紫花苜蓿MsNF-YB5基因的克隆及表達(dá)特性分析

摘要：研究發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)擬南芥（Arabidopsis thaliana）QQS基因可顯著提高紫花苜蓿的抗逆性，而MsNF-YB5是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵內(nèi)源基因。為探究MsNF-YB5在紫花苜蓿（Medicago sativa"L.）脅迫響應(yīng)過程中的功能，本研究克隆并完成了MsNF-YB5的生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄自激活檢測及脅迫下的表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示，克隆獲得的MsNF-YB5"cDNA編碼156個氨基酸，與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtNF-YB5相似度最高，該基因啟動子區(qū)域含有參與茉莉酸甲酯、脫落酸、防御與脅迫反應(yīng)的順式作用元件；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其具有細(xì)胞核定位，截短N端后具有酵母轉(zhuǎn)錄自激活活性。MsNF-YB5受鹽脅迫、滲透脅迫、低氮脅迫、冷脅迫及脫落酸處理誘導(dǎo)表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究MsNF-YB5功能以提高紫花苜?？鼓嫘蕴峁┝嘶A(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；MsNF-YB5；亞細(xì)胞定位；自激活活性；脅迫表達(dá)模式

中圖分類號：S541.9 """""""文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A """""""文章編號：1007-0435（2025）03-0686-10

Cloning and Expression Analysis of MsNF-YB5"in Alfalfa

WANG Zhi-jie，"ZHANG Wan-jun^*

（College of Grassland Science and Technology，"China Agricultural University，"Beijing 100193，"China）

Abstract：Our previous research has demonstrated that the heterologous expression of the QQS"gene from Arabidopsis thaliana"significantly enhances the stress resistance of alfalfa （Medicago sativa L.），"and MsNF-YB5"is identified as a critical endogenous gene contributing to this effect. To elucidate the role of MsNF-YB5"in the stress response of alfalfa，"we cloned the MsNF-YB5"gene and conducted a comprehensive bioinformatics analysis，"subcellular localization studies，"transcriptional self-activation assessments，"and expression pattern analyses under various stress conditions. The findings revealed that the cloned MsNF-YB5"cDNA encoded a protein consisting of 156 amino acids，"exhibiting the highest similarity to MtNF-YB5 from Medicago truncatula. The promoter region of this gene contained cis-acting elements associated with methyl jasmonate，"abscisic acid，"and the responses to defense and stress. Subcellular localization studies indicated that the protein was localized in the nucleus，"and exhibited yeast transcriptional self-activation activity，"which was only observed following truncation of the N-terminus. Furthermore，"MsNF-YB5 expression was found to be upregulated under salt stress，"PEG treatment，"abscisic acid （ABA）"treatment，"low nitrogen availability and cold stress. This study established a foundation for further investigation into the role of MsNF-YB5"in enhancing the stress resistance of alfalfa.

Key words：Alfalfa；MsNF-YB5；Subcellular localization；Self-activation activity；Stress expression

