干擾物形式電位占優(yōu)情況，通過合理構(gòu)筑電極/溶液界面和調(diào)控物種的界面電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)，一些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（如抗壞血酸（Ascorbic acid， AA）、氧氣、多巴胺（Dopamine， DA）、過氧化氫、一氧化氮和硫化氫等）可通過安培法實(shí)現(xiàn)活體原位選擇性分析。

AA 是生命體中重要的水溶性維生素，作為抗氧化劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì)，在許多神經(jīng)生理病理過程中發(fā)揮了重要作用。AA 具有相對較負(fù)的形式電位，可在較低電位下發(fā)生異相電子轉(zhuǎn)移。因此，通過調(diào)控電極表面的化學(xué)性質(zhì)，構(gòu)筑電化學(xué)活性高的界面，加速AA 電化學(xué)氧化過程，即可實(shí)現(xiàn)在活體中的選擇性檢測。Zhang 等[15]率先發(fā)現(xiàn)碳納米管可降低AA 在碳纖維電極（Carbon fiber electrode， CFE）表面的氧化過電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在碳納米管修飾電極上， AA 的起始氧化電位約為?0.10 V（vs Ag/AgCl），低于其它分子如DA（+0.08 V）、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-Dihydroxyphenylacetic acid， DOPAC）（+0.10 V）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine， 5-HT）（+0.15 V）和尿酸（+0.20 V）的起始氧化電位。利用該電極成功實(shí)現(xiàn)了AA 的選擇性活體原位電化學(xué)分析。

隨后， Xiang 等[16]通過原位合成方法，制備了陣列碳納米管包覆的碳纖維（Vertically aligned carbonnanotube-sheathed carbon fibers， VACNT-CFs），并以此作為電極材料，構(gòu)筑了具有高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的微電極，進(jìn)一步結(jié)合安培法，在活體層次實(shí)時監(jiān)測了AA-谷氨酸的“異相交換”過程。為了進(jìn)一步提高碳納米管電極制備的重現(xiàn)性， Xiao 等[17]利用電泳法實(shí)現(xiàn)了碳納米管在CFE 表面的可控沉積，通過高溫和電化學(xué)處理，制備了對AA 具有良好催化活性的碳納米管電極?；诖穗姌O，作者觀察到了擴(kuò)散性抑制傳播過程中AA 的擴(kuò)散釋放特性。Jin 等[18]利用電化學(xué)氧化策略制備了庚胺修飾的CFE，并通過疏水烷基鏈與碳納米球的相互作用制備了新一代AA 活體檢測電極（CFEAA2.0），其對AA 的檢測不僅具有高的選擇性和穩(wěn)定性，而且表現(xiàn)出較低的界面電容，可用于單細(xì)胞水平和活體層次的電分析化學(xué)研究。利用該方法，他們發(fā)現(xiàn)在谷氨酸受體激動劑N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA）誘導(dǎo)細(xì)胞毒性水腫的過程中，胞內(nèi)的AA 會外流到胞外（圖2）。

DA 作為一種關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)，在運(yùn)動控制、獎賞和情緒調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮了重要作用[19]。與AA 相比， DA 及其它兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)具有更高的形式電位，這對腦內(nèi)DA 的選擇性檢測提出了更高的要求。針對該問題，研究者采用生物識別元件（如核酸適配體等）促進(jìn)DA 在電極界面的異相電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)，為傳感器的設(shè)計(jì)提供了新的思路。Hou 等[20]提出了一種CFE 表界面功能化的策略，通過膽固醇與烷基鏈之間的非共價相互作用，將膽固醇修飾的DA 適配體組裝到烷基功能化的CFE 上，開發(fā)了可植入式適配體型電化學(xué)傳感器（aptCFEDA1.0），實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)DA 的選擇性檢測。結(jié)果表明，在+0.30 V（vs Ag/AgCl）電位下，神經(jīng)系統(tǒng)中共存的多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，如AA、去甲腎上腺素（Norepinephrine， NE）、左旋多巴（Levodopa， L-DOPA）和DOPAC 對DA 的測定基本沒有干擾，顯示了核酸適配體功能化微電極用于神經(jīng)遞質(zhì)選擇性分析的優(yōu)勢。隨后，為了進(jìn)一步穩(wěn)定電極界面， Li 等[21]基于電化學(xué)耦聯(lián)策略，利用鄰苯二酚在碳纖維上耦聯(lián)產(chǎn)生的醌中間體與含巰基的寡核苷酸快速結(jié)合，高效地將DA 適配體共價耦聯(lián)到CFE 上（aptCFEDA2.0）。與aptCFEDA1.0 相比， aptCFEDA2.0 通過核酸適配體與碳表面之間的共價鍵合，顯著提高了對DA 的檢測靈敏度和穩(wěn)定性，為連續(xù)監(jiān)測腦內(nèi)DA 的動態(tài)變化提供了可靠的方法（圖3）。

