禽流感病毒與新城疫病毒多靶標核酸質(zhì)譜檢測方法研究及應(yīng)用

摘 要： 禽流感和新城疫是全球養(yǎng)禽業(yè)最具威脅的兩種病毒性傳染病，快速準確地病原檢測和分型對于這兩種動物疫病的早期防控和阻斷傳播具有至關(guān)重要的作用。本研究通過將微量多重RT-PCR、單堿基延伸和基于MALDI-TOF的質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合使用，針對禽流感和新城疫病毒建立了一種高通量核酸質(zhì)譜檢測方法，并對方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性進行了評價。結(jié)果表明，建立的方法可即時同步檢測禽流感病毒（A型通用）、H5、H7、H9亞型，新城疫病毒及其中強毒株，各個靶標的檢測靈敏度為8.82～15.40 copies·μL^-1，與其他禽病病原核酸無交叉反應(yīng)，對12 copies·μL^-1的6種混合靶標的檢測重復(fù)性均在75%以上。對179份實驗室收集的送檢樣品（包括拭子樣品和組織臟器）檢測結(jié)果表明，與熒光RT-PCR檢測方法相比，禽流感病毒通用檢測靶標符合率為98.9%；其他靶標的符合率均為100.0%。本研究為禽流感、新城疫病毒的快速鑒別檢測及重要亞型/株型的同步快速分型鑒定提供了一種新的高通量替代方法。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒；新城疫病毒；多靶標；核酸質(zhì)譜

中圖分類號：

S851.34"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1386-10

收稿日期：2024-04-16

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFF0703804）；海關(guān)總署科研項目（2022HK125）

作者簡介：高志強（1974-），男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，研究員，博士，主要從事動物檢疫研究，E-mail： gaozhiqiang02@163.com

*通信作者：種 焱，主要從事動物檢疫研究，E-mail： chongy1965@163.com; 賴平安，主要從事動物檢疫研究，E-mail： 1979669124@qq.com

Studies and Application of Multi-target Nucleic Acid Mass Spectrometry Detection Method

for Avian Influenza/Newcastle Disease Virus

GAO" Zhiqiang1， LAI" Ping’an^1*， SONG" Yueqian1， CHONGnbsp; Yan^1*， GUO" Youran2， BAI" Zilong1，

GUO" Huimin2， WANG" Lin1， PU" Jing1， SHI" Xiju1， REN" Tong1， ZHAO" Xiangpeng1

（1.Science and Technology Research Center of China Customs， Beijing 100026，" China;

2.Zhejiang Digena Diagnostic Technology Co. Ltd， Hangzhou 311100，" China）

Abstract：" Avian influenza （AI） and Newcastle disease （ND） are the two most threatening viral infectious diseases in the global poultry industry. Rapid and accurate pathogen detection and typing are of vital importance for the early control and transmission blocking of these two animal diseases. （Method） In this study， a high-throughput nucleic acid mass spectrometry method for detection of AIV and NDV was developed by combining micro multiplex RT-PCR， single base extension and MALDI-TOF mass spectrometry， and the sensitivity， specificity and repeatability of the method were evaluated. The results showed that the established method could detect AIV （type A）， subtype H5， subtype H7， subtype H9， NDV and its velogenic/mesogenic strains synchronously. The analytical sensitivity of targets was 8.82-15.40 copies·μL^-1， and there was no cross-reaction with other avian pathogen nucleic acid. The reproducibility of 6 mixed targets at 12 copies·μL^-1 was above 75%. The detection results of 179 samples （including swab samples and tissue organs） collected in laboratory showed that the coincidence rate of universal target of AIV was 98.9%， and the other targets were 100.0% compared with real-time RT-PCR. So a new high-throughput alternative method is provided for differential detection of AIV， NDV， and their important subtypes/strains synchronously in this study.

Keywords： avian influenza virus; Newcastle disease virus; multi-target; nucleic acid mass spectrometry

*Corresponding authors：" CHONG Yan， E-mail： chongy1965@163.com; LAI Ping’an， E-mail： 1979669124@qq.com

禽流感（avian influenza， AI）及新城疫（Newcastle disease， ND）是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的兩種禽病，具有發(fā)病快，死亡率高的特點，常常給養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊。對于禽流感，目前最為嚴重的是由H5、H7亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的高致病性禽流感和H9亞型病毒引起的禽流感^［1］。盡管H9亞型禽流感為低致病性的，但會導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量大幅下降，肉仔雞發(fā)病率、死亡率升高，對我國家禽養(yǎng)殖效益影響巨大^［2］。新城疫目前仍然是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴重且是發(fā)病率高的疾病之一，在養(yǎng)殖業(yè)的多年發(fā)展過程中，盡管采取了密集免疫措施，但也不時發(fā)生疫情，特別是自我國發(fā)現(xiàn)基因Ⅵ、Ⅶ型等新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）毒株感染以來，這些毒株的流行時有發(fā)生并造成較為嚴重的經(jīng)濟損失^［3］。

