基于HIFs/RhoB/ROCK通路探討黃芪甲苷改善缺氧誘導心力衰竭大鼠心肌損傷的作用機制

摘要""目的：觀察黃芪甲苷（AST）對缺氧誘導的心力衰竭大鼠血流動力學相關指標、心肌肌鈣蛋白及細胞凋亡的改善作用，并探討其通過調(diào)節(jié)缺氧誘導因子（HIFs）/RhoB蛋白（RhoB）/Rho相關激酶（ROCK）信號通路的改善機制。方法：采用大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素建立心力衰竭大鼠模型，AST治療后，再包裝HIF-1α-干擾腺病毒（HIF-1αsiRNA）和HIF-2α-干擾腺病毒（HIF-2αsiRNA）干預大鼠。將大鼠分為假手術組（Sham組）、心力衰竭組（HF組）、心力衰竭＋AST組（HF＋AST組）、心力衰竭＋AST＋陰性對照組（HF＋AST＋NC組）、心力衰竭＋AST＋siRNA HIF-1α組（HF＋AST＋siRNA HIF-1α組）及心力衰竭＋AST＋siRNA HIF-2α組（HF＋AST＋siRNA HIF-2α組）。測定大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、心率、收縮壓、舒張壓及平均血壓（MBP）變化；通過流式細胞術檢測活性氧變化。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測HIF-1α、HIF-2α"mRNA表達水平；蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測HIF-1α、HIF-2α、RhoB、ROCK表達變化；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Caspase-3表達水平。結果：與HF組比較，HF＋AST組大鼠心率、舒張壓、MBP、cTnI、活性氧、Caspase-3水平下降，心肌細胞HIF-1α、HIF-2α"mRNA與蛋白表達升高，RhoB和ROCK蛋白表達升高（P＜0.05）；與HF＋AST＋NC組比較，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠心率、收縮壓、MBP升高，cTnI、活性氧、Caspase-3水平升高，心肌細胞RhoB、ROCK蛋白表達下降（P＜0.05）。結論：AST可減輕缺氧誘導的心力衰竭模型大鼠心肌細胞損傷，其機制可能與HIFs/RhoB/ROCK通路相關。

關鍵詞""心力衰竭；缺氧誘導的心肌細胞損傷；黃芪甲苷；缺氧誘導因子；RhoB蛋白；Rho相關激酶；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.06.009

The Mechanism of Astragaloside on Myocardium Injury in Rats of Hypoxic-induced Heart Failure Based on HIFs/RhoB/ROCK Pathway

ZHANG Jia QIN Rui LI Gang

1.Hubei University of Chinese medicine， Wuhan 430065， Hubei， China; 2.Affiliated Hospital of Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430074， Hubei， China; 3.Hubei Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430074， Hubei， China

Corresponding Author "QIN Rui， E-mail： ring55202824@163.com

Abstract Objective：To observe the effect of astragaloside（AST） on hemodynamic parameters，troponin and apoptosis in hypoxia-induced heart failure rats，and to explore the effect of AST by regulating hypoxia inducible factor（HIFs） /RhoB protein（RhoB）/Rho-associated kinase（ROCK） signaling pathway.Methods：The rat model of heart failure was established by injecting adriamycin hydrochloride into the tail vein.After AST treatment，the rats were treated with HIF-1α-interfering adenovirus（HIF-1αsiRNA） and HIF-2α-interfering adenovirus（HIF-2αsiRNA）.The rats were divided into Sham group，heart failure group（HF group），HF＋AST group，HF＋AST＋negative control group（HF＋AST＋NC group），HF＋AST＋siRNA HIF-1α"group（HF＋AST＋siRNA HIF-1α"group），heart failure＋AST＋siRNA HIF-2α"group（HF＋AST＋siRNA HIF-2α"group）.The changes of cardiac troponin I（cTnI），heart rate，systolic blood pressure，diastolic blood pressure，and mean blood pressure（MBP） were measured and reactive oxygen species were detected by flow cytometry.The mRNA expressions of HIF-1α"and HIF-2α"were detected by Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The expressions of HIF-1α，HIF-2α，RhoB，and ROCK were detected by Western Blot.The expression level of Caspase-3 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Compared with HF group，the heart rate，diastolic blood pressure，and MBP in the HF＋AST group increased，the levels of cTnI，ROS and Caspase-3 decreased，the mRNA and protein expressions of HIF-1α"and HIF-2α"increased，and the protein expressions of RhoB and ROCK increased（P＜0.05）.Compared with HF＋AST＋NC group，the heart rate，systolic blood pressure and MBP of rats in the HF＋AST＋siRNA HIF-1α"group and HF＋AST＋siRNA HIF-2α"group increased，and the levels of cTnI，reactive oxygen species and Caspase-3 significantly increased，the expression of RhoB and ROCK protein in cardiomyocytes decreased（P＜0.05）.Conclusion：AST could attenuate cardiomyocyte injury in rats of hypoxic-induced heart failure，and the mechanism might be related to HIFs/RhoB/ROCK pathway.

