麝香保心丸基于AMPK/PGC-1α通路調(diào)控線粒體功能改善心肌能量代謝的實(shí)驗(yàn)研究

摘要""目的：觀察麝香保心丸對(duì)冠心病心肌能量代謝的影響及作用機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Control組，H9c2心肌細(xì)胞）、模型組（Model組，缺氧/復(fù)氧處理H9c2心肌細(xì)胞）、麝香保心丸低劑量組（SBP-L組，100 μg/L麝香保心丸處理）、麝香保心丸中劑量組（SBP-M組，200 μg/L麝香保心丸處理）、麝香保心丸高劑量組（SBP-H組，400 μg/L麝香保心丸處理）和曲美他嗪組（TMZ組，曲美他嗪處理）。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，腺苷5′-三磷酸生物發(fā)光測(cè)定試劑盒檢測(cè)線粒體三磷酸腺苷（ATP）含量，5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）染色測(cè)定試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位；2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法檢測(cè)細(xì)胞活性氧；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)估。采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）和胱天蛋白酶9（Caspase-9）表達(dá)；通過Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（PGC-1α）和二磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）表達(dá)。選擇SBP-H組進(jìn)行AMPK抑制劑（多索嗎啡肽，CC）干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡、線粒體ATP含量及PGC-1α、AMPK表達(dá)。結(jié)果：模型組細(xì)胞活性、線粒體ATP含量、線粒體膜電位、SOD含量、GSH-Px含量、PGC-1α和磷酸化AMPK（p-AMPK）表達(dá)顯著下降，ROS含量、MDA含量、細(xì)胞凋亡顯著上升（P＜0.05）。SBP-L組、SBP-M組、SBP-H組、TMZ組上述細(xì)胞功能和蛋白質(zhì)表達(dá)被逆轉(zhuǎn)，且SBP-H組和TMZ組作用顯著。SBP-H組加入AMPK抑制劑后，細(xì)胞凋亡抑制、PGC-1α和p-AMPK表達(dá)上調(diào)被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：麝香保心丸通過AMPK/PGC-1α通路促進(jìn)線粒體功能，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞能量代謝。

關(guān)鍵詞""冠心病；麝香保心丸；H9c2心肌細(xì)胞；二磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α；線粒體；能量代謝；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.06.007

The Improvement of Myocardial Energy Metabolism by Regulating Mitochondrial Function of Shexiang Baoxin Pills Based on AMPK/PGC-1α"Pathway

SONG Xiaolong， PAN Renyou， GU Yuexing， SONG Jun， TU Dongyun， WU Deming， NI Qimeng

Yancheng Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yancheng Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Yancheng 224001， Jiangsu， China， E-mail： edusongxiaolong@126.com

Abstract Objective：To observe the effect of Shexiang Baoxin pills on myocardial energy metabolism of coronary heart disease.Methods：The H9c2 cardiomyocytes were divided into Control group，Model group（H9c2 cardiomyocytes treated with hypoxia/reoxygenation），low-dose Shexiang Baoxin pills group（SBP-L group，100 μg/L Shexiang Baoxin pills treatment），medium-dose Shexiang Baoxin pills group（SBP-M group，200 μg/L Shexiang Baoxin pills treatment），high-dose Shexiang Baoxin pills group（SBP-H group，400 μg/L Shexiang Baoxin pills treatment） and trimetazidine group（TMZ group，trimetazidine treatment）.The cell viability was detected Using cell count kit-8（CCK-8）.The contents of mitochondrial adenosine triphosphate（ATP） was detected by adenosine 5′-triphosphate bioluminescence assay kit.Mitochondrial membrane potential was detected with 5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethylbenzimidazole carbocyanine iodide（JC-1） staining kit.Reactive oxygen species were detected by 2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA） staining.The contents of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-Px） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Apoptosis detection kit was used to evaluate apoptosis.The expressions of apoptosis-related genes Bcl-2 associated X protein（Bax），B lymphoblastoma-2（Bcl-2），Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western Blot.The expression of peroxisome proliferator activating receptor γ"coactivator 1α（PGC-1α） and adenosine diphosphate（AMP）-activated protein kinase（AMPK） were detected by Western Blot and real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The SBP-H group was treated with AMPK inhibitor（CC） to detect cell apoptosis，mitochondrial ATP content，PGC-1α"and AMPK expression.Results：The cell activity，mitochondrial ATP content，mitochondrial membrane potential，SOD content，GSH-Px content，PGC-1α"and phosphorylated AMPK（p-AMPK） expression in the model group were significantly decreased，while ROS，MDA and cell apoptosis were significantly increased.The above cell function and protein expression were reversed in the SBP-L group，SBP-M group，SBP-H group and TMZ group，and the effects of SBP-H group and TMZ group were significant.After addition of AMPK inhibitor in the SBP-H group，apoptosis inhibition，PGC-1α"and up-regulation of p-AMPK expression were reversed.Conclusion：Shexiang Baoxin pills could promote mitochondrial function through AMPK/PGC-1α"pathway，and then improve energy metabolism of cardiomyocytes.