AIV和NDV均為RNA病毒，變異迅速，特別是禽流感病毒HA基因和新城疫F基因，在免疫選擇壓力下，亞型內(nèi)或同一基因型毒株基因序列可存在較大差異^{［1，3］}。因此針對單一基因靶位的分型檢測技術(shù)常常會漏檢同一亞型的變異毒株?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種新型質(zhì)譜檢測技術(shù)，通過將生物大分子與芯片上基質(zhì)分子共結(jié)晶后，在激光轟擊后與基質(zhì)分離形成帶正電的離子，在真空飛行中將不同質(zhì)核比的離子分開并進行檢測。該方法通過與超微量多重（RT-PCR）聯(lián)用，設(shè)計針對不同靶標的一系列延伸引物（UEP）進行單堿基延伸反應(yīng)，通過對多種特異性延伸片段進行質(zhì)量檢測，從而實現(xiàn)對樣品的多靶標同步檢測^［4］。目前，核酸飛行質(zhì)譜可實現(xiàn)最多單管數(shù)十個靶點的同步檢測，可顯著降低單個靶點檢測的時間和物料成本^［5］。禽流感病毒主要亞型和新城疫中強毒株變異大，多靶點檢測思路可快速對禽流感病毒主要亞型和中強毒力新城疫病毒株作出精準鑒別。由于禽流感病毒H5/H7/H9亞型以及中強毒力新城疫病毒株型復(fù)雜，目前尚未有快速、靈敏的針對以上病毒亞型/毒株的多靶點分子檢測技術(shù)。

本研究針對禽流感、新城疫病毒、禽流感病毒重要亞型（H5/H7/H9）、新城疫中強毒株以及β-actin 內(nèi)參基因，設(shè)計多重RT-PCR引物及UEP延伸引物，建立并優(yōu)化了對樣品中禽流感、新城疫病毒及重要亞型/株型的多靶點同步檢測的飛行質(zhì)譜方法，為口岸相關(guān)產(chǎn)品中禽流感、新城疫病毒的精準智能監(jiān)測提供了新的高通量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸及被檢樣品

滅活病毒核酸A/Chicken/JL（H3），A/Chicken/JL（H4），A/Duck/HB （H5N1），A/Chicken/HD （H5N1），A/Duck/LCR （H5N1），A/Duck/SY（H5N1），A/Bird/WV（H5N1），A/Duck/BJ（H5N5），A/Chicken/BJCIQ GDV1（H7），A/Chicken/SDV（H9N2），NDV F48E9，NDV Lasota，NDV I系疫苗株，IBV/H52，DVEV/BJ，GPV/BJ 均為本實驗室保存，鴿源鴿新城疫病毒YQ/SPF F3（基因VI型）核酸，北京市農(nóng)林科學(xué)院惠贈；NDV NA-1M株（基因VII型）F基因體外轉(zhuǎn)錄RNA，本實驗室制備保存。滅活拭子及組織樣品，本實驗室收集保存。

1.2 主要試劑

Labserv預(yù)分裝磁珠法病毒核酸提取試劑盒，購自賽默飛公司；多重RT-PCR擴增試劑及酶混合物，購自翌圣生物公司；蝦堿性磷酸酶（SAP）、單堿基延伸試劑以及SpectroChip CPM384芯片，購自浙江迪譜診斷技術(shù)有限公司；引物及探針，均委托上海生工生物工程公司合成；RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7及SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Promega公司。

1.3 主要設(shè)備

核酸飛行時間質(zhì)譜儀為浙江迪譜診斷技術(shù)有限公司產(chǎn)品；QuantStudio 5熒光定量PCR儀為賽默飛公司產(chǎn)品；數(shù)字 PCR 儀為新羿生物公司產(chǎn)品。

1.4 樣品前處理及核酸提取

樣品按照GB/T 19438.1—2004 所述方法進行前處理后，使用商品化磁珠法病毒核酸提取試劑盒提取核酸，洗脫于 80 μL無核酸酶水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 核酸質(zhì)譜檢測引物的設(shè)計合成

