非洲豬瘟病毒p72蛋白抗體全自動化學發(fā)光酶免疫檢測方法的建立

摘 要： 抗體檢測對于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染診斷和疫苗研究至關重要，因此建立一種基于 ASFV p72 蛋白抗體的全自動化學發(fā)光酶免疫分析方法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）具有重要意義。本研究以重組 p72 蛋白偶聯(lián)的磁微粒（magnetic particles，MPs）捕獲 p72 蛋白抗體，再結合堿性磷酸酶（alkaline phosphates， AP）標記的 p72 蛋白，借助全自動化學發(fā)光分析儀，分析豬血清中 p72 蛋白特異性抗體水平。經(jīng)反應條件優(yōu)化，建立了一種ASFV p72 蛋白抗體全自動化學發(fā)光酶免疫檢測方法。結果顯示，建立的 CLEIA 陰性、陽性臨界值為 9.505 U·mL^-1，診斷特異性和靈敏性分別為98.33% 和100%，與其他豬病原陽性血清無交叉反應，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于 5% 和 10%，各種試劑組分可以保存 6 個月以上，對 ASFV 陽性標準血清，分析敏感性為1∶12 800，與國產(chǎn)商品化試劑盒的總符合率達 95.90%。綜上，本研究建立的化學發(fā)光方法具有高靈敏性和可重復性，有自動化檢測、操作步驟簡單的優(yōu)勢，可為 ASFV 的檢測提供新的技術支持。

關鍵詞： 非洲豬瘟病毒；p72；化學發(fā)光酶免疫；抗體檢測

中圖分類號：

S852.659.1"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1355-11

收稿日期：2024-04-03

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD2001205）；廣東省基礎與應用基礎研究基金（2023A1515010234）

作者簡介：馬曉莉（1981-），女，廣東深圳人，實驗師，碩士，主要從事預防獸醫(yī)及實驗動物模型研究，E-mail：maxl@scau.edu.cn；李 段（1987-），女，河南上蔡人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病診斷技術研究，E-mail：517341252@qq.com。馬曉莉和李段為同等貢獻作者

*通信作者：徐 錚，主要從事豬病防控技術研究，E-mail：stonezen@scau.edu.cn；王 磊，主要從事動物疫病診斷技術研究，E-mail：9286980098@qq.com

Establishment of a Fully Automated Chemiluminescent Enzyme Immunoassay for Detecting Antibodies against African Swine Fever Virus p72

MA" Xiaoli1， LI" Duan^1，3， ZENG" Daoping3， LIU" Yanling1， WANG" Xiaomin1， PENG" Guoliang2，

SONG" Changxu1， WANG" Lei^1，2*， XU" Zheng^1*

（1.Laboratory Animal Center and College of Animal Science， National Engineering Center for

Swine Breeding Industry， State Key Laboratory of Swine and Poultry Breeding Industry，

South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China; 2.Henry Fok School of

Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005，" China; 3.Wens Foodstuff

Group Co.， Ltd， Guangdong Biaoyun Biotechnology Co.， Ltd，

Yunfu 527400，" China）

Abstract：" Antibody detection is important for African swine fever virus （ASFV） infection diagnosis and vaccine research. Therefore， it is of great significance to establish a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay （CLEIA） based on ASFV p72 protein antibody. For the detection， antibodies against p72 were captured by magnetic particles （MPs） coupled with purified p72 protein， then combined with alkaline phosphates （AP）-labelled p72， and ASFV p72 antibodies can be determined using a fully automated chemiluminescence analyzer. Under optimal working conditions， the cut-off value of the established CLEIA was 9.505 U·mL^-1 with a diagnostic specificity and sensitivity of 98.33% and 100%， respectively， and no cross-reactivity with other porcine pathogen-positive sera were found. The intra- and inter-batch coefficients of variation were less than 5% and 10%， respectively， and all components can be stored for more than 6 months at 4 ℃. The lowest detection limit for ASFV-positive standard serum was 1∶12 800. The total coincidence rate with the commercial kit was up to 95.90%， indicating a good applicability. In conclusion， the established CLIEA has the advantages of high sensitivity and reproducibility， combining with automated detection and simple operation steps， which can provide an important tool for the clinical diagnosis of ASF.