氧氣對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，實(shí)時監(jiān)測腦組織中的氧氣濃度不僅有助于了解神經(jīng)系統(tǒng)的代謝功能，而且對于疾病的臨床治療具有指導(dǎo)意義。利用安培法進(jìn)行氧氣活體原位分析時，為避免氧氣兩電子電化學(xué)還原過程產(chǎn)生的H2O2 中間產(chǎn)物損傷神經(jīng)系統(tǒng)， Xiang 等[22]使用電沉積方法，通過循環(huán)伏安掃描在垂直生長碳納米管（VACNT）修飾CFE 的表面沉積鉑納米粒子，在?0.50 V 電位下實(shí)現(xiàn)了氧氣的四電子還原。然而，從熱力學(xué)角度來看，電催化H2O2 還原反應(yīng)也容易發(fā)生。相應(yīng)地，鉑電極也能夠高效催化H2O2 還原，從而降低了催化氧還原反應(yīng)的選擇性。鑒于此， Wu 等[23]設(shè)計(jì)并制備了以CoN4位點(diǎn)為活性中心、空心碳納米球?yàn)榛椎膯卧哟呋瘎–oN4/C），研究發(fā)現(xiàn)， CoN4/C 催化氧氣還原的電位明顯優(yōu)于H2O2 還原。理論計(jì)算結(jié)果顯示， CoN4/C 主要促進(jìn)了氧氣的直接四電子轉(zhuǎn)移，而H2O2 在Co位點(diǎn)上的吸附受到明顯抑制?；谝陨辖Y(jié)果，作者以CoN4/C 為電催化劑制備了對氧氣響應(yīng)良好的電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了無H2O2 干擾的氧活體電化學(xué)傳感（圖4）。

1.2 電位法

電位分析法是一種通過記錄開路狀態(tài)下工作電極相對于參比電極的電勢差，定量檢測目標(biāo)物濃度的電化學(xué)方法。電位分析法利用能斯特方程描述在熱力學(xué)平衡狀態(tài)下電極電位與溶液中特定離子活度之間的定量關(guān)系。相較于其它基于電解池原理的電化學(xué)分析方法，電位法在測量過程中展現(xiàn)出高阻抗特性，幾乎不產(chǎn)生回路電流，從而能夠有效避免回路電流刺激神經(jīng)元電活動的現(xiàn)象。離子選擇性電極是一類典型的基于電位原理的電化學(xué)傳感器，通過構(gòu)筑離子選擇性敏感膜，將待測離子的活度轉(zhuǎn)化為可測量的電位信號。趙麗君等[24]以CFE 為基底電極、離子敏感膜為識別元件，構(gòu)建了一種全固態(tài)離子選擇性電極，成功實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)部分離子（如H+、K+和Ca2+等）的活體原位分析。Hao 等[25]將氫離子敏感膜修飾于CFE 界面，制備了全固態(tài)pH 選擇性電極。該電極對H+展現(xiàn)出良好的選擇性，并具備優(yōu)異的抗蛋白吸附性能，成功實(shí)時監(jiān)測了大鼠恐慌過程中杏仁核腦區(qū)的pH 值變化。然而，導(dǎo)電基底與敏感膜間水層的存在會導(dǎo)致離子選擇性電極記錄的電位信號易發(fā)生漂移。為了提高電位的穩(wěn)定性， Zhao 等[26]以疏水的空心碳納米球?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)層，構(gòu)建了全固態(tài)Ca2+選擇性電極，并利用該電極成功觀察到擴(kuò)散性抑制過程中Ca2+流入胞內(nèi)的現(xiàn)象。此外，他們還進(jìn)一步合成了氧化石墨炔（Graphdiyne oxide， GDYO）和二氧化錳（MnO2）復(fù)合結(jié)構(gòu)（GDYO-MnO2），并以此作為全固態(tài)K+選擇性電極的轉(zhuǎn)導(dǎo)層，構(gòu)筑了全固態(tài)K+選擇性電極，實(shí)現(xiàn)了大鼠腦內(nèi)胞外K+的活體實(shí)時分析[27]。此外， Zhao 等[28]設(shè)計(jì)并合成了一系列特異性識別離子載體。他們以鎢絲為基底電極，在其表面電沉積聚（3，4-乙烯二氧噻吩）和聚（鈉-苯乙烯磺酸鹽）（Poly（3，4-ethylenediox-ythiophene） and poly（sodium-pstyrenesulfonate）， PEDOT∶PSS）作為離子-電子轉(zhuǎn)導(dǎo)層，以提高電位穩(wěn)定性，制備了具有高選擇性和高穩(wěn)定性的電化學(xué)電生理微陣列電極。該電極不僅可以實(shí)時監(jiān)測自由移動大鼠癲癇發(fā)作時海馬腦區(qū)多種離子（K+， Ca2+， Na+）的濃度和pH 值的變化，還可以同步采集電生理信號（圖5）。Liu 等[29]通過調(diào)控Ca2+識別配體的親和力，構(gòu)建了兼具高選擇性和高可逆性的電化學(xué)微陣列電極，實(shí)現(xiàn)了自由移動小鼠7 個腦區(qū)細(xì)胞外Ca2+和神經(jīng)元電活動的同時檢測。Ding 等[30]和Rasmussen 等[31]利用離子選擇性電極與電生理電極同時記錄了腦內(nèi)離子濃度與腦電的變化，發(fā)現(xiàn)離子在睡眠/覺醒轉(zhuǎn)換、運(yùn)動發(fā)起和運(yùn)動技能學(xué)習(xí)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