紫花苜蓿（Medicago sativa"L.）是世界上重要的豆科牧草，具有粗蛋白含量高、產(chǎn)量高、適口性好等優(yōu)點，有“牧草之王”的美稱。我國的苜蓿種植區(qū)主要集中于東北、華北、西北地區(qū)，干旱、土壤貧瘠、鹽堿、寒冷等非生物因素嚴(yán)重制約著我國苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)^［1-2］。植物在進(jìn)化過程中為應(yīng)對各種非生物脅迫，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此深入了解紫花苜蓿脅迫響應(yīng)分子機制，挖掘重要調(diào)控基因，對紫花苜蓿的遺傳改良具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子^［3］。核因子Y（Nuclear factor-Y，NF-Y）是廣泛存在于各種真核生物中的一類轉(zhuǎn)錄因子，分為NF-YA，NF-YB和NF-YC 三種亞基，三種亞基之間可形成異源三聚體，特異性識別結(jié)合啟動子和增強子上的CCAAT-box，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)，因此NF-Y又被稱為CCAAT結(jié)合因子（CCAAT-binding factor，"CBF）^［4］。研究表明，NF-Ys在調(diào)節(jié)植物的脅迫應(yīng)答進(jìn)程中具有重要作用。例如，玉米（Zea mays L.）ZmNF-YA1與ZmNF-YB16和ZmNF-YC17形成三聚體調(diào)控下游基因表達(dá)，提高了玉米的耐旱性和耐鹽性^［5］；水稻（Oryza sativa L.）OsNF-YC5影響ABA依賴性和非依賴性途徑負(fù)調(diào)控水稻耐鹽性^［6］；StNF-YC9通過提高光合作用速率、抗氧化酶活性和脯氨酸積累，增強了馬鈴薯（Solanum tuberosum"L.）的耐旱性^［7］；MsNF-YC2受到干旱、鹽堿等多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，過表達(dá)MsNF-YC2基因增強了紫花苜蓿的堿適應(yīng)能力^［8］。

AtQQS是僅在擬南芥中存在的孤兒基因，研究表明其在調(diào)節(jié)碳氮平衡、抗逆性等方面發(fā)揮重要作用，異源表達(dá)該基因可以顯著的提高土豆、煙草的蛋白質(zhì)含量和生物脅迫抗性^［9-11］。研究發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)AtQQS基因可以顯著提高紫花苜蓿的抗逆性^［12］，而MsNF-YB5的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中顯著提高，推測其可能是紫花苜蓿植株抗逆性響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)基因。因此，為進(jìn)一步揭示其功能，本研究克隆了紫花苜蓿MsNF-YB5基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄自激活檢測及非生物脅迫下的表達(dá)模式分析，為MsNF-YB5轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能研究及紫花苜蓿的遺傳改良提供了基因資源和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的紫花苜蓿品種為‘中苜1號’，煙草（Nicotiana benthamiana L.）為本氏煙草。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 依據(jù)已公布的紫花苜蓿‘新疆大葉’的參考基因組序列設(shè)計引物（如表1），其中MsNF-YB5-F/R用于MsNF-YB5基因克?。籅D-NF-YB5-F和BD-NF-YB5-R 用于pGBKT7-MsNF-YB5載體構(gòu)建；BD-MsNFYB5-C-F與BD-MsNFYB5-N-R用于pGBKT7-MsNF-YB5-?N，pGBKT7-MsNF-YB5-ΔC和pGBKT7-MsNF-YB5-Min載體的構(gòu)建；B5-GFP-XbaI-F和B5-GFP-HindIII-R用于pCGW-MsNF-YB5-GFP 載體構(gòu)建；Actin-qPCR-F/R和MsNFYB5-qPCR-F/R分別用于內(nèi)參基因Actin及目的基因MsNF-YB5熒光定量PCR檢測。

1.2.2 MsNF-YB5基因克隆 選取生長狀態(tài)良好的紫花苜蓿葉片，采用Trizol法提取葉片總RNA，依據(jù)試劑盒（TaKaRa，貨號RR037A）方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以引物MsNF-YB5-F和MsNF-YB5-R為引物對cDNA進(jìn)行擴增，擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離純化后回收，回收產(chǎn)物連接克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌送至生工生物工程有限公司測序鑒定，鑒定正確的菌液，提取質(zhì)粒，保存菌液。