Keywords： African swine fever virus; p72; chemiluminescent enzyme immunoassay; antibody detection

*Corresponding authors：" XU Zheng， E-mail： stonezen@scau.edu.cn; WANG Lei， E-mail： 9286980098@qq.com

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種致死率高的急性、高度接觸烈性傳染病^［1］，被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定報告疾病。1921年，ASF 在肯尼亞被確認并在整個撒哈拉以南非洲地區(qū)傳播^［2］。2018 年8月，ASF 首次在中國暴發(fā)并迅速席卷全國和持續(xù)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為我國養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病^［3］。目前尚未研發(fā)出安全有效的疫苗和藥物來防控ASF，只能通過高效精準的診斷方法早發(fā)現(xiàn)早處理來控制疫情的擴散。由于天然弱毒毒株存在，核酸檢測已不能完全滿足檢測需求。此外，自ASF暴發(fā)以后，養(yǎng)豬企業(yè)、第三方檢測機構等相繼建成了不同規(guī)模的疫病診斷實驗室，隨著 ASFV 抗體檢測量的不斷增大，人力成本不斷升高，對于高通量的，自動化檢測的需求逐漸顯現(xiàn)。因此，建立一種自動化程度高，靈敏性高且穩(wěn)定的 ASFV 抗體檢測方法非常必要。

化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是將化學發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應相結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。根據(jù)反應原理，分為直接化學發(fā)光（CLIA）、間接化學發(fā)光（也稱化學發(fā)光酶免疫分析chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）和電化學發(fā)光（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）^［4-5］。CLIA 已廣泛應用于生命科學、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全和藥物分析等領域。特別是新型冠狀病毒?。╟orona virus disease 2019，COVID-19）暴發(fā)以后。全自動的 CLIA 可以對 COVID-19 抗原和抗體進行快速精準檢測，從而在 COVID-19 的診斷和疫苗研發(fā)中發(fā)揮了重要作用^［6-7］。在豬病方面，O 和 A 型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）^［8］、豬偽狂犬病毒（pseudorabies virus， PRV）^［9］的 CLIA 已有研究，在檢測靈敏性上，CLIA 明顯高于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。但在臨床上，這些 CLIAs 仍少有應用。

ASFV 是一種大型包膜的 DNA 病毒，屬于 Asfarviridae 家族成員^［10］。ASFV 基因組大小為 170 至 190 kb，編碼 150～200種蛋白質(zhì)^［11］。ASFV B646 L 基因編碼主要的衣殼蛋白 p72^［12］。在不同的 ASFV 毒株中，p72 的氨基酸序列具有很高的同源性。p72 質(zhì)量約占 ASFV 病毒粒子總質(zhì)量的 30%^［13］，是最早誘導豬產(chǎn)生抗體的病毒蛋白之一。另外，基于 p72 的亞單位疫苗研究已經(jīng)取得進展^［14-15］，針對 p72 抗體的精準評估對亞單位疫苗研發(fā)具有重要意義。因此，ASFV p72 是比較理想的作為診斷靶標。本研究建立了一種 ASFV p72 蛋白抗體的 CLEIA，為有效防控 ASF 提供簡便快速的監(jiān)測、檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

非洲豬瘟病毒重組 p72 蛋白由華南農(nóng)業(yè)大學國家生豬種業(yè)工程技術研究中心制備和保存^［16］；親水的甲苯磺?；盼⒘＃ㄘ浱枺篔-MS-S160T）購自北京博爾邁生物技術有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphates， AP；編號：APMB-RO）購自美國 Roche 公司；全自動化學發(fā)光免疫分析儀（型號：Venus 100H）購自重慶科斯邁有限公司；非洲豬瘟病毒阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒（西班牙英吉鈉，批號：210099）購自青島瑞爾生物技術有限公司；非洲豬瘟病毒 ELISA 抗體檢測試劑盒（貨號：Y.ME06C）購自洛陽普泰生物技術有限公司。

結合緩沖液：0.1 mol·L^-1 HEPES 緩沖液（pH 9.5）；催化劑：1 mol·L^-1硫酸鈉；封閉劑：10% 牛血清白蛋白（BSA）；洗滌緩沖液： Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBS，pH 7.4）含0.05% Tween 20；MPs 保存液：HEPES 緩沖液（pH7.4）含 1% BSA、0.05% Tween-20、 0.05%" Proclin 300。