對于禽流感、新城疫病毒通用檢測，選擇M基因作為靶區(qū)域，對于H5、H7和H9亞型檢測，選擇HA基因作為靶區(qū)域，對于新城疫病毒中強毒株檢測，選擇其F基因112—117位氨基酸位點編碼基因及其附近序列作為靶區(qū)域，內(nèi)參基因選擇禽類和哺乳動物β-actin 基因作為靶區(qū)域。根據(jù) GISAID 和NCBI發(fā)布的相關(guān)序列，采用MAFFT v7.52 分別進行序列比對，設(shè)計合成 7 套含質(zhì)量標簽的擴增引物和15條延伸引物。用于核酸質(zhì)譜檢測的擴增及延伸引物名稱、序列及分子量見表1。

1.6 陽性質(zhì)控品制備

分別克隆構(gòu)建以下含有各個靶標完整基因片段的質(zhì)粒pGEM-T-Influ A-M，pBSK-HA（H5N2），pMD20-T-HA（H7N1），pMD20-T-HA（H9N2），pGEM-T-Lasota-M以及pGEM-T-F48E9-F。將各個質(zhì)粒線性化后，使用Promega T7或SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備出以上各個靶標基因的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，測定計算出拷貝數(shù)，使用含有5 ng·μL^-1雞肉總RNA的稀釋液分別稀釋后，混合作為多靶標陽性質(zhì)控品。

1.7 反應(yīng)體系建立與優(yōu)化

將上述陽性質(zhì)控品稀釋至各個病原靶標均為100 copies·μL^-1作為模板，引物起始終濃度從1 μmol·L^-1開始，UEP初始濃度按照分子量4 000～5 000 u為5 μmol·L^-1，5 000～6 000 u為7.5 μmol·L^-1，6 000～7 000 u為10 μmol·L^-1，7 000 u以上15 μmol·L^-1的原則進行混合，以所有靶標均能同步檢出作為標準進行反應(yīng)體系優(yōu)化。經(jīng)多重擴增、SAP 反應(yīng)及單堿基延伸反應(yīng)后，在384反應(yīng)板中設(shè)定位置先加入18 μL DEPC水，將反應(yīng)產(chǎn)物全部置于已加入反應(yīng)板中預(yù)先添加DEPC水的各個孔中，貼膜離心。將預(yù)先編輯好包括各條UEP引物分子量以及單堿基延伸后分子量信息的測試文件導(dǎo)入軟件，打開核酸飛行質(zhì)譜儀甲板，將384反應(yīng)板封板膜去掉后放入指定位置。然后將檢測芯片放入指定位置。設(shè)置樹脂純化產(chǎn)物后進行質(zhì)譜檢測。

1.8 最低檢出限（LOD）測定

為確定各個靶標同步檢測的LOD，將103、102、50、25、12、6、3、1、0.5 copies·μL^-1的6種靶標混合體外轉(zhuǎn)錄RNA，應(yīng)用“1.7”建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法進行每個稀釋度8個重復(fù)的檢測，使用概率回歸計算出各個靶標的檢測下限。

1.9 與熒光RT-PCR檢測極限的比較

以H7檢測靶標為例，將pMD20-T-HA（H7N1）體外轉(zhuǎn)錄RNA作適當(dāng)稀釋后使用數(shù)字PCR測定其拷貝數(shù)，作10倍系列稀釋，分別采用建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法和標準的H7亞型熒光RT-PCR檢測方法進行比較，比較兩種方法的靈敏度差異。

1.10 特異性試驗

采用建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法對“1.1”所收集病毒核酸進行檢測，評估方法的特異性。

1.11 重復(fù)性試驗

采用建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法對濃度分別為50、25以及12 copies·μL^-1的6種混合靶標體外轉(zhuǎn)錄RNA進行8次重復(fù)性試驗，以SNR（信噪比）gt;6作為判定標準，評價方法的可重復(fù)性。

1.12 樣品檢測

對179份實驗室收集保存的送檢樣品（包括拭子樣品和組織臟器）應(yīng)用建立的飛行質(zhì)譜方法和標準的熒光RT-PCR方法進行檢測比較，在實際樣品中驗證方法的實用性。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系建立與優(yōu)化

