α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)在進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療療效預(yù)測及預(yù)后中的意義

谷俊杰，孫 昭，趙 林，白春梅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100730

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤。在中國，結(jié)直腸癌在男性和女性最常見癌癥中分別居第4位和第3位，男性和女性結(jié)直腸癌的發(fā)病率分別為10.13%和9.25%[1]。早期結(jié)直腸癌可通過手術(shù)切除治愈，但約60%以上結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)即為Ⅲ/Ⅳ期，其中80%～90%患者為不可切除的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌?；熓侵委熗砥诮Y(jié)直腸癌的基本治療手段，一線化療方案為奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶方案(FOLFOX、XELOX、SOX)，有效率40%～50%，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中接受化療的中位生存期為20個(gè)月左右，不治療的患者中位生存期僅為5～6個(gè)月。

腫瘤是一種難以愈合的慢性損傷，其生物學(xué)行為并不完全由腫瘤細(xì)胞本身決定。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)包括腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、大量炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞和炎癥因子[2- 3]，可在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是TME中的重要組成部分，可影響腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后。CAFs是腫瘤基質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞，主要表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)和波形蛋白等[4]。CAFs可通過自分泌或旁分泌的方式分泌多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)、環(huán)氧化酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)、C-X-C結(jié)構(gòu)域趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12)和缺氧誘導(dǎo)因子- 1α(hypoxia-inducible factor- 1α，HIF- 1α)[2，5- 6]，與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥相關(guān)。研究顯示，CAFs可分泌IL- 6，活化JAK2/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥[3]。CAFs也可上調(diào)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase- 1，MMP- 1)的表達(dá)，降低頭頸部鱗狀細(xì)胞癌對(duì)頭孢菌素的敏感性[7]。而結(jié)直腸癌中CAFs與傳統(tǒng)化療藥物的關(guān)系尚未明確。Samuel等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在接受化療(奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中分別加入正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞分泌的條件培養(yǎng)液(normal colonic fibroblasts conditioned medium，CM-NCF)或腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的條件培養(yǎng)液(carcinoma-associated fibroblasts conditioned medium，CM-CAF)，后者藥物劑量效應(yīng)曲線遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于前者，提示了CAFs對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞有保護(hù)作用。而將化療(奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶)中的結(jié)直腸癌細(xì)胞系與CAF共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)CAFs可以通過PI3KCA/AKT/mTOR/Survivin及JAK2/STAT3途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞阻滯在G0或G1期，從而利于腫瘤細(xì)胞修復(fù)受損DNA以及幫助腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)確進(jìn)行有絲分裂，減少化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，導(dǎo)致耐藥。但是目前研究主要停留在分子生物及細(xì)胞生物水平，在結(jié)直腸癌患者中尚未報(bào)道過CAFs和原發(fā)耐藥的相關(guān)性。本研究擬在結(jié)直腸癌患者的臨床標(biāo)本中驗(yàn)證CAFs與結(jié)直腸癌患者對(duì)奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶化療療效及預(yù)后的相關(guān)性。

材料和方法

標(biāo)本來源及分組2013年6月至2017年2月在北京協(xié)和醫(yī)院就診的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織病理證實(shí)為進(jìn)展期結(jié)直腸癌；(2)有完整的影像學(xué)檢查可供腫瘤分期評(píng)價(jià)；(3)有足夠的組織標(biāo)本可供免疫組織化學(xué)檢測；(4)接受奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶化療(FOLFOX、XELOX、SOX)；(5)通過實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)缺乏足夠的組織標(biāo)本供免疫組織化學(xué)檢測；(2)化療療效評(píng)價(jià)為病情穩(wěn)定(stable disease，SD)。將患者分為以下兩組：(1)化療耐藥組：Ⅳ期結(jié)直腸癌患者接受一線化療后首次病情評(píng)估為病情進(jìn)展(progressive disease，PD)或Ⅲ期結(jié)直腸癌患者術(shù)后輔助化療結(jié)束后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；(2)化療敏感組：局部晚期結(jié)直腸癌患者在接受一線化療后出現(xiàn)病情緩解(partial response，PR)或完全緩解(complete response，CR)。

臨床資料采集采集并記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、病理類型、分化程度、腫瘤分期、病變部位、化療期間的影像學(xué)資料。

免疫組織化學(xué)檢測手術(shù)切除的組織標(biāo)本或穿刺活檢組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚切片。采用免疫組織化學(xué)方法檢測α-SMA蛋白的表達(dá)情況。其中，一抗為鼠抗人α-SMA抗體(塞維爾生物GB13044，中國)，濃度為1∶1000；二抗為山羊抗鼠通用抗體(DAKO K5007)，采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，按照試劑說明書操作。

結(jié)果判讀所有石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果由2名病理科醫(yī)師(不清楚患者臨床資料)獨(dú)立閱片，如果結(jié)論不一致，則由第3位病理科醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估并做最終決定。α-SMA蛋白表達(dá)于CAFs的細(xì)胞漿，細(xì)胞漿染為棕黃色為陽性細(xì)胞。通過染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比共同判斷陰陽性。染色強(qiáng)度計(jì)分方法：無 0分，淡棕色 1分，深棕色 2分；隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的平均值：陽性細(xì)胞<10% 0分，陽性細(xì)胞10%～40% 1分，陽性細(xì)胞 40%～70% 2分，陽性細(xì)胞 >70% 3分。α-SMA低表達(dá)指總計(jì)分 0～2分，高表達(dá)指總計(jì)分 3～5分(圖1)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，α-SMA蛋白表達(dá)與臨床特征及化療療效間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，α-SMA蛋白表達(dá)與無進(jìn)展生存時(shí)間的關(guān)系采用Kaplan-Meier法并繪制生存曲線；采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，取α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