1.2.3 MsNF-YB5的生物信息學(xué)分析 對MsNF-YB5的蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/）、一級結(jié)構(gòu)及親/疏水性（https：//web.expasy.org/protparam/）、二級結(jié)構(gòu)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、三級結(jié)構(gòu)（https：//swissmodel.expasy.org/）、跨膜結(jié)構(gòu)（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）及信號肽（https：//dtu.biolib.com/SignalP-6）進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.4 pCGW-MsNF-YB5-GFP載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位 以B5-GFP-XbaI-F和B5-GFP-HindIII-R為引物對cDNA進(jìn)行擴增，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收，回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pCGW雙酶切后連接為pCGW-MsNF-YB5-GFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取測序鑒定正確菌株的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（P19）中，菌株經(jīng)PCR鑒定后保存菌液。將保存的菌液與含有細(xì)胞膜標(biāo)記（CBL）、細(xì)胞核標(biāo)記（AT-hook）的菌株在酵母提取物蛋白胨肉湯（Yeast extract peptone broth medium，YEP）培養(yǎng)基（10 g·L^-1"酵母提取物，10 g·L^-1"NaCl，5 g·L^-1胰蛋白胨，滅菌后添加50 mg·L^-1卡那霉素和50 mg·L^-1利福平）中培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6～0.8，5000 r·min^-1離心5 min收集菌體，使用重懸液［10 mmol·L^-1"MgCl₂，10 mmol·L^-1"MES（2-嗎啉乙磺酸），200 μmol·L^-1乙酰丁香酮］重懸至OD₆₀₀為0.6～0.8，三種菌液1∶1∶1混合后室溫放置1～2小時，后將農(nóng)桿菌注入生長健康的煙草葉片，避光環(huán)境下放置2～3 h，48～72 h內(nèi)在激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1 HD25）觀察綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）信號在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.2.5 MsNF-YB5蛋白酵母自激活檢測 以BD-NF-YB5-F和BD-NF-YB5-R為引物對目的基因進(jìn)行擴增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后純化回收。將回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pGBKT7雙酶切后連接為pGBKT7-MsNF-YB5載體，后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，測序鑒定后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，涂布SD-T篩選平板，30℃倒置培養(yǎng)3 d。挑取直徑1～2 mm的陽性菌斑溶于30 μL無菌水中即為酵母菌液，將菌液稀釋10倍、100倍，吸取酵母菌液和其稀釋液各6 μL，分別點斑于SD/-Trp，SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade固體培養(yǎng)基，倒置于30℃培養(yǎng)箱中2～3 d，觀察酵母菌生長狀況并使用X-α-gal染色。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域分析 依據(jù)保守結(jié)構(gòu)域，以BD-NF-YB5-F，BD-NF-YB5-R，BD-MsNFYB5-C-F，BD-MsNFYB5-N-R為引物，將MsNF-YB5蛋白10～156氨基酸序列構(gòu)建為pGBKT7-MsNF-YB5-ΔN載體，將1～140氨基酸序列構(gòu)建為pGBKT7-MsNF-YB5-ΔC載體，將10～140氨基酸序列構(gòu)建為pGBKT7-MsNF-YB5-Min載體（圖4B），后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，測序鑒定后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，涂布SD-T篩選平板，30℃倒置培養(yǎng)3 d。挑取直徑1～2 mm的陽性菌斑溶于30 μL無菌水中即為酵母菌液，將菌液稀釋10倍、100倍、1000倍，吸取酵母菌液和其稀釋液各6 μL，分別點斑于SD/-Trp和SD/-Trp/-His固體培養(yǎng)基，倒置于30℃培養(yǎng)箱中2～3 d，觀察酵母菌生長狀況并使用X-α-gal染色。

1.2.7 MsNF-YB家族進(jìn)化分析及關(guān)鍵順式作用元件預(yù)測 從紫花苜蓿‘新疆大葉’的參考基因組^［13］數(shù)據(jù)庫中提取MsNF-YB基因家族的氨基酸序列，擬南芥、大豆（Glycine max）、蒺藜苜蓿的NF-YBs氨基酸序列來自plantTFDB（https：//planttf-db.gao-lab.org/），采用最大似然法（MEGA11）對紫花苜蓿MsNF-YB基因家族進(jìn)行蛋白進(jìn)化分析。在紫花苜?！陆笕~’基因組數(shù)據(jù)庫中選取MsNF-YBs基因起始密碼ATG上游2 kb序列，使用PlantCARE在線軟件（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子的順式作用元件及功能。