1.1.2 血清樣品

標準陰性參考血清、非洲豬瘟病毒陽性標準血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心（cvcc.ivdc.org.cn）提供；豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬流行腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬圓環(huán)病毒 2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）和豬葡萄球菌（Staphylococcus hyicus，S. hyicus）的陽性血清，由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院/國家生豬種業(yè)工程技術研究中心保存。122 份滅活后的臨床血清，包括58 份陰性血清樣品和 26 份陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇遥◤V州）提供。

1.2 p72 偶聯(lián) MPs 的制備

用洗滌緩沖液洗滌1 mg MPs三次，磁力架去除上清液，加入900 μL結合緩沖液重懸后加入5 μg純化的p72，加入結合緩沖液補齊至1 mL，混勻，加入500 μL催化劑，在37 ℃下旋轉儀孵育18 h，棄上清，加入15 μL封閉劑，在37 ℃下繼續(xù)旋轉孵育6 h，棄清液，洗滌3次，用MPs保存液重懸后調(diào)整濃度至0.6 mg·mL^-1，取樣送武漢賽維爾生物科技有限公司，用掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscopes，SEM）和動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）分析，p72偶聯(lián)的MPs（p72-MPs）在棕色瓶中，于4 ℃ 冰箱保存。

1.3 AP標記 p72 蛋白的制備

按文獻方法^［17］，將 AP 和 p72 蛋白分別稀釋至 0.5、1 mg·mL^-1后，各取 500 μL 置 2 mL 離心管，輕輕混勻，加入含有 1% 戊二醛的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），在 37 ℃ 避光孵育 4 h，加入 100 μL 1 mol·L^-1的單乙醇胺溶液，繼續(xù)孵育 2 h，用脫鹽柱純化 AP 標記物（p72-AP），保存至 HEPES 緩沖液（pH 7.4）中，棕色瓶裝，置4 ℃冰箱保存。

1.4 化學發(fā)光檢測程序建立

分別用一步法和兩步法模式檢測。

一步法模式：加入待檢樣品和標準品各 20 μL，p72-MP 工作液和 AP-p72 工作液各 100 μL，混勻 6 s，4 ℃ 孵育 15 min ；兩步法模式：加入待檢樣品和標準品各 20 μL，加入 100 μL p72-MPs 工作液，混勻 4 s，4 ℃ 孵育 10 min，洗滌 4 次，加入 100 μL p72-AP 工作液，混勻 4 s，4 ℃ 孵育 10 min。后續(xù)步驟一致，即洗滌 4 次，加入 200 μL 化學發(fā)光底物，混勻 4 s，反應 5 min ；讀取相對光單位（relative light unit， RLU）值。

樣本中的 p72 抗體濃度與收集到的 RLU 呈正相關，通過檢測系列 ASFV 陽性標準血清繪制標準曲線，利用標準曲線即可計算待測樣品中 p72 抗體濃度。

1.5 標準品曲線的繪制

將 ASFV 陽性標準血清按 2 倍梯度稀釋，分別用本研究建立的化學發(fā)光方法和商品化的 ELISA 試劑盒檢測。根據(jù)商用試劑盒檢測出的陰性、陽性臨界范圍，選擇適當?shù)?6 個稀釋品作為標準品，用于繪制標準曲線。假定 p72 抗體濃度單位為 U·mL^-1，以 p72 抗體濃度值作為橫坐標、 RLU 為縱坐標，進行四參數(shù)曲線擬合方法繪制標準曲線。

1.6 反應條件優(yōu)化

1.6.1 抗原偶聯(lián)磁微粒的工作劑量優(yōu)化

稀釋 p72-MPs，反應劑量分別為 50、100、 150、 200 μL，同時檢測 1∶6 400 稀釋的 ASFV 陰性、陽性標準血清，讀取 RLU 值，計算 P/N 值，P 為陽性樣品 RLU 值，N 為陰性樣品 RLU 值。當 P/N 值最大時為抗原偶聯(lián)磁微粒的最佳工作劑量。

1.6.2 堿性磷酸酶標記抗原工作劑量的優(yōu)化

稀釋p72-AP，反應劑量分別為50、100、150、200 μL，同時檢測1∶6 400稀釋的ASFV陰性、陽性標準血清，讀取 RLU 值，計算 P/N值，當P/N值最大時為ALP標記抗原最佳工作劑量。

