衰老對(duì)于實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的影響及機(jī)制

劉愛(ài)玲，汪紅英，呂 紅，錢家鳴

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化科，北京 1007302中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)患者多青年起病，但仍有約25%～35%患者老年起病[1]。老年患者的臨床表現(xiàn)與青年患者有諸多不同，是否存在機(jī)制不同有待深入研究，其機(jī)制無(wú)外乎涉及免疫、腸道菌群、腸黏膜屏障改變等[2- 3]。衰老伴隨著多種生理功能進(jìn)行性減退[4]。免疫系統(tǒng)的老化，即免疫衰老，使機(jī)體易患感染、自身免疫性疾病、慢性炎癥和腫瘤等。免疫衰老包括適應(yīng)性和獲得性免疫功能減退。年齡相關(guān)的免疫功能失調(diào)在衰老中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)在其中起到一定作用[5]。正常的腸黏膜屏障可以阻擋病原微生物入侵，對(duì)于維持機(jī)體的健康具有重要作用[6]。腸黏膜屏障功能損傷可引起腸道滲透性增高、炎性因子增加、腸道菌群失調(diào)，從而引發(fā)IBD、腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)、乳糜瀉等疾病。目前衰老是否引起腸黏膜屏障功能減退尚有爭(zhēng)議[7]。Thevaranjan等[8]研究顯示，衰老相關(guān)的腸道菌群失調(diào)可引起腸黏膜屏障功能減退和腸道滲透性增加，細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，激活巨噬細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。而Valentini等[9]研究認(rèn)為，小腸黏膜屏障功能并未隨機(jī)體衰老而減退?？梢?jiàn)，衰老、腸黏膜屏障和炎癥之間密切相關(guān)。目前關(guān)于老年和青年IBD發(fā)病機(jī)制差異方面的研究甚少，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)老年和青年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎腸黏膜屏障方面的比較研究。本研究通過(guò)建立青年和老年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型，比較了炎癥程度和腸黏膜屏障，研究了衰老對(duì)于實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的影響和與青年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的不同及可能的機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料老年和青年雄性C57BL/6小鼠各10只，購(gòu)自維通利華公司，老年鼠選取28周(體質(zhì)量30～35 g)飼養(yǎng)至老年(56周，體質(zhì)量40～43 g)；青年組為6～8周(體質(zhì)量20～25 g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)，相對(duì)分子質(zhì)量36 000～50 000，購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；Trizol 和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Life technology公司，SYBR Green染料采用日本Takara公司的SYBR Premix Ex TaqlI，抗體E-cadherin購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，抗體occludin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

動(dòng)物模型和分組青年和老年小鼠各分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組小鼠急性結(jié)腸炎的造模方法為給予2%DSS 飲用水1～7 d，第8天處死；對(duì)照組小鼠給予自由飲用水，第8天處死。小鼠在建模和喂養(yǎng)過(guò)程中無(wú)死亡。

結(jié)腸炎癥評(píng)估每天記錄小鼠體質(zhì)量、大便形態(tài)及大便帶血情況，參照表1，給每只小鼠每天的3項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分，將3項(xiàng)評(píng)分相加得到當(dāng)日疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)。處死小鼠后取出結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度；切取遠(yuǎn)段結(jié)腸標(biāo)本固定于福爾馬林中，請(qǐng)病理科醫(yī)生進(jìn)行病理炎癥評(píng)分。參照表2，3項(xiàng)指標(biāo)各按受累范圍的比例乘以相應(yīng)系數(shù)(×1：0～25%;×2:26%～50%;×3:51%～75%;×4:76%～100%)，相加即得病理評(píng)分。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)計(jì)算方法Table 1 Disease activity index evaluation

表2 小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎病理評(píng)分Table 2 Histological colitis scores in mice

實(shí)時(shí)熒光定量PCRTrizol一步法提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)SYBR Green I方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，引物序列見(jiàn)表3。

透射電鏡觀察腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)小鼠處死后取近肛門的結(jié)腸組織0.5 cm固定于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃保存。鋨酸固定，乙醇脫水后包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中，制成超薄切片，透射電鏡觀察腸黏膜屏障。