Keywords""coronary heart disease; Shexiang Baoxin pills; H9c2 cardiomyocytes; adenosine diphosphate（AMP）-activated protein kinase; peroxisome proliferator activating receptor γ"coactivator 1α; mitochondria; energy metabolism; experimental study

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心病）是由于各種病因?qū)е滦募⊙海ɑ蜓酰┕┬柚g失衡，出現(xiàn)的臨床癥候^［1］。冠心病的特征是動(dòng)脈粥樣硬化，引起血管管腔狹窄或梗阻，導(dǎo)致心絞痛、心肌梗死等缺血性心臟疾病^［2］。線粒體主要功能是產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），為細(xì)胞正常生理活動(dòng)提供必需的能量^［3］。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變伴隨血管腔狹窄甚至阻塞，病人出現(xiàn)心肌缺血，心肌血液灌注變少，心肌缺血缺氧，心臟能量代謝供需平衡被打破，對(duì)心肌產(chǎn)生一系列影響，包括結(jié)構(gòu)、功能、電生理和代謝等方面^［4］。多數(shù)ATP的生成及其氧化磷酸化是在線粒體中進(jìn)行，心肌細(xì)胞從血液中攝取脂肪酸、葡萄糖等底物進(jìn)行β氧化和糖酵解，產(chǎn)生乙酰輔酶，之后的過程基本在線粒體完成，包括三羧酸循環(huán)、氧化-磷酸化過程、ATP的轉(zhuǎn)移和利用^［5］。心臟中大量存在線粒體，約占其質(zhì)量的35%，提供所需能量的90%以上^［6］。心臟對(duì)能量代謝敏感，線粒體在能量代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，缺氧引起線粒體合成ATP不足是造成心肌損傷的主要原因^［7］。線粒體功能異常影響心肌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)或內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)。線粒體功能障礙是心肌梗死或終末期冠心病后缺血性心肌病和再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)。以往研究表明，分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）通過二磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（PGC-1α）途徑調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)，改善糖尿病心肌細(xì)胞損傷^［8］。

中醫(yī)藥已使用數(shù)千年，在世界范圍內(nèi)應(yīng)用越來(lái)越廣，特別是在心血管疾病的治療方面，相關(guān)研究顯示，中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)心肌線粒體代謝，改善心肌能量代謝^［9-10］，但具體機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步深入研究。麝香保心丸是臨床廣泛用于治療冠心病的經(jīng)典中成藥，源自宋代《太平惠民和劑局方》之名方蘇合香丸，本方由麝香、蟾酥、人參等7味中藥組成，具有芳香開竅、理氣止痛的功效。2011年由葛均波院士和范維琥教授領(lǐng)銜開展了一項(xiàng)關(guān)于麝香保心丸符合國(guó)際規(guī)范的大型中醫(yī)藥循證研究（MUST）證實(shí)，麝香保心丸治療后主要心血管不良事件發(fā)生率較安慰劑組降低26.9%，可有效緩解病人臨床癥狀，顯著提升生活質(zhì)量^［11］。目前麝香保心丸明確的作用機(jī)制包括擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血管炎癥反應(yīng)和促進(jìn)治療性血管新生^［12-15］，關(guān)于能量代謝方面研究較少。本研究采用缺氧/復(fù)氧處理H9c2心肌細(xì)胞作為冠心病的體外模型，探討麝香保心丸對(duì)冠心病心肌能量代謝的影響及AMPK/PGC-1α發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清和1%牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）完全培養(yǎng)基洗滌H9c2細(xì)胞（Procell，武漢，中國(guó)），以1 500 r/min離心5 min。之后使用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞在大皿中重懸，在37 ℃、5%的CO₂環(huán)境中培養(yǎng)。本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（編號(hào)：2021K012）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