Keywords""heart failure; hypoxia-induced cardiomyocyte injury; astragaloside; hypoxia inducible factor; RhoB protein; Rho related kinase; rats; experimental study

心力衰竭是各種心臟疾病終末階段的表現(xiàn)，根本原因是長期缺氧引起的心肌損傷^［1］。因此，改善心肌缺氧可能是治療心力衰竭、延緩心臟病進展的有效方法。黃芪具有多種藥理作用，在我國已廣泛用于治療免疫力低下、糖尿病、病毒性心肌炎等疾病^［2］。黃芪甲苷（astragaloside，AST）是黃芪具有代表性的單體活性成分，有多種藥理作用，包括抗炎、抗纖維化、抗氧化應激、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤、增強免疫力、抗病毒等^［3］。在心血管疾病中，AST通過舒張血管、擴張冠狀動脈和增強心肌收縮力減輕缺血缺氧引起的心肌損傷^［4］。然而，AST治療缺氧誘導的心肌損傷具體機制尚未明確。本研究采用AST干預用阿霉素建立缺氧誘導的心力衰竭大鼠模型，觀察AST是否通過缺氧誘導因子（HIFs）/RhoB蛋白（RhoB）/Rho相關激酶（ROCK）通路影響心力衰竭大鼠模型心肌細胞HIF-1α、HIF-2α、活性氧、RhoB、ROCK及半胱氨酸蛋白酶"3（Caspase-3）表達變化，從而在心肌損傷中發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量（250±30）g，由湖北省中醫(yī)院實驗動物中心提供。所有SD大鼠均飼養(yǎng)于實驗室籠中，每籠5只，維持室內(nèi)溫度23～29 ℃，濕度50%～60%，每日12 h晝夜交替。本研究經(jīng)動物倫理委員會審核通過（編號：HDSZYY-2020-01305）。

1.2 實驗分組及干預方法

將實驗動物分為假手術組（Sham組）、心力衰竭組（HF組）、心力衰竭＋AST組（HF＋AST組）、心力衰竭＋AST＋陰性對照組（HF＋AST＋NC組）、心力衰竭＋AST＋siRNA HIF-1α組（HF＋AST＋siRNA HIF-1α組）及心力衰竭＋AST＋siRNA HIF-2α組（HF＋AST＋siRNA HIF-2α組）。其中Sham組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水；HF組大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素造模；HF＋AST組大鼠造模后給予AST（80 mg/kg，隔日灌胃，治療4周）；HF＋AST＋NC組、HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠造模并給予AST治療后分別注射陰性對照腺病毒、HIF-1α"siRNA病毒及HIF-2α"siRNA病毒。

1.3 心力衰竭大鼠模型的建立

采用阿霉素尾靜脈注射造模，即每周沿大鼠尾靜脈緩慢注射鹽酸阿霉素2 mg/kg（批號：D1515），持續(xù)6周，累計用量12 mg/kg。定期觀察大鼠一般情況，如腹水、眥分泌物、毛發(fā)和體重變化等。

1.4 心肌肌鈣蛋白I（cTnI）測定

抽取大鼠靜脈血2 mL，離心分離血清，采用全自動化生化分析儀測定cTnI含量，具體方法參照試劑盒說明進行。

1.5 血流動力學相關指標測定

麻醉：大鼠稱重后采用戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）腹腔注射麻醉；頸外靜脈插管：取頸前正中切口，分離右側(cè)皮下組織，游離頸外靜脈，迅速向心插入用肝素抗凝的導管并固定；頸總動脈插管：頸部分離頸總動脈，用肝素抗凝的導管經(jīng)頸總動脈插入左心房并固定，經(jīng)壓力換能器將導管與微機相連，通過BL-420E＋生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測記錄心率、收縮壓、舒張壓及平均血壓（MBP），實驗重復3次取平均值。

1.6 心肌細胞分離

使用常規(guī)朗根多夫灌注裝置分離心肌細胞。大鼠腹腔注射肝素2 000 U/kg，20 min后用2%戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）麻醉。打開胸腔后，迅速取出帶有主動脈的心臟，用冰臺氏液清洗。之后將心臟植入朗根多夫灌注裝置中，以6 mL/min洗滌15 min。清洗后，切開左心室，吹10 min使心肌細胞分散。10 min后，在37 ℃下培養(yǎng)心肌細胞。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染