患者臨床特征共52例進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者入組，其中，男30例，女22例，中位年齡52歲；高分化者5例(9.6%)，中分化者37例(71.2%)，低分化者7例(13.5%)，未分化者3例(5.8%)；左半結(jié)腸癌40例(76.9%)，右半結(jié)腸癌11例(21.2%)，左右半結(jié)腸癌1例(1.9%)；化療敏感組30例，化療耐藥組22例。

α-SMA蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系52例患者中，29例(55.8%)為α-SMA高表達(dá)，α-SMA蛋白的表達(dá)與患者的年齡(χ2=0.113，P=0.730)、性別(χ2=0.515，P=0.332)、腫瘤部位(χ2=3.675，P=0.159)、組織分化程度(χ2=1.852，P=0.604)均無顯著相關(guān)性(表1)。

α-SMA蛋白表達(dá)與化療療效的關(guān)系52例患者中，29例α-SMA高表達(dá)，化療耐藥19例(65.5%，19/29)；23例α-SMA低表達(dá)，化療耐藥3例(13.0%，3/23)；α-SMA高表達(dá)者化療耐藥率顯著高于低表達(dá)者(χ2=14.470，P=0.000)(表1)。

α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

α-SMA：α-smooth muscle actin

A.α-SMA低表達(dá)；B. α-SMA高表達(dá)

A. low α-SMA expression；B. high α-SMA expression

圖1癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×40)

Fig1Immunohistochemical staining for α-SMA expression in carcinoma-associated fibroblasts(×40)

表1 52例進(jìn)展期結(jié)腸癌患者α-SMA表達(dá)與其臨床病理特征及化療療效間的關(guān)系Table 1 Relationship between α-SMA expression and clinicopathological characteristics and chemotherapy response in 52 patients with advanced colorectal cancer

α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

α-SMA：α-smooth muscle actin

圖2無進(jìn)展生存的Kaplan-Meier生存分析曲線

Fig2Kaplan-Meier curves for progression-free survival

討 論

奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶方案是晚期結(jié)直腸癌的一線化療方案。奧沙利鉑和氟尿嘧啶均是通過抑制DNA合成產(chǎn)生細(xì)胞毒作用和抗腫瘤活性。奧沙利鉑通過產(chǎn)生水化衍生物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成，而氟尿嘧啶類藥物是胸苷酸合成酶抑制劑，通過阻止脫氧尿苷酸(dUMP)甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?dTMP)，從而影響DNA的合成。奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶的原發(fā)性耐藥機(jī)制有多種原因，包括基因突變、表達(dá)耐藥相關(guān)蛋白和形成免疫抑制性TME等。

根據(jù)“種子和土壤”假說，腫瘤基質(zhì)(土壤)對(duì)腫瘤細(xì)胞(種子)的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[9]。CAFs是腫瘤基質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞，主要來源于正常的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、上皮細(xì)胞及骨髓干細(xì)胞。CAFs形態(tài)呈紡錘形，胞體較大，富含彈力纖維，與肌成纖維細(xì)胞相似，其表達(dá)的生物標(biāo)記物主要有α-SMA、FAP、波形蛋白、人S100鈣結(jié)合蛋白A4(human S100 calcium binding protein A4，S100A4)和平足蛋白(podoplanin，PDPN)[10]。大量文獻(xiàn)顯示CAFs可促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)皮細(xì)胞增生，血管新生，促進(jìn)腫瘤生長、侵襲，但少有文獻(xiàn)報(bào)道CAFs與結(jié)腸癌化療耐藥及預(yù)后間的關(guān)系。Mesker等[11]認(rèn)為豐富的腫瘤基質(zhì)與腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)。Tsujino等[12]也發(fā)現(xiàn)α-SMA高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者無病生存期較α-SMA低表達(dá)的患者短。Mercedes等[13]探討了CAFs的標(biāo)記物α-SMA、成纖維細(xì)胞特異蛋白(fibroblast specific protein，F(xiàn)SP1)、FAP及M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物CD163與結(jié)直腸癌患者預(yù)后間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SMA、FSP1、FAP及CD163高表達(dá)的患者，其總生存期和無病生存期較短，提示CAFs和M2型巨噬細(xì)胞與結(jié)腸癌不良預(yù)后相關(guān)。Choi等[14]探討了α-SMA、S100A4和PDPN與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PDPN(-)/α-SMA(高)或PDPN(-)/S100A4(高)的患者預(yù)后不佳。本研究以α-SMA表達(dá)標(biāo)記CAFs，探索了α-SMA表達(dá)與進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療療效及預(yù)后間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SMA高表達(dá)的患者更易出現(xiàn)奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物的原發(fā)耐藥，且無進(jìn)展生存期更短，提示CAFs可能成為潛在的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，α-SMA表達(dá)在進(jìn)展期結(jié)直腸癌中具有重要意義，與其對(duì)化療原發(fā)耐藥相關(guān)，可作為預(yù)測進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療療效的分子標(biāo)志物。近年來，靶向治療廣泛應(yīng)用于臨床，成為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)，CAFs可能成為潛在的腫瘤治療的靶點(diǎn)。