除了對離子進(jìn)行檢測外， Wang 等[32]通過在碳納米管纖維上沉積鉑納米粒子制作了柔性電極，結(jié)合電位分析法，實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)DA 的動態(tài)監(jiān)測。Zhang 等[33]通過在CFE 表面電沉積銀納米顆粒，再經(jīng)Na2S 處理，制得Ag2S/AgNPs/CFE。Ag/Ag2S 的可逆氧化還原過程以及Ag+與硫化物（Ksp=6.0×10?49）之間的高結(jié)合力，使得在開路狀態(tài)下，電極電位與S2?濃度之間滿足能斯特方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， Ag2S/AgNPs/CFE 對硫化氫（H2S）的檢測展現(xiàn)出高選擇性，能夠避免電活性物質(zhì)和其它含硫物種的干擾。進(jìn)一步， Liu 等[34]開發(fā)了檢測H2S 濃度和pH 值的電位型雙通道微傳感器。該傳感器具有高時空分辨率、抗蛋白吸附性能、良好的選擇性和穩(wěn)定性，并且兩通道之間無相互干擾。利用該傳感器發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散性抑制過程中H2S 釋放不依賴于pH 值，而可能與酶依賴的通路相關(guān)（圖6）。

1.3 伏安法

伏安法是一類通過調(diào)制電壓波形記錄不同電位下電極電流響應(yīng)的電化學(xué)測量方法。由于活體環(huán)境中不同神經(jīng)化學(xué)分子的化學(xué)性質(zhì)及濃度存在較大差異，在不同電位以及掃描過程中會表現(xiàn)出不同的電化學(xué)行為。基于此，采集特定掃描條件下一定電位范圍內(nèi)的伏安數(shù)據(jù)，通過分析峰形和峰高等參數(shù)即可實(shí)現(xiàn)不同神經(jīng)化學(xué)分子的定性和定量分析。按照掃描波形的差異，伏安法可分為脈沖伏安法和電位掃描伏安法。

常用的脈沖伏安法包括差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry， DPV）、常規(guī)脈沖伏安法（Normal pulse voltammetry， NPV）以及方波伏安法（Square wave voltammetry， SWV）等，通過向工作電極施加一系列調(diào)制的電位脈沖并依次進(jìn)行電流采集而實(shí)現(xiàn)伏安檢測。脈沖伏安法的特點(diǎn)是所采用的電位階躍過程能夠使得電極雙電層電流充分衰減，從而有效抑制背景充電電流的影響。其中， NPV 和SWV 具有非常高的靈敏度和選擇性，且能夠根據(jù)峰電位的差異同時對多種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)定量分析。Tian 研究組[9]開發(fā)了基于小分子配體的高選擇性電化學(xué)傳感器，結(jié)合DPV 方法，實(shí)現(xiàn)了多種分子（如硫化物、Cu2+、Cu+、Fe2+和半胱氨酸等）的選擇性分析。Dong 等[35]設(shè)計(jì)并合成了3，4-雙（（2-氟-5-硝基苯甲酰）氧基）-苯甲酸（MPS-1）和N-（4-（2，5-二硝基苯氧基）苯基）-5-（1，2-二硫雜環(huán)戊烷-3-基）戊酰胺（MHS-1）兩種探針，將二者共同組裝到介孔金膜微電極表面，制備了MPS-1 和MHS-1 修飾電極，用于H2Sn 和H2S 的特異性識別。結(jié)合DPV 方法，實(shí)現(xiàn)了動脈閉塞模型小鼠和阿爾茲海默癥模型小鼠海馬、紋狀體和皮層等腦區(qū)H2Sn 與H2S的同時檢測。