1.2.8 脅迫下表達(dá)模式分析 為探究MsNF-YB5在聚乙二醇（Polyethylene glycol，"PEG）、低氮、NaCl、寒冷脅迫和脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理條件下的表達(dá)情況，以扦插生長2個月的‘中苜1號’紫花苜蓿植株為材料，分別置于添加250 mmol·L^-1"NaCl的0.1×霍格蘭溶液、添加"20 μmol·L^-1"ABA的0.1×霍格蘭溶液、添加0.36 mmol·L^-1"KNO₃的無氮營養(yǎng)液中、添加15% PEG6000的0.1×霍格蘭溶液中，在組培室條件（26℃ 16 h 5000 lx光照/8 h黑暗，相對濕度50%～60%）培養(yǎng)24 h，對于0℃處理，以生長于混合土（營養(yǎng)土∶蛭石∶黑土=1∶1∶1）中的植株為材料，置于溫室生長2個月后，放置于0℃培養(yǎng)箱中，分別在處理第0 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h時收取植株頂端第2，3葉或根尖向上5 cm根系樣品。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，分別提取葉片和根系樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量檢測，以紫花苜蓿Actin基因作為內(nèi)參基因，計算MsNF-YB5基因的相對表達(dá)量，分析其表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsNF-YB5基因的克隆

以MsNF-YB5-F和MsNF-YB5-R為引物，以‘中苜1號’cDNA為模板，進(jìn)"PCR擴增，獲得特異性條帶。將PCR產(chǎn)物回收測序獲得的序列與"MsNF-YB5核苷酸序列（MS.gene033001）進(jìn)行比對，序列相似度為97%，其編碼序列（Coding sequence，CDS）長度為471 bp（圖1）。

2.2 生物信息學(xué)分析

克隆所獲MsNF-YB5基因共編碼156個氨基酸，保守結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示MsNF-YB5屬于HFD-Dr1超家族（圖2A），其蛋白分子式為C₇₅₂H₁₂₁₉N₂₀₉O₂₄₆S₁₁，分子量為17 476.86 Da，帶負(fù)電的殘基總數(shù)為28，帶正電的殘基總數(shù)為19，理論等電點為4.80，親水性總平均值為-0.537，推測為親水蛋白。無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，推測其不屬于膜蛋白或分泌蛋白。蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主，占比為63.46%，其次為無規(guī)則卷曲，占比30.77%，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角占比分別為3.21%和2.56%（圖2B）。

2.3 亞細(xì)胞定位

使用轉(zhuǎn)入pCGW-MsNF-YB5-GFP載體的GV3101（P19）菌液侵染煙草葉片細(xì)胞，轉(zhuǎn)入pCGW-GFP載體的GV3101（P19）菌液的葉片細(xì)胞為正對照，激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MsNF-YB5-GFP在細(xì)胞核與核定位標(biāo)記蛋白表達(dá)位置重疊，證明MsNF-YB5蛋白在煙草細(xì)胞中具有核定位，除此之外，MsNF-YB5-GFP在核外部位也具有表達(dá)信號。

2.4 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

使用轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsNF-YB5載體的AH109酵母菌株檢測MsNF-YB5蛋白的轉(zhuǎn)錄自激活性，以轉(zhuǎn)入pGBKT7載體酵母菌作為負(fù)對照，以前期驗證具有激活性的轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsSPL12載體的酵母菌^［14］作為正對照。結(jié)果顯示（圖4A），轉(zhuǎn)入三種質(zhì)粒的酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長正常，并在X-α-gal染色后呈現(xiàn)為藍(lán)色，證明載體成功在酵母菌中表達(dá)；在SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上三種表達(dá)載體的酵母菌生長受抑制，在SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsNF-YB5載體和pGBKT7的酵母菌無法生長，而轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsSPL12載體的酵母菌仍可生長，以上結(jié)果表明MsNF-YB5全長序列無轉(zhuǎn)錄自激活活性。