1.6.3 反應模式的優(yōu)化

將反應設置為一步和兩步模式，檢測1∶800、1∶1 600、1∶3 200、 1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀釋的ASFV陽性和陰性標準血清，陽性血清樣品進行檢測并讀取 RLU 值，同時計算 P/N 值，當P/N 值最大時為最佳反應模式。

1.6.4 酶促反應時間的優(yōu)化

將化學發(fā)光底物的反應時間分別設置為1、3、5和8 min，同時檢測 1∶6 400 稀釋的ASFV陰性、陽性標準血清，讀取RLU值，計算P/N 值，當 P/N 值最大時為酶促反應的最佳時間。

1.7 臨界值、診斷敏感性和特異性測定

用本研究建立的CLEIA方法檢測58份陰性血清樣品和26份陽性血清樣品，將檢測結果輸入MedCalc軟件，進行 ROC 曲線（receiver operating characteristic curve）分析，測定診斷靈敏性和特異性，計算臨界（cut-off）值。

1.8 交叉反應性試驗

用本研究建立的 CLEIA 方法檢測CSFV、PRV、PRRSV、PEDV、PCV2和S. hyicus 共 6 種病原的血清，根據(jù)判斷標準，判定陰陽性，分析本方法的交叉反應性。

1.9 重復性試驗

用同一批次的 p72-MPs 和 p72-AP，檢測 6 份血清樣品，包括 2 份陰性，2 份弱陽性，2 份中等陽性，每個樣品做 3 個重復，通過已優(yōu)化好的反應條件，進行批內(nèi)的重復性試驗，同時對抗體濃度值進行統(tǒng)計學分析，計算變異系數(shù)。用 3 組不同批次的 p72-MP 和 p72-AP，檢測 6 份血清樣品，進行批間的重復性試驗，計算變異系數(shù)。

1.10 試劑穩(wěn)定性試驗

將本研究使用的 p72-MPs、 p72-AP、洗滌液、樣品稀釋液、發(fā)光底物等組分，于 4 ℃ 冰箱分別保存1、2、3、6個月，檢測同一陽性樣品和陰性樣品，測試試劑穩(wěn)定性。

1.11 靈敏性試驗

用研究建立好的 CLEIA 方法，西班牙英吉鈉公司生產(chǎn)的阻斷法 ASFV 抗體 ELISA 檢測試劑盒和洛陽普泰生物技術有限公司生產(chǎn)的間接法 ASFV 抗體 ELISA 檢測試劑盒對梯度稀釋的 ASFV 樣品標準血清和臨床血清進行檢測，比較靈敏性。

1.12 符合率試驗

用研究建立好的 CLEIA 方法和商品化 ELISA 試劑盒檢測 122 份臨床血清樣品，根據(jù)判定標準，分析 CLEIA 和 ELISA 檢測結果的符合率。

2 結 果

2.1 p72-MPs的制備和特征

本研究選擇 1.5 μm 的磁微粒，參照 JSR 抗原-磁微粒偶聯(lián)方法，把重組 p72 蛋白偶聯(lián)到磁微粒，并用其捕獲血清樣品中的 p72 抗體。最終保存濃度為 0.6 mg·mL^-1。通過SEM 圖像可以觀察到MPs和 p72-MPs 大小均勻，且偶聯(lián)前后均分散均勻，未發(fā)生團聚現(xiàn)象。未偶聯(lián)的MPs表面價光滑，微粒尺寸均一，而偶聯(lián)后的 MPs 均被聚合物覆蓋，微粒尺寸略有增大（圖 1A）。另外，通過DLS分析可以看到，偶聯(lián)前MPs的水合粒徑為1.72 μm±0.06 μm，而偶聯(lián)后MPs的水合粒徑為2.05 μm±0.28 μm（圖 1B）。以上結果表明 p72 蛋白已經(jīng)成功偶聯(lián)到磁 MPs 表面。

2.2 p72-MPs最佳稀釋度的確定

MPs 和 AP 的稀釋比例是影響免疫測定靈敏度和特異性的關鍵參數(shù)，通過測量6 400 倍稀釋的標準樣品，以 P/N 值作為評價指標。將p72和AP標記到純化的p72蛋白上，用 BCA 試劑盒測定標記物蛋白濃度為 0.75 mg·mL^-1。以不同劑量的 p72-MPs 檢測樣品，以確定最佳的 p72-MP 最佳使用量。結果如表1所示，隨著 p72-MP 劑量增大，樣品 RLU 值增大，當 p72-MPs 的量為100 μL時候P/N值最大（為 5.11），可確定重組 p72-MP 的最佳工作劑量為100 μL。