麝香保心丸購(gòu)自上海和黃藥業(yè)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）染色測(cè)定試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）緩沖液，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購(gòu)自中國(guó)北京Beyotime；腺苷5′-三磷酸生物發(fā)光測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京Vazyme生物技術(shù)有限公司（A211-01）；Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2），胱天蛋白酶3（Caspase-3）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）、PGC-1α、AMPK及磷酸化AMPK（p-AMPK）大鼠多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗購(gòu)自北京Beyotime（A0208）；TRIzol試劑購(gòu)自中國(guó)北京（Sigma-Aldrich，北京，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連Takara；AMPK抑制劑多索嗎啡肽（Dorsomorphin）又稱Compound C（CC）購(gòu)自中國(guó)上海aladdin（D139352）。酶標(biāo)儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）；熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）；DTX 880多模檢測(cè)器（Beckman Coulter）；MyiQ2 PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自中國(guó)北京Sigma Aldrich；流式細(xì)胞儀（BD FACSCanto）。

1.3 細(xì)胞模型和分組

通過AnaeroPack系統(tǒng)構(gòu)建缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型。AnaeroPack系統(tǒng)是一種氣體控制試劑，其消耗氧氣并產(chǎn)生CO₂，由以下3個(gè)部件組成：封閉式培養(yǎng)袋、一次性厭氧氣體袋和氧氣指示器。將培養(yǎng)1 d的H9c2細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2次，在無(wú)糖和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后將細(xì)胞置于含有AnaeroPack的密封密閉容器中，氧濃度在1 h內(nèi)降至0.1%以下，保持CO₂濃度約5%。H9c2細(xì)胞分別處理4、6、10、12 h，從密閉容器中取出培養(yǎng)瓶并在37 ℃的CO₂培養(yǎng)箱中用正常培養(yǎng)基替換終止缺氧。

將細(xì)胞分為6組，對(duì)照組（Control組）：對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)；模型組（Model組）：經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理的H9c2心肌細(xì)胞；麝香保心丸干預(yù)組：建立缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型后，使用低劑量（100 μg/L麝香保心丸，SBP-L組）、中劑量（200 μg/L麝香保心丸，SBP-M組）、高劑量（400 μg/L，SBP-H組）處理；曲美他嗪組（TMZ組）：建立缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型后，使用曲美他嗪（TMZ，300 μg/L）處理；AMPK抑制劑組（SBP-H＋CC組）：使用SBP-H處理（SBP-H對(duì)H9c2細(xì)胞的效果最顯著，有利于探討麝香保心丸基于AMPK/PGC-1α通路調(diào)控線粒體功能改善心肌能量代謝的作用機(jī)制），并使用20 μmol/L的AMPK抑制劑（多索嗎啡肽，CC）處理24 h。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將H9c2細(xì)胞和缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞（每孔1×10個(gè)）置于96孔板中，并在37 ℃下用含5%CO₂的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后，使用低劑量麝香保心丸（100 μg/L）、中劑量麝香保心丸（200 μg/L）、高劑量麝香保心丸（400 μg/L）和曲美他嗪（300 μg/L）處理24、48、72 h。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。在酶標(biāo)儀上450 nm處讀取OD值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞線粒體ATP測(cè)量