Westernblot檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織E-cadherin和occludin蛋白將分離出的結(jié)腸組織用RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，采用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫下封閉處理后加入1∶1000稀釋的E-cadherin、1∶1000稀釋的occludin、1∶10 000稀釋的β-actin 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TTBS洗滌3次，再加入二抗(山羊抗兔HRP抗體)室溫孵育1 h，滴加ECL混合液，最后用富士LAS- 4000熒光化學(xué)發(fā)光成像儀顯像。

免疫組織化學(xué)染色按常規(guī)步驟進(jìn)行，抗原修復(fù)采用微波法，一抗 E-cadherin 1∶400稀釋、occludin 1∶200稀釋，4 ℃過(guò)夜，二抗采用二步試劑法。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences in RT-PCR

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL- 6：白細(xì)胞介素- 6；GAPDH：甘油醛- 3-磷酸脫氫酶

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL- 6：interleukin- 6；GAPDH：glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[10]，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

老年和青年小鼠結(jié)腸炎癥狀比較

體質(zhì)量：青年對(duì)照組小鼠平穩(wěn)上升，老年對(duì)照組小鼠基本不變。實(shí)驗(yàn)組小鼠在DSS處理第4天開(kāi)始出現(xiàn)持續(xù)下降，以老年實(shí)驗(yàn)組小鼠下降更明顯(t=3.679，P=0.006)(圖1A、B)。

DAI：老年實(shí)驗(yàn)組小鼠上升更明顯(t=2.496，P=0.037)(圖1C、D)。

結(jié)腸長(zhǎng)度：實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(青年實(shí)驗(yàn)組比青年對(duì)照組：t=5.583，P<0.001；老年實(shí)驗(yàn)組比老年對(duì)照組：t=6.162，P<0.001)，老年和青年實(shí)驗(yàn)組小鼠間的結(jié)腸長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.983，P=0.083)(圖1E、F)。

結(jié)腸病理：實(shí)驗(yàn)組小鼠可見(jiàn)結(jié)腸上皮破壞，隱窩丟失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；老年實(shí)驗(yàn)組較青年實(shí)驗(yàn)組病理表現(xiàn)更為嚴(yán)重(U=0.000，P=0.008)(圖2A、B)。

炎癥因子：實(shí)驗(yàn)組小鼠TNF-α表達(dá)(青年實(shí)驗(yàn)組比青年對(duì)照組：U=2.169，P=0.062；老年實(shí)驗(yàn)組比老年對(duì)照組：U=6.500，P=0.246)和IL- 6表達(dá)(青年實(shí)驗(yàn)組比青年對(duì)照組：U=0.000，P=0.016；老年實(shí)驗(yàn)組比老年對(duì)照組：U=1.000，P=0.032)較對(duì)照組明顯升高；老年對(duì)照組TNF-α(U=0.000，P=0.008)和IL- 6表達(dá)(U=1.000，P=0.032)較青年對(duì)照組明顯升高，老年實(shí)驗(yàn)組IL- 6表達(dá)較青年實(shí)驗(yàn)組明顯升高(U=4.000，P=0.191)(圖2C、2D)。

aP<0.05，bP<0.01

A.小鼠體質(zhì)量變化情況(n=5)；B. 葡聚糖硫酸鈉給藥第7天各組小鼠體質(zhì)量變化的比較(n=5)；C.小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)變化情況(n=5)；D. 葡聚糖硫酸鈉給藥第7天各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)比較(n=5)；E.小鼠結(jié)腸大體表現(xiàn)；F.各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較(n=5)

A. body weight change (n=5)；B. comparison of body weight changes of mice in each group on the 7st day from dextran sodium sulfate administration(n=5)；C. disease activity index change(n=5)；D. comparison of disease activity index of mice in each group on the 7st day from dextran sodium sulfate administration(n=5)；E. macroscopic appearance；F. comparison of length of colon in each group(n=5)

圖1青年和老年小鼠結(jié)腸炎癥狀比較

Fig1Comparison of colitis symptoms between young and aged mice

老年和青年小鼠結(jié)腸炎腸黏膜屏障功能比較

腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)：電鏡下觀察小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞間超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)青年對(duì)照組小鼠腸上皮細(xì)胞排列緊密，上皮細(xì)胞表面絨毛排列整齊，細(xì)胞間緊密連接(tight junction,TJ)、橋粒結(jié)構(gòu)清晰；青年實(shí)驗(yàn)組小鼠腸上皮細(xì)胞表面絨毛稀疏，細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和完整性被破壞；老年對(duì)照組小鼠腸上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)不連續(xù)；老年實(shí)驗(yàn)組小鼠腸上皮表面絨毛稀疏，細(xì)胞間TJ模糊、腫脹，連續(xù)性和完整性被破壞(圖3)。