為獲得最佳效果，首先通過對 16 條擴增引物濃度進行優(yōu)化，建立總體積為 5 μL多重微量RT-PCR 體系：其中包括RNA 模板2 μL，2×HU MP緩沖液 2.5 μL，酶混合物 0.3 μL，NDV M 基因擴增引物濃度為 0.16 μmol·L^-1，其余擴增引物濃度均為 0.1 μmol·L^-1。多重RT-PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件：50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，加入 2 μL SAP 反應(yīng)液：其中 SAP 緩沖液 0.17 μL，SAP 酶 0.3 μL，DEPC 水 1.53 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。SAP 反應(yīng)結(jié)束后，加入優(yōu)化好的單堿基延伸反應(yīng)體系 2 μL，其中包括iPLEX 延伸緩沖液0.2 μL，iPLEX終止Mix 0.2 μL，iPLEX 延伸酶0.04 μL，延伸引物濃度為 4.7～23.5 μmol·L^-1。單堿基延伸反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，40個循環(huán)，其中每個循環(huán)中，94 ℃ 5 s后，52 ℃ 5 s與80 ℃ 5 s連續(xù)循環(huán)5次；72 ℃ 3 min。結(jié)果顯示建立的反應(yīng)可同時檢出均為100 copies·μL^-1所有病原靶標，詳見圖1。

2.2 最低檢出限（LOD）測定結(jié)果

應(yīng)用建立的反應(yīng)體系對各個靶標同步檢測的LOD 進行測定，概率回歸結(jié)果顯示6 種病原靶標的檢測限分別為AIV 通用 13.43 copies·μL^-1，H5 8.82 copies·μL^-1，H7 13.55 copies·μL^-1，H9 15.4 copies·μL^-1，NDV 通用 12.81 copies·μL^-1，NDV 中強毒株 11.28 copies·μL^-1。詳見圖 2。

2.3 與熒光RT-PCR檢測極限的比較

數(shù)字 PCR 測定 H7 體外轉(zhuǎn)錄 RNA拷貝數(shù)為18 891 copies·5 μL^-1。作 10 倍系列稀釋后，對濃度為0.037 8～3.78×104copies·μL^-1的體外轉(zhuǎn)錄 RNA，分別采用建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測技術(shù)熒光 RT-PCR 檢測方法進行比較，結(jié)果顯示兩種檢測方法的檢測極限均為0.378 copies·μL^-1，表明對于單一靶標，兩種檢測方法的檢測極限在同一數(shù)量級水平，詳見圖3、 4。

2.4 特異性試驗

特異性試驗結(jié)果表明建立的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法均只能在各自延伸產(chǎn)物產(chǎn)生特異性單峰，其中H3和H4亞型毒株核酸僅A型通用靶標出現(xiàn)特異延伸峰；6個不同來源H5亞型毒株核酸H5靶標均出現(xiàn)特異性延伸峰，其他亞型靶標未出現(xiàn)延伸峰；H7和H9亞型毒株核酸均在相應(yīng)亞型靶標出現(xiàn)特異延伸峰；NDV中期毒株包括I系（中毒）、F48E9（強毒）、YQ/SPF F3（強毒）以及NDV NA-1M株（強毒）均在F基因靶標出現(xiàn)特異性延伸峰；NDV LaSota（弱毒）僅在通用M基因靶位出現(xiàn)延伸峰；而其他病原核酸的各個病原靶位均未出現(xiàn)特異性延伸峰。表明建立的方法能夠特異性對禽流感病毒和新城疫病毒進行檢測和主要亞型的鑒別，且與其他病原靶標無交叉反應(yīng)，特異性強?！?.1” 所述的禽流感和新城疫病毒核酸的特異性質(zhì)譜圖見圖5。

2.5 重復(fù)性試驗

以SNRgt;6作為判定標準，結(jié)果顯示僅在各個靶標濃度為12 copies·μL^-1時，總計有5個檢測值為陰性，其中AIV通用 1個（陽性率87.5%），H7 1個（陽性率87.5%），H9 2個（陽性率75%），新城疫通用1個（陽性率87.5%）。表明方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性良好，結(jié)果匯總見表2。

2.6 樣品檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表3所示，對于57份熒光RT-PCR檢測為AIV陽性樣品，AIV通用檢測敏感性96.5%，特異性100%，符合率為98.9%，兩種方法的Kappa值為0.974。其他靶標檢測敏感性、特異性及符合率均為100%；Kappa值為1.0。以上結(jié)果表明對于真實送檢樣品，兩種方法檢測結(jié)果無顯著差異。

3 討 論

禽流感及新城疫是世界養(yǎng)禽業(yè)最重要的兩大傳染病，具有流行范圍廣，傳播速度快，基因型復(fù)雜，危害大，難以防控等特征。使用單一靶標檢測方法不僅檢測周期與成本加大，而且由于亞型或株型內(nèi)變異大，容易發(fā)生變異株漏檢^［6］；而開發(fā)多靶標高通量檢測方法，可實現(xiàn)禽流感或新城疫重要亞型或株型的同步快速鑒別，提升檢測效率的同時，還可防止變異株漏檢，從而為防控提供高效技術(shù)保障。