使用腺苷5'-三磷酸生物發(fā)光測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量。在75 cm²培養(yǎng)瓶中加入10 mL培養(yǎng)基，經(jīng)過不同處理72 h后的細(xì)胞以每瓶4×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度加入培養(yǎng)瓶中。通過臺(tái)盼藍(lán)溶液（Sigma）排斥試驗(yàn)將細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至5×10⁵個(gè)/mL，并將其重新懸浮在試劑盒的裂解緩沖液中。將細(xì)胞裂解物與ATP測(cè)定溶液混合，并立即用DTX 880多模檢測(cè)器測(cè)量生物發(fā)光。根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液生成的ATP校準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞ATP含量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位測(cè)量

細(xì)胞經(jīng)過不同處理72 h后，使用JC-1染色測(cè)定試劑盒在熒光顯微鏡中觀察綠色熒光和紅色熒光的強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位。

1.7 細(xì)胞ROS檢測(cè)

經(jīng)過不同處理72 h后的細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/mL的密度接種在6孔培養(yǎng)板中，除去培養(yǎng)基后，加入1.5 mL 2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，10.0 μmol/L）在37 ℃下處理25 min，之后通過熒光顯微鏡以200倍放大倍數(shù)觀察細(xì)胞熒光。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒在流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)過不同處理72 h后的細(xì)胞凋亡。

1.9 細(xì)胞MDA、SOD和GSH-Px水平檢測(cè)

將經(jīng)過不同處理72 h后的細(xì)胞置于冷生理鹽水（質(zhì)量體積比1∶10）中，用勻漿機(jī)勻漿，以3 000 r/min離心15 min，取細(xì)胞上清液，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。PCR反應(yīng)系統(tǒng)（25 μL）包含0.3 μmol/L引物、12.5 μL Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（A46012，Invitrogen，ThermoFisher Scientific）和2.5 μL cDNA。PGC-1α（大鼠）：正向引物5'-TTCTGGGTGGATTGAAGTGGTG-3'，反向引物5'-TGTCAGTGCATCAAATGAGGGC-3'；AMPK（大鼠）：正向引物5'-CCAGGTCATCAGTACACCAT-3'，反向引物5'-CTGCCAAAGGATCCTGGTGA-3'；GAPDH（大鼠）：正向引物5'-GGTTTGAGCAGGTTTTT-3'，反向引物5'-GATGCCTGCTTCACCACC-3'，qPCR分析在MyiQ2 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行。GAPDH的表達(dá)水平用于標(biāo)準(zhǔn)化mRNA表達(dá)。

1.11 ELISA

使用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，檢測(cè)總蛋白濃度。取60 μg蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Sigma Aldrich，北京，ISEQ00010）。用含0.05%吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBS）稀釋的5%奶粉（TBST，Thermo Scientific，北京，37573）阻斷非特異性位點(diǎn)后，滴加1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、PGC-1α、AMPK及p-AMPK大鼠多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，再與1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG孵育，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，經(jīng)Quantity One軟件（Bio-Rad，Hercules）定量蛋白表達(dá)水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS（IBM SPSS Statistics 19.0）。符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 麝香保心丸對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞增殖、ATP含量和線粒體膜電位的影響

與Control組比較，Model組72 h細(xì)胞增殖OD值、線粒體膜電位熒光強(qiáng)度和ATP含量下降（P＜0.001）；與Model組比較，SBP-M組、SBP-H組、TMZ組細(xì)胞增殖OD值、線粒體膜電位熒光強(qiáng)度和ATP含量上升（P＜0.05），且SBP-H組效果最顯著（P＜0.001）。詳見圖1～圖3及表1。

2.2 麝香保心丸對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞ROS、MDA、SOD和GSH-Px含量的影響

與Control組比較，Model組細(xì)胞ROS和MDA水平上升，SOD和GSH-Px水平下降（P＜0.001）；與Model組比較，SBP-L組、SBP-M組、SBP-H組、TMZ組細(xì)胞ROS和MDA水平降低，SOD和GSH-Px水平升高（P＜0.001），且SBP-H組效果最顯著（P＜0.001）。詳見表1及圖4。