結(jié)腸上皮細(xì)胞TJ和黏附連接蛋白表達(dá)：Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，老年(t=0.981，P=0.382；t=3.035，P=0.039)和青年(t=6.110，P=0.004；t=3.860，P=0.018)實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin和occludin表達(dá)均明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，老年對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin(t=3.092，P=0.037)和occludin表達(dá)(t=2.564，P=0.062)明顯低于青年對(duì)照組，老年實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin(t=0.184，P=0.863)和occludin表達(dá)(t=0.399，P=0.710)明顯低于青年實(shí)驗(yàn)組(圖4)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，E-cadherin、occludin主要表達(dá)在腸上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜上，青年對(duì)照組E-cadherin和occludin染色的細(xì)胞數(shù)量較多且染色較深，青年實(shí)驗(yàn)組染色的細(xì)胞數(shù)量較少；老年對(duì)照組E-cadherin和occludin染色較淺，老年實(shí)驗(yàn)組基本上無(wú)染色(圖5)。

TNF-α:腫瘤壞死因子-α；IL- 6：白細(xì)胞介素- 6；aP<0.05,bP<0.01

TNF-α:tumor necrosis factor-α;IL- 6：inter leukin- 6;aP<0.05,bP<0.01

A.小鼠結(jié)腸病理表現(xiàn)(HE)；B.各組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分比較(n=5)；C.各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(n=5)；D.各組小鼠結(jié)腸組織IL- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(n=5)

A. histologic images of mice colon(HE)；B. comparison of histological colitis score in each group(n=5)；C. comparison of TNF-α mRNA relative expression of colon in each group(n=5)；D. comparison of IL- 6 mRNA relative expression of colon in each group(n=5)

圖2青年和老年小鼠結(jié)腸病理表現(xiàn)和炎癥因子表達(dá)的比較

Fig2Comparison of pathological manifestations and inflammatory cytokines between young and aged mice

討 論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于老年和青年IBD發(fā)病機(jī)制的研究甚少。本研究通過(guò)建立老年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型，比較了老年和青年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎腸黏膜屏障功能，結(jié)果顯示，衰老本身不會(huì)引起結(jié)腸炎，但會(huì)加重DSS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎；衰老引起腸上皮細(xì)胞間TJ、黏附連接(adherent junction,AJ)損傷，直接影響腸黏膜屏障功能，從而加重結(jié)腸炎癥狀。

研究衰老機(jī)制的動(dòng)物模型包括自然衰老小鼠和快速衰老小鼠 (senescence accelerated mouse，SAM)。普通小鼠壽命為2～2.5年，SAM壽命約1年。后者的特征為出現(xiàn)快速老化癥狀，如學(xué)習(xí)功能障礙等，故較廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中[11]。目前尚不清楚兩者在腸道菌群、腸黏膜屏障等方面的差異?，F(xiàn)采用的自然衰老小鼠壽命多大于1年，故本研究采用大于56周齡的自然衰老小鼠。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與人類潰瘍性結(jié)腸炎存在眾多相似性，因而應(yīng)用廣泛[12]。本研究給予2%DSS飲用水7 d，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉、便血，結(jié)腸病理可見(jiàn)結(jié)腸上皮破壞，隱窩丟失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。提示DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型建立成功。

圖3透射電鏡觀察腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

Fig3Ultrastructure of intestinal epithelial cells by transmission electron microscopy

Mr:相對(duì)分子質(zhì)量；aP<0.05,bP<0.01

Mr:relative molecular mass;aP<0.05,bP<0.01

A.小鼠結(jié)腸組織E-cadherin蛋白表達(dá)情況；B.各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=5)；C.小鼠結(jié)腸組織occludin蛋白表達(dá)情況；D 各組小鼠結(jié)腸組織occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=5)

A. protein expression of E-cadherin in colon by Western blotting；B. quantitative analysis of E-cadherin protein in each group (n=5)；C. protein expression of occludin in colon by Western blotting；D. quantitative analysis of occludin protein in each group(n=5)

圖4小鼠結(jié)腸組織E-cadherin蛋白和occludin蛋白表達(dá)情況

Fig4Protein expressions of E-cadherin and occludin in colons of aged and young mice