與脈沖伏安法不同，電位掃描伏安法是通過向電極施加以一定掃描速率的三角波，并實(shí)時記錄電流響應(yīng)而實(shí)現(xiàn)伏安數(shù)據(jù)采集。為了提高時間分辨率和檢測選擇性，建立了快速掃描循環(huán)伏安法（Fast scancyclic voltammetry， FSCV），并發(fā)展成為一種使用相對廣泛的活體原位電化學(xué)分析方法[36]。FSCV 法通過結(jié)合快速電位掃描（gt;100 V/s）以及微電極技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了微米級空間分辨率下神經(jīng)分子毫秒級釋放過程的原位實(shí)時檢測。此外，以DA 為代表的兒茶酚胺類神經(jīng)分子可在CFE 表面產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附，表現(xiàn)為表面吸附控制的電化學(xué)行為[37]。因此，增大掃速能夠進(jìn)一步提高FSCV 方法對于這類分子檢測的靈敏度。目前， FSCV 方法已被應(yīng)用于多種神經(jīng)生理和病理過程中DA 等神經(jīng)分子的高靈敏和高時空分辨的動態(tài)檢測（圖7）[38]。除兒茶酚胺類物質(zhì)以外，通過對掃描波形進(jìn)行設(shè)計(jì)， FSCV 還可以實(shí)現(xiàn)腺苷、5-HT、O2 和H2O2 等分子的原位檢測。

對于FSCV 方法，其高掃速引發(fā)的挑戰(zhàn)主要包括背景充電電流大幅增加且漂移等?，F(xiàn)有的策略通常是選取待測神經(jīng)分子釋放之前的伏安數(shù)據(jù)作為背景信號，進(jìn)行背景差減扣除，記錄短時間內(nèi)（不超過90 s）的神經(jīng)分子的變化[39]。此外，在涉及多種神經(jīng)分子變化的復(fù)雜腦神經(jīng)過程中，不同神經(jīng)分子的伏安響應(yīng)可能相互交疊，導(dǎo)致定量分析困難。針對伏安峰交疊的問題， Heien 等[40]將主成分回歸引入FSCV，對結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)篩選分析，開發(fā)出同時測定DA 濃度和pH 值的新方法。但是，主成分回歸的分析方法對于數(shù)據(jù)采集和分析流程有較嚴(yán)苛的要求，所以亟需開發(fā)具有普適性的多組分分析方法。這些基于不同原理的活體電化學(xué)分析方法為神經(jīng)分子的高時空分辨率和高靈敏度檢測提供了基礎(chǔ)，也為檢測人腦中神經(jīng)分子提供了可能。

2 快速掃描循環(huán)伏安法在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展

對人腦內(nèi)神經(jīng)分子進(jìn)行研究，既彌補(bǔ)了模式動物研究之不足，也有助于新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)。但是，神經(jīng)分子的臨床檢測必須滿足3 個基本條件：對患者安全、與現(xiàn)有方法（神經(jīng)外科設(shè)備和手術(shù)室環(huán)境）兼容以及能夠?qū)崿F(xiàn)亞秒級時間分辨。深部腦刺激（Deep brain stimulation， DBS）技術(shù)為腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的檢測提供了很好的機(jī)遇。通過結(jié)合DBS 技術(shù)和FSCV 的高時空分辨率和高選擇性優(yōu)勢， FSCV 成為首個用于人類腦內(nèi)化學(xué)分子實(shí)時原位檢測的活體電化學(xué)分析方法[41]。

選擇可與神經(jīng)外科設(shè)備和手術(shù)室環(huán)境兼容的檢測電極是實(shí)現(xiàn)人腦神經(jīng)分子檢測的基本條件之一。2011 年， Kishida 等[41]通過改進(jìn)傳統(tǒng)CFE 的制作工藝，發(fā)展了首個適用于人腦中DA 原位測定的電化學(xué)傳感器。他們首先將碳纖維（直徑7 μm）穿入熔融石英毛細(xì)管，制成微型CFE，并以較大直徑的毛細(xì)管進(jìn)行固定，然后將制備的電極嵌入到聚酰亞胺涂層的不銹鋼保護(hù)管內(nèi)，保護(hù)管尖端暴露1 mm 作為參比電極，從而完成電極組裝（圖8A）。他們將該電極植入帕金森癥患者的尾狀核腦區(qū)，利用FSCV 成功監(jiān)測了患者決策過程中腦內(nèi)DA 的快速釋放過程。閉環(huán)DBS 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了治療系統(tǒng)和大腦之間的雙向交互，通過神經(jīng)生理學(xué)數(shù)據(jù)的實(shí)時反饋，動態(tài)優(yōu)化了DBS 參數(shù)。將無線實(shí)時記錄系統(tǒng)與植入式微電極集成，并結(jié)合反饋控制算法，可以構(gòu)建長期植入式閉環(huán)的DBS 設(shè)備。通過精準(zhǔn)調(diào)控刺激參數(shù)，該系統(tǒng)可有效降低DBS治療的副作用，提高治療的安全性和有效性，但也對化學(xué)信號記錄電極，尤其是電極的穩(wěn)定性和長期測量的可靠性，提出了更苛刻的要求。Bennet 等[42]利用化學(xué)氣相沉積技術(shù)，在鎢絲電極尖端沉積多晶硼摻雜金剛石薄膜，制備了摻硼金剛石基電極。體外電化學(xué)測試結(jié)果表明，摻硼金剛石基電極在連續(xù)測試72 h后靈敏度僅降低6.7%，而CFE 的靈敏度則明顯下降（43.4%）。此外，該電極的物理強(qiáng)度比CFE 高2 個數(shù)量級（圖8B）。結(jié)合無線實(shí)時監(jiān)測系統(tǒng)（Wireless instantaneous neurochemical sensing system， WINCS），該電極在靜止性震顫患者的丘腦腦區(qū)（圖9）記錄到機(jī)械刺激引起的腺苷釋放[42-43]。Montague 等[44]開發(fā)了一種新的彈性網(wǎng)電化學(xué)技術(shù)，結(jié)合陣列電極技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了NE、DA 和5-HT 的同步檢測。這些人腦可植入式電極的研發(fā)為腦化學(xué)的臨床研究提供了重要的基礎(chǔ)。