2.3 麝香保心丸對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡的影響

與Control組比較，Model組細(xì)胞凋亡水平上升，促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)上升，抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.001）；與Model組比較，SBP-L組、SBP-M組、SBP-H組、TMZ組細(xì)胞凋亡水平降低，促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)降低，抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.001），且SBP-H組效果最顯著（P＜0.001）。詳見圖5、圖6及表2、表3。

2.4 麝香保心丸對(duì)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞PGC-1α和AMPK表達(dá)的影響

與Control比較，Model組PGC-1α、p-AMPK蛋白和PGC-1α、AMPK mRNA表達(dá)下降（P＜0.001）；與Model組比較，SBP-L組、SBP-M組、SBP-H組、TMZ組PGC-1α、p-AMPK蛋白和PGC-1α、AMPK mRNA表達(dá)升高，SBP-H組效果最顯著（P＜0.001）。詳見圖7、表4及表5。

2.5 AMPK抑制劑對(duì)麝香保心丸抑制缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡、細(xì)胞ATP、PGC-1α和AMPK表達(dá)的影響

與Model組比較，SBP-H組細(xì)胞凋亡水平降低，細(xì)胞ATP含量、PGC-1α和p-AMPK表達(dá)上升（P＜0.001）；加入AMPK抑制劑CC后，與SBP-H組比較，SBP-H＋CC組細(xì)胞凋亡水平上升，細(xì)胞ATP含量、PGC-1α和p-AMPK蛋白及PGC-1α、p-AMPK mRNA表達(dá)下降（P＜0.001）。詳見圖8、圖9及表6～表8。

3 討論

《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021》提出，我國(guó)15歲以上人口冠心病的患病率城市地區(qū)約為1.02%，60歲以上患病率約為2.78%，2019年我國(guó)城市居民冠心病死亡率為121.59/10萬(wàn)，農(nóng)村為130.14/10萬(wàn)，嚴(yán)重影響廣大人民群眾的健康^［16］。心臟較其他器官消耗更多的能量，但心臟對(duì)能量的儲(chǔ)備有限，為了獲得執(zhí)行功能所需的能量，心臟必須通過分解代謝等一系列活動(dòng)產(chǎn)生持續(xù)能量ATP，才能滿足自身能量需求^［17］。心臟作為高ATP產(chǎn)生率和周轉(zhuǎn)率器官，一旦出現(xiàn)心肌缺血，心肌能量代謝和心臟功能將嚴(yán)重受損。心肌缺血后，心肌能量代謝多個(gè)環(huán)節(jié)，如底物利用、氧化磷酸化、ATP轉(zhuǎn)移和運(yùn)用出現(xiàn)紊亂^［18］。線粒體作為氧化磷酸化核心場(chǎng)所，在能量產(chǎn)生、物質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用，線粒體功能一旦受損，心肌細(xì)胞ATP產(chǎn)生嚴(yán)重不足，無(wú)法滿足心臟正常的功能需求^［19-20］。機(jī)體ATP合成酶系統(tǒng)改變，ATP合成酶過表達(dá)時(shí)，心臟舒張功能降低；抑制線粒體ATP合酶后，心臟舒張功能恢復(fù)受到不良影響。因此，維持ATP合成酶正常代謝是干預(yù)缺血性心臟病的重要手段之一，可使心臟免受缺血性損傷^［21-22］。

近年來(lái)，中藥研究發(fā)展迅速，已發(fā)現(xiàn)較多中藥或中藥成分可改善心肌細(xì)胞功能，進(jìn)而治療冠心病^{［11，23-25］}。麝香保心丸作為中成藥的代表，療效確切，相關(guān)研究顯示，麝香保心丸可能通過調(diào)控心肌能量代謝防治冠心病^［26-27］，具體機(jī)制有待深入研究。