2.3 P72-AP最佳稀釋度的確定

根據(jù)優(yōu)化的條件，用不同體積的 p72-AP 蛋白，檢測陰性、陽性血清樣品，以確定最佳 p72-AP 工作劑量。結果如表2 所示，當 p72-AP 為 100 μL 時 P/N 值最大，由此可確定p72-AP 最適工作劑量為 100 μL。

2.4 酶促反應時間的確定

化學發(fā)光反應，根據(jù)標記物不同，分為輝光型和閃光型，CLEIA 發(fā)光屬于輝光型，發(fā)光可持續(xù)數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘以上，AP-AMPPD 系統(tǒng)的信號檢測在發(fā)光信號相對穩(wěn)定的區(qū)域任意點測量單位時間的發(fā)光強度^［18］。根據(jù)已優(yōu)化好的條件，優(yōu)化最佳的酶促反應時間。隨著反應時間的延長，陰性、陽性血清樣品 RLU 值基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。如表3 所示，當反應時間為 5 min 時，酶與底物結合最充分且陽性、陰性血清樣品 P/N 值達到最大。因此，本研究建立的 CLEIA 方法最佳酶促反應時間確定為 5 min。

2.5 檢測程序的確定

化學發(fā)光的反應模式分為一步法和兩步法，反應的模式會對反應時間和靈敏度產(chǎn)生影響^［19］。對本方法的反應模式進行優(yōu)化，檢測不同濃度的標準品。以標準品和陰性樣品的信號比值（P/N）為縱坐標，抗體濃度品為橫坐標，進行線性分析。如圖 2 所示，一步法的 P/N 較高且線性相關性較好，說明一步法相對兩步法具有更高的靈敏度；一步法孵育時間至少為 15 min，而兩步法孵育時間至少需要 20 min，一步法比兩步法可以節(jié)省反應時間，因此，確定一步法為選定檢測程序。

2.6 標準曲線的建立

用優(yōu)化好的抗原偶聯(lián)磁微粒工作劑量、堿性磷酸酶標記抗原工作劑量和反應時間，通過 CLEIA 檢測 ASFV 陽性標準血清，選擇 1∶800、 1∶1 600、 1∶3 200、1∶6 400、 1∶12 800、 1∶25 600 作為標準品。參考之前的研究，將血清中 p72 抗體濃度賦為 160、 80、 40、 20、 10、 5 U·mL^-1。以發(fā)光值（RLU）為縱坐標，以假定抗體濃度（U·mL^-1）為橫坐標，以四參數(shù)曲線擬合方法繪制標準曲線。方程式為：y=（A-D）/［1+（1/C）B ］+D，如圖 3 所示，方程為： y=（87 640.75-36 085.98）/［1+（x/8.36）^-1.7］ +36 085.97， R2=0.999 52，說明發(fā)光值和p72蛋白抗體濃度具有很好的相關性。

2.7 臨界值、診斷靈敏性和特異性測定

為了確定 CLEIA 的最佳臨界值，用建立的 CLEIA 檢測了 58 份 ASFV 陰性和 26 份滅活的 ASFV 陽性血清樣品。ROC 曲線如圖 4 所示，曲線下面積（AUC）面積為 0.999 （95%置信區(qū)間：0.956～1.00 之間，P＜0.001），診斷特異性為 98.33%，診斷敏感性為 100.00%。此時，CLEIA 的臨界值為 9.505 U·mL^-1 。當樣品中 p72 抗體濃度≥9.505 U·mL^-1時，樣品為 ASFV 抗體陽性；當樣品中 p72 抗體濃度＜9.505 U·mL^-1時，樣品為 ASFV 抗體陰性。

2.8 交叉反應性分析

為了評價建立的 CLEIA 的交叉反應性，用建立的 CLIA 法檢測了 CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PCV2 和 S. hyicus 的抗體陽性血清，同時設置 ASFV 抗體陽性血清和陰性血清對照。根據(jù) RLU 值計算各樣品 p72 抗體濃度。結果圖 5 所示，只有 ASFV 抗體陽性血清判定為陽性（抗體濃度gt;9.505 U·mL^-1），其他病原的陽性血清中 p72 抗體濃度均小于臨界值（lt;9.505 U·mL^-1），判定為陰性，表明建立的 CLEIA 方法對 ASFV 抗體陽性血清有較好的特異性。