HIF-1α"siRNAs、HIF-2α"siRNAs和陰性對照（NC）由中國上?；蛑扑幑竞铣?。將心肌細胞（每孔5×10⁴個細胞）均勻接種于6孔板中。為探討干擾心肌細胞HIF-1α、HIF-2α表達對實驗的影響，在37 ℃下培養(yǎng)8 h后，根據(jù)說明書應用Lipofectamine 3000試劑（Invitrogen）將心肌細胞轉(zhuǎn)染為NC、HIF-1α"siRNAs、HIF-2α"siRNAs。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測

使用Trizol試劑（Invitrogen）從處理后的心肌細胞或心臟組織中提取總RNAs。RNA通過第1鏈cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR預混液（Invitrogen）進行qRT-PCR反應。HIF-1α和HIF-2α"mRNA表達水平，采用2^－△△Ct計算。引物序列見表1。

1.9 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測RhoB、ROCK、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達

使用含有蛋白酶抑制劑的冷蛋白抽提試劑RIPA（Solarbio）從處理后的心肌細胞或心肌組織中獲得總蛋白。采用考馬斯亮藍法（中國上海碧云天生物技術有限公司）定量蛋白質(zhì)濃度。樣本用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（賽默飛世爾科技公司）進行電泳和轉(zhuǎn)移。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入RhoB（ab277779，1∶100）、ROCK（ab45171，1∶5 000）、HIF-1α（PB9253，1∶1 000）、HIF-2α（ab109616，1∶1 000）一抗，在4 ℃條件下孵化過夜，之后加入二抗停留2 h。洗滌后，用電化學發(fā)光（ECL）底物試劑盒（賽默飛世爾科技公司）處理膜，通過iBright FL1500智能成像系統(tǒng)（賽默飛世爾科技公司）觀察結果。

1.10 流式細胞術檢測活性氧

收集各組心肌細胞，在37 ℃條件下加入2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）溶液（10 μmol/L，中國上海碧云天生物技術有限公司，批號：S0033-1）停留20 min。使用Earle（厄爾）培養(yǎng)基洗滌后，心肌細胞懸浮在400 μL Earle溶液中，采用流式細胞儀（BD生物科學）觀察結果。

1.11 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Caspase-3

收集各組心肌細胞，加入細胞裂解緩沖液后，4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min后取上清液，參照ELISA試劑盒（中國上海碧云天生物技術有限公司，批號：C1115）操作步驟進行，使用酶標儀測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算Caspase-3表達水平。

1.12 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清cTnI水平比較

與Sham組比較，HF組大鼠血清cTnI水平升高（P＜0.05）；與HF組比較，HF＋AST組大鼠血清cTnI水平降低（P＜0.05）；與HF＋AST＋NC組比較，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠血清cTnI水平均升高（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 各組大鼠心肌細胞HIF-1α、HIF-2α表達水平比較

與Sham組比較，HF組大鼠心肌細胞HIF-1α、HIF-2α表達均上調(diào)（P＜0.05）；與HF組比較，HF＋AST組大鼠心肌細胞HIF-1α、HIF-2α表達水平均上調(diào)（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 各組大鼠心肌細胞RhoB、ROCK、HIF-1α及HIF-2α蛋白表達比較

與Sham組比較，HF組大鼠心肌組織RhoB和ROCK蛋白表達水平降低（P＜0.05），HIF-1α、HIF-2α蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HF組比較，HF＋AST組RhoB、ROCK蛋白表達水平HIF-1α、HIF-2α蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與HF＋AST＋"NC組比較，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組RhoB和ROCK蛋白表達水平均降低（P＜0.05）。詳見圖3。上述結果提示，AST可升高缺氧誘導心力衰竭大鼠心肌細胞RhoB和ROCK蛋白表達水平，干擾HIFs表達后抑制該作用。

2.4 各組大鼠心肌細胞Caspase-3及活性氧水平比較

與Sham組比較，HF組大鼠心肌組織Caspase-3及活性氧水平升高（P＜0.05）；與HF組比較，HF＋AST組大鼠心肌組織Caspase-3及活性氧水平降低（P＜0.05）；與HF＋AST＋NC組比較，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠心肌組織Caspase-3及活性氧水平均升高（P＜0.05）。詳見圖4及圖5。上述結果表明，AST可顯著下調(diào)心力衰竭大鼠心肌細胞Caspase-3及活性氧水平，但干擾HIFs表達可顯著逆轉(zhuǎn)該作用。

2.5 各組大鼠血流動力學相關指標比較

與Sham組比較，HF組大鼠心率、收縮壓、舒張壓和MBP均下降；HF＋AST組大鼠心率、舒張壓和MBP高于HF組，但收縮壓稍低于HF組。與HF＋AST＋NC組比較，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組大鼠心率顯著加快，收縮壓和MBP顯著升高；HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠心率、收縮壓、舒張壓和MBP均顯著升高，HF＋AST＋siRNA HIF-1α組及HF＋AST＋siRNA HIF-2α組大鼠收縮壓及MBP均低于HF＋AST組。詳見圖6。