本研究采用缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞作為冠心病體外模型，使用不同劑量麝香保心丸處理，曲美他嗪作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，處理72 h后，麝香保心丸可促進(jìn)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞增殖，且高劑量麝香保心丸作用更顯著，與以往研究結(jié)果^［28］一致。細(xì)胞ATP含量可提示細(xì)胞合成能量的能力^［29］，麝香保心丸可提高缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞ATP含量，促進(jìn)細(xì)胞能量合成，通過線粒體凋亡途徑抑制缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡，與相關(guān)研究結(jié)果^［30］一致。進(jìn)一步本研究結(jié)果表明，麝香保心丸可降低缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞ROS、MDA活性，并提高SOD和GSH-Px活性，提示心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制^［31］。以往研究表明，AMPK/PGC-1α通路在糖尿病心肌病發(fā)展過程中發(fā)揮作用^［8］。本研究結(jié)果顯示，麝香保心丸可促進(jìn)缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞PGC-1α表達(dá)和AMPK磷酸化，且高劑量麝香保心丸作用更顯著；加入AMPK抑制劑CC后，麝香保心丸抑制缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞凋亡、促進(jìn)ATP合成及促進(jìn)PGC-1α表達(dá)和AMPK磷酸化被逆轉(zhuǎn)，提示AMPK/PGC-1α通路在麝香保心丸致心肌細(xì)胞凋亡抑制、能量合成增加過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，麝香保心丸可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和ATP合成，抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與AMPK/PGC-1α通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ DUGGAN J P，PETERS A S，TRACHIOTIS G D，et al.Epidemiology of coronary artery disease［J］.Surgical Clinics of North America，2022，102（3）：499-516.

［2］ SHAYA G E，LEUCKER T M，JONES S R，et al.Coronary heart disease risk：low-density lipoprotein and beyond［J］.Trends in Cardiovascular Medicine，2022，32（4）：181-194.

［3］ YANG J Q，GUO Q Y，F(xiàn)ENG X X，et al.Mitochondrial dysfunction in cardiovascular diseases：potential targets for treatment［J］.Frontiers in Cell and Developmental Biology，2022，10：841523.

［4］ CAI C，WU F，HE J，et al.Mitochondrial quality control in diabetic cardiomyopathy：from molecular mechanisms to therapeutic strategies［J］.International Journal of Biological Sciences，2022，18（14）：5276-5290.

［5］ 旦增諾揚(yáng)，格日力.線粒體在低氧適應(yīng)中的改變及機(jī)制［J］.中國(guó)高原醫(yī)學(xué)與生物學(xué)雜志，2020，41（2）：125-129.

［6］ HAMMER Y，BLIN M，GOLDSTEIN D R.Failing mitochondria and coronary allograft vasculopathy［J］.The Journal of Heart and Lung Transplantation，2022，41（6）：742-744.

［7］ XIN Y G，ZHANG X D，LI J Y，et al.New insights into the role of mitochondria quality control in ischemic heart disease［J］.Frontiers in Cardiovascular Medicine，2021，8：774619.

［8］ MA T Y，HUANG X H，ZHENG H X，et al.SFRP2 improves mitochondrial dynamics and mitochondrial biogenesis，oxidative stress，and apoptosis in diabetic cardiomyopathy［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2021，2021：9265016.

［9］ CHANG X，LIU J F，WANG Y L，et al.Mitochondrial disorder and treatment of ischemic cardiomyopathy：potential and advantages of Chinese herbal medicine［J］.Biomedicine amp; Pharmacotherapy，2023，159：114171.

［10］ YANG X Y，HE T M，HAN S J，et al.The role of traditional Chinese medicine in the regulation of oxidative stress in treating coronary heart disease［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019，2019：3231424.

［11］ GE J B，F(xiàn)AN W H，ZHOU J M，et al.Efficacy and safety of Shexiang Baoxin pill（MUSKARDIA）"in patients with stable coronary artery disease：a multicenter，double-blind，placebo-controlled phase Ⅳ"randomized clinical trial［J］.Chinese Medical Journal，2021，134（2）：185-192.

［12］ ZHANG J G，CUI Q F，ZHAO Y R，et al.Mechanism of angiogenesis promotion with Shexiang Baoxin Pills by regulating function and signaling pathway of endothelial cells through macrophages［J］.Atherosclerosis，2020，292：99-111.