2.9 分析靈敏性測試

為了分析檢測靈敏性，研究中使用了國產(chǎn)和進口的商品化 ELISA 試劑盒，與本研究建立的 CLEIA 方法進行對比，檢測不同稀釋度的 ASFV 陽性標準血清和臨床血清，結果顯示，當 ASFV 陽性標準血清稀釋度為 1∶12 800 時，p72 抗體濃度為"" 10 U·mL^-1，大于臨界值 9.505 U·mL^-1，判定為陽性，而進口 ELISA 試劑盒檢測限為 1∶800，國產(chǎn)試劑盒為 1∶6 400，檢測臨床血清也顯示出本研究的 CLEIA 最為靈敏，其次是國產(chǎn)試劑盒（表4）。表明建立的 CLEIA 方法敏感性較好，靈敏性高于商品化試劑盒。

2.10 試劑穩(wěn)定性測試

對于檢測方法的試劑應用，其試劑組分的穩(wěn)定性是重要評價的指標之一。2～8 ℃ 被廣泛用于生物試劑的存儲^［20］。將檢測試劑保存 1～6 個月，通過分析同一樣品的結果，測試試劑穩(wěn)定性，結果如圖6所示，抗體濃度沒有發(fā)生顯著變化，表明本研究

采用的試劑長期保存 6 個月仍然穩(wěn)定，具有良好的實際應用價值。

2.11 批內(nèi)和批間重復性測試

為了評價 CLEIA 的重復性，隨機選取6份血清，2個陰性，2個弱陽性，2個中等陽性，每份做3個重復，進行檢測并計算變異系數(shù)。結果如表5所示，批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）在0.76％～4.90％之間，小于5％，表明所建立的 CLEIA 方法批內(nèi)重復性好。抽取3個不同批次磁微粒和酶標記抗原，按已建立的 CLEIA 方法檢測6份血清樣品，結果如表5所示，批間變異系數(shù)（CV%）在1.27％～9.75％之間，小于10％，從而表明所建立的方法批間重復性好。

2.12 與商品化試劑盒的符合率評價

為確定建立的 CLEIA 能否用于豬場血清檢測，從出現(xiàn)疑似 ASF 的豬場采集 122 份豬血清樣本，滅活后進行檢測。由于商品化試劑盒和建立的CLEIA 敏感性相近，試驗用商品化試劑盒和建立的 CLEIA 同時檢測樣品，并比較兩者檢測結果。如表6所示，CLEIA 檢測結果顯示 18 份 ASFV 抗體陽性血清樣品和 104 份 ASFV 抗體陰性血清樣品，而商品化 ELISA 試劑盒檢測結果顯示 17 份陽性血清樣品和 105 份陰性血清樣品。統(tǒng)計結果顯示，兩種方法的總符合率為 95.90%，陰性符合率為98.10%，陽性符合率為83.33%。表明建立的 CLEIA 的結果與商品化試劑盒的結果符合率較高。

3 討 論

ASF 給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。抗體檢測為 ASF 防控提供了關鍵的技術支撐。目前，抗體檢測方法中，應用最為廣泛的是 ELISA 和膠體金試紙條，但是傳統(tǒng)的 ELISA 方法，也存在一些不足，比如操作步驟多，檢測時間長等；膠體金試紙條雖然簡單，但是無法滿足高通量的檢測。隨著人力成本增加，以及高通量檢測需求增多，自動化程度高、靈敏性好的檢測方法逐漸得到關注。因此，建立了一種用來檢測 ASFV p72 特異性抗體自動化的 CLEIA 至關重要。