A.E-cadherin在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)分布；B.occludin在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)分布

A. E-cadherin expression in intestinal epithelial cell；B. occludin expression in intestinal epithelial cell

圖5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Fig5Immunohistochemical results

本研究中，老年小鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)食、飲水量減少，活動(dòng)減少，體質(zhì)量基本保持不變。與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組結(jié)腸組織IL- 6表達(dá)水平較高，與多數(shù)研究結(jié)果一致，即衰老過(guò)程伴隨促炎因子水平升高[13]。年齡相關(guān)的炎癥因子水平升高常伴有免疫系統(tǒng)損傷，引起老年人的健康狀況下降[5]。年齡相關(guān)的炎癥因子水平升高是老年患者感染、住院、死亡的危險(xiǎn)因素[14- 15]。目前尚不清楚衰老過(guò)程中炎癥水平升高的具體機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，衰老加重了實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎。具體表現(xiàn)為，與青年實(shí)驗(yàn)組比較，老年實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量下降更為明顯、DAI評(píng)分更高，病理表現(xiàn)嚴(yán)重及炎癥因子表達(dá)增加。與Albert等[16]研究結(jié)果一致，該研究顯示，Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)缺乏會(huì)加重DSS小鼠結(jié)腸炎。而B(niǎo)oulard等[17]進(jìn)一步研究顯示，TLR對(duì)于維持正常的腸黏膜屏障功能具有重要作用。

腸上皮細(xì)胞呈單層柱狀緊密排列，細(xì)胞間存在多種連接復(fù)合物，包括TJ、AJ和橋粒等，在維持腸黏膜屏障功能及其通透性中發(fā)揮重要作用。Claudin和occludin共同組成TJ主體，并通過(guò)Zo- 1與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白連接[18]。E-cadherin為鈣離子依賴的細(xì)胞間AJ分子，在形成組織結(jié)構(gòu)、抑制腫瘤方面均具有重要作用[19]。本研究從TJ、AJ方面進(jìn)行老年和青年小鼠腸黏膜屏障功能比較。通過(guò)電鏡觀察腸上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年對(duì)照組小鼠腸上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)不連續(xù)，而青年實(shí)驗(yàn)組和老年實(shí)驗(yàn)組腸上皮細(xì)胞表面絨毛疏松，細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)破壞。另外，通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸組織的E-cadherin和occludin的蛋白表達(dá)量還發(fā)現(xiàn)，老年小鼠腸黏膜E-cadherin和occludin的表達(dá)量均較青年小鼠低，提示老年腸道黏膜的屏障功能較青年弱。Ren等[20]發(fā)現(xiàn)，老年小鼠腸黏膜屏障功能損傷可能與TJ結(jié)構(gòu)破壞、TJ蛋白(Zo- 1、occludin)表達(dá)減少相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致。除了進(jìn)行老年和青年健康小鼠腸黏膜屏障功能的比較外，本研究還進(jìn)行老年和青年實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎腸黏膜屏障方面的比較。在給予相同濃度的DSS處理后，我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠E-cadherin和occludin表達(dá)亦較青年小鼠下降；可見(jiàn)無(wú)論是腸道黏膜的基礎(chǔ)屏障功能還是DSS處理后的屏障功能在老年鼠均較青年鼠下降更明顯，推測(cè)衰老本身可能是其中的危險(xiǎn)因素之一，而老年結(jié)腸炎的癥狀較為嚴(yán)重可能與之有關(guān)。衰老導(dǎo)致腸黏膜屏障功能減退的機(jī)制尚不明確。Suzuki等[21]發(fā)現(xiàn)，IL- 6通過(guò)增加腸上皮細(xì)胞的claudin- 2蛋白表達(dá)升高腸黏膜的滲透性，其作用依賴于MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，老年小鼠的結(jié)腸組織IL- 6表達(dá)較青年小鼠高，而這可能與腸黏膜屏障功能減退、滲透性升高有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衰老會(huì)加重DSS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎，其機(jī)制可能與年齡相關(guān)的腸上皮細(xì)胞的TJ、AJ損傷，從而導(dǎo)致腸黏膜屏障功能減退有關(guān)；而后者可能通過(guò)衰老過(guò)程中IL- 6水平升高引起。本研究的不足之處在于，小鼠的數(shù)量較少，存在個(gè)體差異，需要后續(xù)深入研究其機(jī)制。