為了進(jìn)一步驗證以上結(jié)果，依據(jù)MsNF-YB5蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，分別使用轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsNF-YB5、pGBKT7-MsNF-YB5-ΔN，pGBKT7-MsNF-YB5-ΔC，pGBKT7-MsNF-YB5-Min載體的AH109酵母菌株檢測MsNF-YB5蛋白的轉(zhuǎn)錄自激活性，以轉(zhuǎn)入pGBKT7載體酵母菌作為對照。結(jié)果顯示（圖4B），轉(zhuǎn)入5種質(zhì)粒的酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長正常，并在X-α-gal染色后呈現(xiàn)為藍(lán)色，證明載體成功在酵母菌中表達(dá)；在SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)入pGBKT7-MsNF-YB5-ΔN載體的酵母菌正常生長，而其余四種表達(dá)載體的酵母菌生長均受到抑制。以上結(jié)果表明，MsNF-YB5全長序列無轉(zhuǎn)錄自激活活性，而截去N端后具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

2.5 MsNF-YB5蛋白進(jìn)化與啟動子元件分析

為了研究MsNF-YB5在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測其功能，以紫花苜蓿、擬南芥、大豆和蒺藜苜蓿的NF-YB蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，并預(yù)測了紫花苜蓿NF-YB基因家族部分關(guān)鍵啟動子順式作用元件。結(jié)果顯示，紫花苜蓿的NF-YB家族共26個基因，可分為三個亞族："LEC，Non-LEC，Dr1-like（圖5A），啟動子區(qū)域含有較多的CGTCA-motif（參與茉莉酸甲酯反應(yīng)）、ABRE（參與脫落酸反應(yīng)）和O2-site（參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)）元件（圖5B）。MsNF-YB5（MS.gene033001）屬于Dr1-like亞族，與蒺藜苜蓿MtNF-YB5最為接近，啟動子區(qū)域含有O2-site，ABRE，CGTCA-motif，TC-rich repeats（參與防御和應(yīng)激反應(yīng)），TCA-element（參與水楊酸反應(yīng)）等元件，推測其在植物的防御與脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.6 脅迫表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步預(yù)測MsNF-YB5的功能，分別檢測了MsNF-YB5在不同條件（鹽脅迫、滲透脅迫、低氮脅迫、冷脅迫和ABA處理）下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示（圖6），MsNF-YB5的表達(dá)顯著受鹽脅迫誘導(dǎo)，250 mmol·L^-1"NaCl處理0～12 h期間，MsNF-YB5表達(dá)量持續(xù)升高，在12 h時達(dá)到峰值，為處理前54倍，在處理24 h后MsNF-YB5的表達(dá)量雖有下降但仍顯著高于處理前水平（Plt;0.05）。滲透脅迫也可誘導(dǎo)MsNF-YB5的表達(dá)，15% PEG6000處理后，MsNF-YB5的表達(dá)量在24 h內(nèi)持續(xù)上升，達(dá)到處理前的6.5倍；20 μmol·L^-1"ABA處理下葉片中MsNF-YB5的表達(dá)量持續(xù)上升，根中呈先升高后下降再升高的趨勢。此外，MsNF-YB5還可能參與低氮脅迫和冷脅迫的響應(yīng)過程，在0.36 mmol·L^-1"KNO₃和0℃處理下，MsNF-YB5表達(dá)量在24 h時同比處理前表達(dá)量顯著增多（Plt;0.05）。以上結(jié)果說明MsNF-YB5可能參與調(diào)控鹽脅迫、滲透脅迫、低溫脅迫、低氮脅迫和ABA的響應(yīng)過程。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是植物生長過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控之間的橋梁，典型的轉(zhuǎn)錄因子一般具有4個功能結(jié)構(gòu)域，即特異性結(jié)合順式作用元件的DNA結(jié)合域（DNA-binding domain）、激活或抑制靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域（Transcription regulation domain）、控制轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)核過程的核定位信號區(qū)（Nuclear location signal）和不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用的功能域寡聚化位點區(qū)（Oligomerization site）^［15］，轉(zhuǎn)錄因子通過這些功能結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子的順式元件相互作用或與其他蛋白質(zhì)相互結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)^［16］。大部分的轉(zhuǎn)錄因子具備轉(zhuǎn)錄激活活性，但是有些轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)部存在抑制結(jié)構(gòu)域或缺少激活結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其全長或單獨存在時并不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。例如，大豆的GmNAC20具有一個轉(zhuǎn)錄活性抑制結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致其全長序列無轉(zhuǎn)錄激活活性，但GmNAC20的羧基末端結(jié)構(gòu)域具有較高的轉(zhuǎn)錄激活活性^［17］；小麥中B基因并不具有激活結(jié)構(gòu)域，但其氨基末端結(jié)構(gòu)域可以與C1基因相互作用招募轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，從而激活下游基因轉(zhuǎn)錄^［18］。本研究克隆獲得的MsNF-YB5蛋白截短N端后具有轉(zhuǎn)錄自激活性，推測其N末端存在轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位通常定位于細(xì)胞核中，然而一些轉(zhuǎn)錄因子也可以在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中發(fā)揮功能。例如，紫花苜蓿MsMYB58基因定位于細(xì)胞核、細(xì)胞壁及細(xì)胞膜中^［19］。也有研究表明，部分轉(zhuǎn)錄因子儲存在細(xì)胞膜中，只有在接受到一定信號并且經(jīng)過修飾后，這些轉(zhuǎn)錄因子才會從膜中釋放出來^［20］。本試驗克隆所獲MsNF-YB5在細(xì)胞核外也具有定位信號，其可能參與其他生理響應(yīng)調(diào)控過程。