對于禽流感及新城疫的快速核酸精準檢測，主要包括RT-PCR結(jié)合一代測序，熒光RT-PCR，等溫擴增技術(shù)等。比較前沿的技術(shù)平臺包括高通量測序（NGS），靶向納米孔測序以及數(shù)字PCR技術(shù)等。目前應(yīng)用最為廣泛的是熒光RT-PCR技術(shù)，該技術(shù)靈敏、特異，實現(xiàn)了閉管實時檢測，可精準檢出1～10拷貝的靶核酸，但該技術(shù)每一檢測通道僅能對單一靶位進行檢測。數(shù)字RT-PCR盡管可實現(xiàn)真正意義上的絕對定量，但同樣存在檢測通量低，一次性檢測樣本量和靶標數(shù)有限的缺點^［7］。RT-PCR結(jié)合第一代測序技術(shù)由于引物容錯能力較強，可較好規(guī)避病原變異對檢測帶來的影響，但一般適用于檢測小于600 bp的核酸序列中的檢測，多重檢測往往會顯著影響擴增靈敏度。二代及三代全基因組測序（WGS）目前也已經(jīng)用于禽流感病毒的分子溯源研究^［8］，但WGS耗時長，成本高，技術(shù)要求高，因此一般只用于重要樣品的分子變異和溯源分析，不適合常規(guī)樣品快速篩查^［9］。

研究中發(fā)現(xiàn)，由于單堿基延伸的高靈敏度和質(zhì)譜技術(shù)的高分辨率，將多重RT-PCR、單堿基延伸及基于MALDI-TOF核酸質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合使用，可顯著提升多重RT-PCR反應(yīng)的靈敏度，并降低多重引物設(shè)計難度，通過精準寡核苷酸分子量測定，進而推算出延伸位點的堿基類型，實現(xiàn)SNP位點測定，特別適合于亞型、基因型或株型多且復(fù)雜病原的多靶位檢測^［10］。而且該技術(shù)具有開放和可擴展性，可以根據(jù)需要添加新的檢測位點，用于病原多變異位點的靶向識別和追蹤^［11］。

本研究針對禽流感病毒及其重要亞型（H5/H7/H9）、新城疫病毒及其中強毒株以及用于質(zhì)控采樣和檢測過程β-actin 內(nèi)參基因，在對不同地域或進化分支的毒株進行序列比對的基礎(chǔ)上進行多重RT-PCR引物及UEP延伸引物的設(shè)計，為能覆蓋不同來源的毒株，避免變異株漏檢，對于變異最大的H5毒株、NDV中強毒株等均設(shè)計了多套擴增引物或UEP引物，并取得較好效果。特異性試驗中顯示該體系能夠檢出收集的多個不同來源的 H5、H7以及H9亞型流感病毒核酸，和常見的基因II型、VI型和VII型NDV強毒株核酸，但不能檢出Lasota弱毒株。靈敏度試驗中發(fā)現(xiàn)，對所有靶標的同步檢測，本方法的LOD略低于熒光RT-PCR方法，為8.82～15.40 copies·μL^-1。但對于樣品中單一靶標，本方法與熒光RT-PCR方法靈敏度在同一水平，推測是由于多靶標同步檢測中各個靶標的擴增存在一定競爭抑制。在對臨床送檢樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，本方法與熒光 RT-PCR方法具有較好的一致性，Kappa為0.974～1.0，僅在禽流感通用靶標檢測中，存在2份樣品的差異，由于這兩份樣品為弱陽性，且測試人員和測試時間存在差異，推測可能是人員誤差或低濃度核酸管內(nèi)分布不均勻所致。

4 結(jié) 論

聯(lián)合使用微量多重RT-PCR、單堿基延伸和基于MALDI-TOF的質(zhì)譜技術(shù)，針對禽流感和新城疫病毒建立了一種高通量核酸質(zhì)譜檢測方法，建立的方法可即時同步檢測禽流感病毒（A型通用）、H5亞型、H7亞型、H9亞型、新城疫病毒及其中強毒株，各個靶標的檢測靈敏度為8.82～15.40 copies·μL^-1，特異性好，與熒光RT-PCR檢測方法相比，禽流感病毒通用檢測靶標符合率為98.9%；其他靶標的符合率均為100%。該方法可用于禽流感、新城疫病毒的快速鑒別檢測及重要亞型/株型的同步快速分型鑒定。

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（編輯 白永平）