研究人員采用基于FSCV 的原位電化學(xué)分析技術(shù)，并結(jié)合一系列簡短的實(shí)驗(yàn)范式（如投資回報(bào)、概率獎勵、賭博決策、視覺運(yùn)動方向辨別、時間感知及最后通牒博弈等任務(wù)），研究了DA、5-HT 和NE 等神經(jīng)分子在相關(guān)過程中的分子作用機(jī)制[45-54]。Kishida 等[45]將定制的CFE 植入帕金森癥患者紋狀體腦區(qū)，實(shí)時監(jiān)測了DA 的亞秒級變化，發(fā)現(xiàn)DA 不僅編碼獎勵預(yù)測誤差還整合了反事實(shí)預(yù)測誤差，揭示了DA在決策過程中對實(shí)際和假設(shè)結(jié)果的復(fù)雜編碼機(jī)制。他們進(jìn)一步比較了投資決策過程中紋狀體腦區(qū)血氧水平依賴（Blood oxygen level-dependent， BOLD）信號與DA 釋放之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在某些情況下二者存在對應(yīng)關(guān)系，但并不完全一致，特別是在不同投資決策情境下， DA 信號會因投資大小變化而發(fā)生反轉(zhuǎn)，而BOLD 信號則沒有這種反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，表明DA 信號可能編碼了獎勵預(yù)測誤差和反事實(shí)誤差的線性組合[46]。最新的研究結(jié)果顯示，人腦紋狀體的DA 波動不僅編碼獎勵預(yù)測誤差，還編碼懲罰預(yù)測誤差。利用FSCV高時間分辨率的特點(diǎn)， Sands 等[47]深入探究了編碼機(jī)制，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外DA 水平通過人腦內(nèi)獨(dú)立的價態(tài)特異性通路，在不同時間區(qū)間編碼獎勵和懲罰預(yù)測誤差，表明人類決策受到獨(dú)立且并行的獎賞和懲罰處理過程的影響。除此之外， Liebenow 等[48]對比了酒精使用障礙患者與非酒精使用障礙患者在“穩(wěn)賺或冒險”決策任務(wù)中DA 的釋放情況，分析了不同決策結(jié)果對獎賞預(yù)測誤差的DA 反應(yīng)。結(jié)果顯示，酒精使用障礙患者在處理反事實(shí)信息（如后悔和釋然）時DA 反應(yīng)異常，尤其在面對積極的反事實(shí)預(yù)測誤差（釋然）時，其DA 水平顯著低于非酒精使用障礙患者，提示酒精使用障礙可能與DA 對情緒反應(yīng)的編碼異常相關(guān)。除DA 外， Moran 等[49]通過FSCV 技術(shù)，監(jiān)測了帕金森患者在進(jìn)行投資任務(wù)時紋狀體腦區(qū)5-HT 的變化情況，分析了該信號與獎勵預(yù)測誤差和決策行為之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與DA 的作用不同，人腦紋狀體內(nèi)5-HT 可編碼與損失相關(guān)的預(yù)測誤差，并在面對負(fù)面環(huán)境事件時調(diào)節(jié)選擇，減少風(fēng)險暴露的可能。Bang 等[50-51]同時監(jiān)測了人類受試者進(jìn)行視覺運(yùn)動方向辨別和最后通牒博弈時，其紋狀體腦區(qū)DA 和5-HT 兩種信號的變化情況，發(fā)現(xiàn)這兩種神經(jīng)化學(xué)分子不僅參與獎勵處理，還在非獎賞相關(guān)認(rèn)知和行為（如快速感知決策過程）、社會互動等方面發(fā)揮重要作用。這些研究不僅加深了人類對認(rèn)知、情感和行為等神經(jīng)過程的理解，而且為神經(jīng)疾病的診斷和治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