3 討論

心力衰竭指各種心臟疾病導致心臟收縮和/或舒張功能異常，心排血量不能滿足全身組織基本代謝所需的復雜病理生理過程和臨床綜合征^［5］。多種因素均導致心力衰竭的發(fā)展，但心肌缺氧可能是引起心肌損傷、心室重構的重要因素。目前，尋找一種安全有效的抗心肌缺氧損傷的藥物已成為治療心力衰竭的重要目標。AST是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，對心腦血管疾病有顯著的保護作用^［6］。本研究采用HIF-1α和HIF-2α干擾腺病毒，結合AST干預阿霉素誘導的心力衰竭大鼠模型，證實了AST對缺氧誘導心肌細胞損傷的保護作用。

細胞凋亡的過程是機體多個凋亡相關因子相互作用后，形成凋亡誘導信號，傳遞到啟動型Caspase，并使其活化，最終導致蛋白質(zhì)裂解和細胞解體死亡。有研究表明，活性氧通過線粒體途徑參與細胞凋亡，細胞內(nèi)過高的活性氧水平直接攻擊線粒體膜，使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導致細胞色素C、凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等釋放，繼而激活Caspase^［7］，啟動型Caspase通過內(nèi)外兩種途徑活化，最終通過執(zhí)行型Caspase的活化完成細胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3作為執(zhí)行型Caspase中的凋亡關鍵蛋白酶，可特異性裂解底物，使機體細胞發(fā)生形態(tài)學改變和生化改變，從而發(fā)生細胞凋亡^［8］。本研究結果表明，缺氧引起心肌細胞凋亡，AST可減少Caspase-3及活性氧產(chǎn)生，即減少心肌細胞凋亡，實現(xiàn)對心肌細胞的保護作用。

HIF是一種由α亞基和β亞基組成的異源二聚體，是細胞氧穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子^［9］。在缺血/缺氧過程中，HIF-1α和HIF-2α作為功能亞基，激活與缺氧應激蛋白相關的轉(zhuǎn)錄因子，從而介導細胞對缺氧的適應性反應^［10］。HIF-1α和HIF-2α在心臟疾病中有潛在影響。HIF的激活對心臟功能減退有顯著影響^［11］。HIF-1α可能是肥胖和心力衰竭之間的調(diào)節(jié)因素^［1］，抑制HIF-1α可誘導缺氧誘導增強子RNA進而改善心臟疾病^［12］；HIF-2α在缺氧小鼠心室功能中發(fā)揮作用，并調(diào)節(jié)肺動脈高壓相關癥狀^［13］。本研究結果顯示，缺氧可顯著上調(diào)心力衰竭大鼠模型心肌細胞HIF-1α和HIF-2α表達，提示HIF-1α和HIF-2α上調(diào)可能是心肌組織為應對缺氧損傷進行的保護性措施；經(jīng)HIF-1α和HIF-2α干擾腺病毒干預后，AST對心力衰竭大鼠模型的保護作用被逆轉(zhuǎn)，證實了AST通過介導HIF表達從而改善缺氧誘導的心肌損傷。

Rho蛋白是小三磷酸鳥苷（GTP）結合蛋白的Ras超家族中的成員。Rho通過激活ROCK從而發(fā)揮多種生物效應，如血管平滑肌的收縮、肌動蛋白細胞骨架的形成、細胞的黏附和遷移、細胞的增殖和凋亡、基因的表達等^［14］。相關研究顯示，Rho/ROCK通路與多種心血管疾病相關，如心力衰竭^［15］、缺血-再灌注損傷^［16］、肺動脈高壓^［17］、腦血管痙攣^［18］。本研究結果顯示，AST通過調(diào)節(jié)心力衰竭模型大鼠HIF-1α和HIF-2α以顯著上調(diào)RhoB和ROCK，且RhoB/ROCK通路參與了AST介導HIF-1α和HIF-2α對心力衰竭的緩解作用。

本研究結果還顯示，HF組大鼠血壓低于Sham組，AST可改善HF組大鼠血壓；干擾HIF-1α或HIF-2α表達后，AST對心力衰竭模型組大鼠血壓改善減弱。說明血流動力學可一定程度提示AST對缺氧誘導心肌細胞凋亡的改善情況。

綜上所述，AST通過HIFs/RhoB/ROCK通路對心力衰竭大鼠有潛在的保護作用，可在心力衰竭的臨床治療中發(fā)揮重要的參考價值，其作用機制與HIFs/RhoB/ROCK通路有關，今后仍需深入研究黃芪甲苷在心力衰竭中的分子機制，以期為進一步臨床應用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-10-13）

（本文編輯"薛妮）