CLEIA 是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、抗體、激素、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析。CLEIA 檢測技術日益成熟，代表了免疫診斷的發(fā)展方向。之前研究中，一種多表位的 CLEIA，可以檢測 O 型 FMDV 血清型 O 的抗體，評估多表位疫苗和滅活疫苗的免疫效力^［21］。而 2C 和3ABC非結構蛋白的 CLEIA 可以快速、準確地區(qū)分感染 FMDV 的豬和接種過疫苗的豬，有效解決了非結構蛋白對滅活疫苗污染而導致較高的假陽性率問題^［22］。而一種納米探針被應用于 CLEIA 中，以確定是否存在豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）感染^［23］。人類狂犬病疫苗（human rabies vaccine）中糖蛋白的質(zhì)量控制是基于 ELISA，然而 ELISA 并不能滿足現(xiàn)代化質(zhì)量控制系統(tǒng)的需要。而全自動的 CLEIA 分析性能優(yōu)于 ELISA，可能在現(xiàn)代疫苗質(zhì)量控制中具有重要的應用價值^［24］?？梢钥闯?，CLEIA 在疾病診斷、疫苗生產(chǎn)和疫苗免疫效力評價等方面發(fā)揮重要作用。

本研究建立的 CLEIA 方法具有較好的特異性和靈敏性，可以檢出低至 1∶12 800 倍稀釋的 ASFV 陽性血清，靈敏度優(yōu)于 ELISA 方法。與商業(yè)化 ELISA 試劑盒相比，所開發(fā)的 CLEIA 可實現(xiàn)全自動化的檢測，進一步縮短了檢測時間并降低了人員手動操作帶來的假陽性或假陰性概率，且能夠根據(jù)標準曲線精確地實現(xiàn)抗體水平的定量檢測。主要得益于三方面的設計。一是本研究建立的 CLEIA 方法基于雙抗原夾心原理，能檢測 IgM、IgA 和 IgG^［25］，而豬感染 ASFV 后就能產(chǎn)生上述抗體。研究表明，雙抗原夾心 ELISA 檢測 ASFV 抗體具有更高的特異性和靈敏度^［16］。二是建立的 CLIEA 使用 MPs 而不是傳統(tǒng)的 96 孔板來固定 p72。目前有研究使用 96 孔板建立了間接法的 CLEIA檢測 ASFV p54 抗體^［26］，也有通過羧基的 MPs 偶聯(lián) p30 蛋白，建立了間接法的 CLEIA，而羧基的MPs的使用顯著提高了檢測的靈敏度和特異性^［27］；化學發(fā)光常用羧基或甲苯磺酰基修飾的MPs，在實際生產(chǎn)中，羧基 MPs 使用過程工藝復雜，關鍵控制點多，而甲苯磺?；?MPs 使用工藝簡單，可進一步提升批間的穩(wěn)定性。三是本研究建立的 CLEIA 基于AP和1，2－二氧環(huán)己烷衍生物（AMPPD）構建化學發(fā)光體。CLEIA 通常用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和 AP 作為化學發(fā)光催化酶，對應的發(fā)光底物分別是魯米諾及其衍生物和 AMPPD，而以 AP-AMPPD 發(fā)光體系最為靈敏^［28］。AMPPD 反應速度快、靈敏度高，發(fā)光能夠在極短時間內(nèi)給出較為精確的結果，敏感性和特異性均優(yōu)于 ELSIA 方法^［29］。

在本研究中，我們也得到一些啟發(fā)，一是行業(yè)缺乏針對 ASFV 抗原的特異性抗體的標準品，希望行業(yè)能提供一個通用的豬源 p72 抗體標準品，以方便對所有 p72 抗體定量檢測進行校正，就像 COVID-19 一樣，形成統(tǒng)一標準^［30］。二是目前行業(yè)內(nèi)對 ASFV 已經(jīng)普遍使用核酸提取儀和開展定量檢測，相比早期手動提取核酸進行普通 PCR 檢測，大大提高了效率，節(jié)省了人力，若采用全自動的化學發(fā)光檢測，將更有助于提高病原抗體檢測的效率。三是化學發(fā)光根據(jù)所選儀器不同可進行360測試或480測試這樣的超高通量檢測，也可以根據(jù)標記物的不同，同時分析同一樣本中不同指標的含量^［31］，這是傳統(tǒng)的 ELISA 方法所不具備的優(yōu)勢。

4 結 論

本研究將雙抗原夾心的 CLEIA 技術用于 ASFV p72 蛋白抗體的檢測，建立的 CLEIA 方法較 ELISA 方法具有更好的敏感性，檢測流程的自動化，檢測性能更具優(yōu)勢，且具有實現(xiàn)抗體的絕對定量檢測的潛力，為更靈敏、精確的檢測豬 ASFV 抗體水平提供了重要的技術支撐，也具有非常好的市場應用前景。

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（編輯 白永平）