［13］ LU L，QIN Y T，ZHANG X X，et al.Shexiang Baoxin pill alleviates the atherosclerotic lesions in mice via improving inflammation response and inhibiting lipid accumulation in the arterial wall［J］.Mediators of Inflammation，2019，2019：6710759.

［14］ HUANG F F，LIU Y，YANG X，et al.Shexiang Baoxin pills promotes angiogenesis in myocardial infarction rats via up-regulation of 20-HETE-mediated endothelial progenitor cells mobilization［J］.Atherosclerosis，2017，263：184-191.

［15］ FANG H Y，ZENG H W，LIN L M，et al.A network-based method for mechanistic investigation of Shexiang Baoxin Pill's treatment of cardiovascular diseases［J］.Scientific Reports，2017，7：43632.

［16］ 《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告》2021（冠心病部分內(nèi)容）［J］.心肺血管病雜志，2022，41（12）：1205-1211.

［17］ 孫俠，趙倩茹，袁偉.心肌線粒體能量代謝在心血管疾病中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)心血管雜志，2022，27（1）：90-93.

［18］ 封欣妤，王善杰，趙志敬，等.心肌細(xì)胞能量代謝調(diào)控研究進(jìn)展［J］.心臟雜志，2018，30（4）：473-476;485.

［19］ HU H C，LIN Y，XU X F，et al.The alterations of mitochondrial DNA in coronary heart disease［J］.Experimental and Molecular Pathology，2020，114：104412.

［20］ LAZOU A，RAMACHANDRA C J.Protecting the mitochondria in cardiac disease［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（15）：8115.

［21］ 周曼麗，俞赟豐，馮宇，等.冠心病血瘀證形成過程中心肌細(xì)胞能量代謝酶作用及其機(jī)制研究［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2020，28（12）：76-84.

［22］ 封亞麗，何紅濤，張倩倩，等.調(diào)節(jié)心肌能量代謝有望成為治療心力衰竭的新策略［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2022，42（3）：748-751.

［23］ 龍明智，王軍，王迪斌.通心絡(luò)膠囊治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2000，7（5）：270.

［24］ WANG C L，HUAN N，WANG P L，et al.Guanxin Danshen dripping pills improve quality of life and cardiovascular prognoses of CHD patients after PCI with anxiety or depression（GLAD study）：a randomized double-blind placebo-controlled study［J］.Chinese Journal of Integrative Medicine，2023，29（3）：195-204.

［25］ 楊穎，王賢良，畢穎斐，等.復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療不穩(wěn)定型心絞痛的Meta分析及GRADE評(píng)價(jià)［J］.中醫(yī)雜志，2019，60（21）：1815-1826.

［26］ WU G S，CHEN L L，GU Y，et al.Exploring the mechanism underlying the cardioprotective effect of Shexiang Baoxin pill on acute myocardial infarction rats by comprehensive metabolomics［J］.Journal of Ethnopharmacology，2020，259：113001.

［27］ YU F，YU Y，TIAN S S，et al.Quantitative proteomics reveals Shexiang Baoxin Pill exerts cardioprotective effects by preserving energy metabolism in a rat model of myocardial infarction［J］.Journal of Ethnopharmacology，2021，266：113460.

［28］ 肖帥.麝香保心丸抗高糖所致心肌損傷的機(jī)制研究［D］.青島：青島大學(xué)，2019.

［29］ SONG J X.Adenosine triphosphate energy-independently controls protein homeostasis with unique structure and diverse mechanisms［J］.Protein Science，2021，30（7）：1277-1293.

［30］ 楊翼鷹，陳偉燕，孫秀亭，等.麝香保心丸通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2016，34（5）：517-522;527.

［31］ 黃菲菲，王輝，高翔，等.基于Wnt/β-catenin通路研究麝香保心丸對(duì)冠心病心力衰竭大鼠的作用［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2021，36（8）：1697-1703.

（收稿日期：2023-08-03）

（本文編輯"薛妮）