3 活體原位電化學(xué)分析在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)和可能的解決方案

雖然近期的研究初步表明FSCV 可以應(yīng)用于臨床研究，但是以伏安法為代表的電化學(xué)分析方法用于臨床研究時仍存在以下問題：（1）現(xiàn)有植入式微電極與腦組織的力學(xué)性能不匹配；（2）傳統(tǒng)原位電化學(xué)檢測方法干擾神經(jīng)元電活動，且不兼容電生理信號記錄；（3）可檢測物種有限。這些因素制約了活體電化學(xué)分析在腦化學(xué)機(jī)制、腦機(jī)接口、神經(jīng)調(diào)控以及神經(jīng)疾病診療等研究方面的應(yīng)用。因此，仍需從電極設(shè)計(jì)、方法原理和分析性能等多個方面深入開展傳感器的研發(fā)，以滿足腦化學(xué)活體測量在臨床研究中的應(yīng)用需求。

3.1 低損傷

目前，常用于腦化學(xué)傳感的植入式微電極大多采用碳纖維、金和鉑等“剛性”材料制成。這些材料的楊氏模量通常在GPa 級別，遠(yuǎn)高于腦組織的楊氏模量（約10 kPa）。剛性電極在植入腦組織過程中，將不可避免地破壞血腦屏障，導(dǎo)致腦組織損傷。同時，由于電極/腦界面力學(xué)性能不匹配，腦組織的微移動會導(dǎo)致組織與電極之間產(chǎn)生摩擦，這些因素均可能引發(fā)電極周圍組織的免疫反應(yīng)[55]。同時，損傷部位的腦組織會產(chǎn)生大量激活的膠質(zhì)細(xì)胞向電極界面遷移，并形成纖維囊，阻礙神經(jīng)化學(xué)分子在電極界面的氧化還原反應(yīng)，最終導(dǎo)致電極無法正常工作[56]。此外，微電極植入也會導(dǎo)致周圍腦組織化學(xué)穩(wěn)態(tài)失衡，甚至影響其功能，使得電極測量結(jié)果無法反映腦組織的真實(shí)狀態(tài)。柔性電極因具有與腦組織相匹配的力學(xué)性能，為腦化學(xué)信號的長時程和高保真記錄提供了新的可能[57-58]。

采用導(dǎo)電聚合物（如聚吡咯、聚苯胺和PEDOT：PSS 等）制備的電極不僅能夠提供與腦組織相匹配的機(jī)械特性和優(yōu)異的生物相容性，有效降低植入后引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險，同時還能夠保證植入式傳感器所需的電學(xué)性能。這些特性使得所開發(fā)的電極在腦化學(xué)活體測量領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。其中，PEDOT∶PSS 因其高導(dǎo)電性和易于功能化的特點(diǎn)，被視為最具發(fā)展?jié)摿Φ膶?dǎo)電聚合物之一[59]。Xu 等[60]采用濕法紡絲技術(shù)，結(jié)合后處理工藝，制備了純PEDOT∶PSS 纖維，并將其作為電極材料，開發(fā)了一種植入式低損傷柔性電極。該電極具有高導(dǎo)電性和快速的異相電子轉(zhuǎn)移速率，可以用于腦內(nèi)DA 的原位實(shí)時檢測。同時，后處理的纖維展現(xiàn)出一定的電荷存儲和注入能力，可以用于記錄和調(diào)控神經(jīng)元活動（圖10）。進(jìn)一步地，他們將少量碳納米管摻入PEDOT∶PSS 制備了碳納米管-PEDOT：PSS 復(fù)合物纖維微電極，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)散性抑制過程中AA 的選擇性分析。該電極也可植入大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)，對坐骨神經(jīng)的復(fù)合動作電位實(shí)現(xiàn)高保真記錄。此外，由于碳納米管摻入量極低，復(fù)合物纖維微電極仍然保持與腦組織相匹配的楊氏模量，在4 周的活體植入期內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性[61]。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕Y和癲癇）的長期監(jiān)測中，柔性電極的研發(fā)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)在腦組織的穩(wěn)定植入，可以連續(xù)監(jiān)測神經(jīng)化學(xué)分子動態(tài)變化，為疾病進(jìn)展評估和治療效果分析提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也可以顯著降低患者不適感和并發(fā)癥風(fēng)險，增強(qiáng)設(shè)備的耐受性和安全性。