高等植物中存在著許多不同的NF-Y轉(zhuǎn)錄因子，具有多種不同的異源二聚體或異源三聚體組合方式，在植物不同組織器官內(nèi)各生長階段發(fā)揮不同的功能。NF-Y基因家族目前已在多種植物中進(jìn)行了研究報道。例如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中已經(jīng)鑒定了10個NF-YA基因、13個NF-YB基因和13個NF-YC基因，參與調(diào)控種子形成、胚胎發(fā)育、養(yǎng)分獲取、形態(tài)建成、花發(fā)育、果實形成和微生物共生等過程^［21］；Quach等^［22］在大豆（Glycine max）中鑒定確認(rèn)了的NF-YA，NF-YB和NF-YC家族成員數(shù)目分別為21，32和15，并通過轉(zhuǎn)錄分析認(rèn)為大豆的NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)根瘤活性方面發(fā)揮重要作用；水稻中鑒定出11個OsNF-YAs，11個OsNF-YBs和12個OsNF-YCs^［23］，并且多名研究者發(fā)現(xiàn)OsNF-YB1和OsNF-YC12的互作可以調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運、乙烯響應(yīng)、淀粉合成等相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響水稻灌漿、胚乳發(fā)育過程^［24-27］；An等^［28］在紫花苜?！陆笕~’參考基因組中共鑒定出9個NF-YA，26個NF-YB和25個NF-YC，并發(fā)現(xiàn)多個MsNF-Ys基因分別響應(yīng)冷脅迫、ABA處理、干旱脅迫和鹽脅迫，但是目前有關(guān)紫花苜蓿NF-Y轉(zhuǎn)錄因子的功能和機制研究報道較少。本試驗克隆的MsNF-YB5編碼長度僅為471 bp，編碼176個氨基酸，與蒺藜苜蓿MtNF-YB5的氨基酸序列相似度為100%，依據(jù)啟動子元件預(yù)測結(jié)果分析，推測其可能在紫花苜蓿的激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮作用。

NF-YB家族基因廣泛參與植物的非生物脅迫響應(yīng)過程^［29］。在擬南芥中，有多篇報道指出，干旱和滲透脅迫會誘導(dǎo)擬南芥AtNF-YB1，2，3，5，6，9，10等基因的上調(diào)表達(dá)^［29-31］。其中AtNF-YB1，AtNF-YB2和AtNF-YB3已被證明可正向調(diào)節(jié)擬南芥的耐旱性和耐熱性^［30-31］。在玉米中，干旱脅迫或鹽脅迫誘導(dǎo)了ZmNF-YB2，4，8，10，13，16等基因的表達(dá)^［32］。進(jìn)一步研究結(jié)果表明ZmNF-YB2和ZmNF-YB16均可顯著提高玉米的干旱耐受能力^{［30，33］}。Du等^［34］在紫花苜蓿中鑒定出了15個受干旱或鹽處理下高度誘導(dǎo)表達(dá)的MsNF-YBs基因。堅偉寧等^［35］研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)MsNF-YB3和MsNF-B4能提高轉(zhuǎn)基因苜?；驘煵莸目鼓嫘浴ｋS著對NF-YB家族基因研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)NF-YB基因可以通過ABA依賴途徑介導(dǎo)植物的非生物脅迫抗性。例如，大豆的GmNF-YB2與GmNF-YA16和GmNF-YC14形成異源三聚體，激活GmPYR1介導(dǎo)的ABA信號通路，從而提高大豆的脅迫耐受性^［36］；StNF-YB3.1可通過ABA介導(dǎo)促進(jìn)馬鈴薯氣孔閉合^［37］；玉米NF-YB家族基因在ABA處理、鹽脅迫、干旱脅迫后表達(dá)水平整體明顯升高，說明其可能具有通過ABA依賴途徑調(diào)控作物抗旱性的功能^［34］。本試驗中MsNF-YB5表達(dá)量在鹽脅迫、滲透脅迫、冷脅迫、ABA處理、低氮處理下表達(dá)量顯著升高，推測其可能響應(yīng)紫花苜蓿的脅迫應(yīng)答過程，具有調(diào)節(jié)抗逆性的潛在功能。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得紫花苜蓿MsNF-YB5基因，該基因開放閱讀框為471 bp，共編碼156個氨基酸，屬于Dr-like亞族，與蒺藜苜蓿MtNF-YB5相似度為100%，其啟動子區(qū)域含有參與茉莉酸甲酯、脫落酸、防御與脅迫反應(yīng)的順式作用元件。MsNF-YB5蛋白具有核定位信號，截短N端后具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，響應(yīng)鹽脅迫、PEG處理、ABA處理、低氮處理和冷脅迫。本研究為進(jìn)一步研究MsNF-YB5抗逆功能和調(diào)控機制以及改良紫花苜?？鼓嫘蕴峁┝藚⒖?。

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（責(zé)任編輯""閔芝智）

引用格式：王之杰， 張萬軍.紫花苜蓿MsNF-YB5基因的克隆及表達(dá)特性分析[J].草地學(xué)報，2025，33（3）：686-695

Citation：WANG Zhi-jie， ZHANG Wan-jun.Cloning and Expression Analysis of"MsNF-YB5"in Alfalfa[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（3）：686-695

基金項目：國家自然科學(xué)青年基金項目（32201454）；國家草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（籌）項目（CCPTZX2023B01）資助

作者簡介：王之杰（2002-），男，漢族，山東濰坊人，本科生，主要從事苜蓿轉(zhuǎn)基因育種研究，E-mail：wangzhijie@cau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：wjzhang@cau.edu.cn