3.2 信號兼容

實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)神經(jīng)分子和神經(jīng)元電活動的同步監(jiān)測，對于解析化學(xué)信號和電信號在生理病理過程中的協(xié)同作用機(jī)制至關(guān)重要，這有助于研究人員深入理解神經(jīng)系統(tǒng)活動，并揭示神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的工作機(jī)制。然而，現(xiàn)有的活體電化學(xué)測量方法幾乎都是基于電解池原理發(fā)展起來的，需要向工作電極施加極化電壓驅(qū)動電活性分子的電化學(xué)氧化或還原[62]。外加的極化電壓以及產(chǎn)生的回路電流不僅會刺激神經(jīng)元，而且會影響神經(jīng)電生理信號的記錄，從而導(dǎo)致兩種信號很難同步記錄[63]?；陔娢环ǖ幕瘜W(xué)信號采集方式為解決上述問題提供了有效途徑，但該方法仍然難以實(shí)現(xiàn)氧化還原活性分子的分析檢測。針對這一問題，Wu 等[64]提出了基于原電池原理的氧化還原電勢分析法（Galvanic redox potentiometry， GRP）。該方法通過在陰陽兩極之間構(gòu)筑能夠自發(fā)進(jìn)行的氧化還原過程，在無需外加極化電壓的條件下，通過記錄兩極間的開路電位即可實(shí)現(xiàn)待測物的分析?；谠撛恚?Wu 等[64]利用漆酶修飾的CFE 催化氧氣還原反應(yīng)作為高電位陰極，利用單壁碳納米管修飾的CFE 催化AA 氧化作為低電位陽極，制備了首個兩電極型的GRP 傳感器。二者構(gòu)成自發(fā)的氧化還原體系，并通過系統(tǒng)的開路電位指示AA 的濃度變化。利用該傳感器實(shí)時監(jiān)測了腦缺血-再灌注過程中皮層AA 的濃度變化規(guī)律。為了實(shí)現(xiàn)對GRP 體系陰極電位的調(diào)控，Yu 等[65]在此基礎(chǔ)上發(fā)展了基于自發(fā)雙極化行為的氧化還原電勢法。他們以AA 為模型分子，設(shè)計(jì)構(gòu)建了首個單根碳纖維驅(qū)動的電化學(xué)傳感器。該傳感器的陰極端被封裝在玻璃管內(nèi)部，與測量環(huán)境隔離。這種設(shè)計(jì)既有效避免了兩極反應(yīng)的交叉干擾，又使陰極端電極反應(yīng)的選擇更加靈活。他們還通過將GRP傳感器與電生理陣列電極共同植入腦組織同時記錄電化學(xué)和電生理信號，驗(yàn)證了GRP 方法的神經(jīng)元兼容性（圖11A）。隨后，薛亦飛等[66]在系統(tǒng)研究腦內(nèi)重要神經(jīng)活性分子物理化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了多種目標(biāo)分子的氧化還原電勢分析方法。Pan 等[67]結(jié)合單原子催化劑和氧化還原GRP 原理發(fā)展了高性能的活體H2S 傳感器。該傳感器以NiN4-SAC 為電催化劑，降低了H2S 的電化學(xué)氧化過電位，從而排除了腦內(nèi)干擾物質(zhì)的影響，實(shí)現(xiàn)高選擇性檢測。此外， GRP 方法在測量過程中幾乎沒有電流產(chǎn)生，最大限度地減少了電極表面的產(chǎn)物吸附和積累，顯著提高了電極穩(wěn)定性（圖11B）。利用該傳感器發(fā)現(xiàn)在皮層腦區(qū)持續(xù)高頻電刺激下，野生型與DJ-1 蛋白敲除鼠紋狀體的H2S 釋放持續(xù)時長具有顯著差異（圖11C）。

針對5-HT 氧化產(chǎn)物鈍化電極的關(guān)鍵問題， Zhu 等[68]基于GRP 原理，發(fā)展了一種高穩(wěn)定性、可植入式的電化學(xué)傳感器（GRP5-HT），用于活體動物腦內(nèi)5-HT 的動力學(xué)研究（圖11D）。相比于傳統(tǒng)的基于電流法的電化學(xué)傳感器， GRP 方法能夠有效減少5-HT 氧化產(chǎn)物對電極的鈍化。Ni 等[69]利用核酸適配體對電極界面進(jìn)行功能化，結(jié)合GRP 原理，開發(fā)了首個適配體型GRP 傳感器。以DA 為目標(biāo)分子，該傳感器表現(xiàn)出高選擇性和納摩爾級響應(yīng)靈敏度，能夠在保持神經(jīng)元正?；顒拥那疤嵯?，實(shí)時記錄大鼠腦內(nèi)DA的動態(tài)變化（圖11E）。以葡萄糖脫氫酶為生物識別元件， Lu 等[70]構(gòu)建了首個酶型GRP 傳感器，為不具有良好氧化還原活性分子的電化學(xué)分析提供了新思路（圖11F）。此外， Wei 等[71]將GRP 方法與電生理記錄系統(tǒng)進(jìn)行集成，通過在陣列電極的單個記錄位點(diǎn)修飾單壁碳納米管，作為GRP 體系的陽極端，并以鉑電極作為陰極端，構(gòu)建自發(fā)氧化還原體系，實(shí)現(xiàn)了AA 和電生理信號的同步檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， GRP電化學(xué)記錄和電生理記錄之間互不干擾，可以實(shí)現(xiàn)同步記錄，基于此實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)散性抑制過程中AA 和神經(jīng)元電活動的同步記錄（圖12）。這一多模態(tài)信號捕獲集成系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)電生理信號與電化學(xué)信號的整合，為疾病的精準(zhǔn)診斷提供重要工具，也必將為腦科學(xué)研究提供更全面視角。

3.3 多組分檢測

大腦中包含約200 種與生理病理狀態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)的小分子神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，面對復(fù)雜的大腦微環(huán)境，如果能在單次測量中實(shí)現(xiàn)多種化學(xué)物質(zhì)的定量檢測，即可為研究不同神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)之間的協(xié)同作用提供可能。目前普遍采用陣列電極實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)[28-29]。然而，這可能影響信號檢測的時空分辨率?；趩胃姌O的FSCV 能夠在保證時空分辨率的前提下提供包含多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)濃度信息的電化學(xué)伏安數(shù)據(jù)，有望實(shí)現(xiàn)高時空分辨的多組分原位檢測。采用線性回歸模型，從FSCV 中解析pH 值和5-HT 信號。但是，在活體測量過程中存在伏安峰形電位偏移和背景電流漂移等共性問題，對回歸模型造成干擾。因此，使用FSCV 對大腦中的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行多組分檢測仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。

為了從復(fù)雜的循環(huán)伏安圖中同時提取多種神經(jīng)化學(xué)分子的濃度信息， Xue 等[72]將FSCV 與人工智能算法結(jié)合，開發(fā)了基于深度學(xué)習(xí)的伏安傳感平臺（Deep learning-based voltammetric sensor， DLV 傳感器）用于腦內(nèi)復(fù)雜化學(xué)環(huán)境下的多組分檢測（圖13）。該方法設(shè)計(jì)了一個類自編碼器結(jié)構(gòu)的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)了伏安峰形特征的提取和識別并進(jìn)行了定量分析。相較于傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法（如主成分分析），深度學(xué)習(xí)算法結(jié)構(gòu)具有更高的靈活性，通過對模型結(jié)構(gòu)以及訓(xùn)練過程進(jìn)行有效設(shè)計(jì)，能夠表現(xiàn)出對各種干擾因素的魯棒性以及對復(fù)雜數(shù)據(jù)的泛化能力。DLV 傳感方法通過同時使用已標(biāo)記的體外數(shù)據(jù)和未標(biāo)記的活體數(shù)據(jù)進(jìn)行半監(jiān)督訓(xùn)練，實(shí)現(xiàn)了不同物質(zhì)伏安峰形的有效提取，并能夠在復(fù)雜的活體伏安數(shù)據(jù)中進(jìn)行識別和定量分析。目前，利用該方法已成功實(shí)現(xiàn)了大鼠擴(kuò)散性抑制過程中紋狀體腦區(qū)DA、AA 和離子濃度的同時檢測。未來，隨著傳感技術(shù)和人工智能的深度交叉和融合， DLV 傳感器有望實(shí)現(xiàn)更多組分的同時檢測，進(jìn)一步促進(jìn)腦科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。

4 總結(jié)與展望

活體原位電化學(xué)分析是活體神經(jīng)化學(xué)信號監(jiān)測的重要方法之一。FSCV 法結(jié)合微電極技術(shù)為活體原位電化學(xué)分析的臨床應(yīng)用提供了新機(jī)遇，有助于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期診斷和治療效果的評估。盡管如此，目前的活體原位電化學(xué)分析的臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步發(fā)展新一代活體電化學(xué)分析原理和方法。柔性電極的引入為活體化學(xué)信號的長期采集提供了可能；GRP 方法的出現(xiàn)解決了神經(jīng)信號兼容性問題，為多模態(tài)信號采集提供了重要工具；人工智能在化學(xué)信號解析中的應(yīng)用為數(shù)據(jù)挖掘提供了更廣泛的視角。雖然基于GRP 原理的低損傷式多組分信號采集分析技術(shù)還未完全實(shí)現(xiàn)，但通過對電極界面和電極結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)和構(gòu)筑，活體原位電化學(xué)分析將為實(shí)現(xiàn)臨床化學(xué)信號的大規(guī)模長期穩(wěn)定記錄提供可能，也將極大地推動腦科學(xué)研究的發(fā)展。

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