非洲豬瘟病毒H108R蛋白的制備及其免疫原性評(píng)價(jià)

摘 要： 本研究旨在制備ASFV H108R蛋白，通過(guò)免疫小鼠評(píng)價(jià)該蛋白的免疫原性，為該蛋白作為疫苗候選抗原的研究提供理論依據(jù)。利用生物信息學(xué)工具分析H108R蛋白的結(jié)構(gòu)及基本理化性質(zhì)，選擇編碼蛋白33～108 AA的基因序列串聯(lián)融合到原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳親和層析純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。免疫小鼠利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟活化的CD4+和CD8⁺T淋巴細(xì)胞，分離小鼠血清測(cè)定特異性抗體滴度，利用Western blot和IFA鑒定多克隆抗體的特異性。并用試劑盒檢測(cè)血清中細(xì)胞因子含量，將血清與ASFV-GFP病毒孵育評(píng)估抗體是否能抑制病毒的復(fù)制。生物信息學(xué)分析表明H108R蛋白為親水性蛋白質(zhì)，有跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)中存在較多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot顯示IPTG誘導(dǎo)后，成功表達(dá)純化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)小鼠脾臟T細(xì)胞的活化，刺激機(jī)體產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子。免疫制備的多克隆抗體效價(jià)為1∶128 000，能與ASFV-GFP病毒特異性結(jié)合，與病毒孵育后能明顯抑制病毒的復(fù)制。本研究成功表達(dá)制備了ASFV H108R蛋白，免疫能夠誘導(dǎo)脾臟T淋巴細(xì)胞活化，引起細(xì)胞因子水平升高，制備的多克隆抗體能夠明顯抑制病毒的復(fù)制，具有較好的免疫原性，為深入研究H108R蛋白的生物學(xué)功能及疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟病毒（ASFV）；H108R蛋白；多克隆抗體；免疫原性

中圖分類號(hào)：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1344-11

收稿日期：2024-04-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1801302-3）；甘肅省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（23YFNA0011）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（lzujbky-2022-ct02）；蘭州市青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目（2023-QN-3）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CAAS-ZDRW202409）；國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-35）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（23ZDKA0002）

作者簡(jiǎn)介：張 越（1995-），男，甘肅華池人，博士生，主要從事動(dòng)物疫病防控與檢疫研究，E-mail： 1969962334@qq.com

*通信作者：鄭海學(xué)，主要從事動(dòng)物傳染病與流行病學(xué)研究，E-mail： zhenghaixue@caas.cn

Preparation and Immunogenicity Evaluation of African Swine Fever Virus H108R Protein

ZHANG" Yue1， RU" Yi1， HAO" Rongzeng1， YANG" Rui2， ZHAO" Longhe1， LI" Yajun2，

YANG" Yang1， ZHANG" Rong2， JIANG Chenghui 2， ZHENG" Haixue^1*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention，College of

Veterinary Medicine， Lanzhou University，Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000， China; 2.China

Agricultural Vet. Bio. Science and Technology Co.， Ltd.， Lanzhou 730046， China）

Abstract：" The aim of this study was to prepare the ASFV H108R protein， to evaluate the immunogenicity of the protein by immunization of mice and to provide a theoretical basis for the investigation of this protein as a candidate antigen for vaccines. The structure and basic physicochemical properties of the H108R protein were analyzed using bioinformatics tools， and the gene sequence encoding the protein 33-108 AA was selected for tandem fusion into a prokaryotic expression vector， transformed and induced to express by IPTG， and the target protein purified by nickel affinity chromatography. Immunized mice were examined by flow cytometry to detect spleen-activated CD4+and CD8+T lymphocytes， mouse serum was isolated to determine specific antibody titres， and the specificity of polyclonal antibodies was determined by Western blot and IFA. The cytokine content of the serum was determined using the kit， and the serum was incubated with ASFV-GFP virus to assess whether the antibody could inhibit virus replication. Bioinformatics analysis showed that the H108R protein is a hydrophilic protein with a transmembrane region， no signal peptide， and more α-helices exist in the protein’s ditertiary structure. SDS-PAGE and Western blot showed that the purified H108R protein was successfully expressed after IPTG induction. The protein was able to induce activation of mouse splenic T cells and stimulate the body to produce higher levels of cytokines after immunization of mice. The immunized polyclonal antibody with a potency of 1：128 000 was able to specifically bind to the ASFV-GFP virus and significantly inhibit viral replication after incubation with the virus. In this study， ASFV H108R protein was successfully expressed and produced， and immunization was able to induce activation of splenic T lymphocytes leading to an increase in cytokine levels， and the produced polyclonal antibody was able to inhibit virus replication， which had a good immunogenicity， and it lays a foundation for the in-depth study of the biological function of H108R protein and the research of vaccine.

Keywords： African swine fever virus （ASFV）; H108R protein; polyclonal antibodies; immunogenicity

*Corresponding author：" ZHENG Haixue， E-mail： zhenghaixue@caas.cn

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的，可使感染的家豬和野豬出現(xiàn)急性出血性熱、高致死性的一種傳染病^［1］。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（The World Organisation for Animal Health，WOAH）列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染疫病^［2］，在我國(guó)被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為一類動(dòng)物疫病。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織報(bào)道，2022—2024年全球因非洲豬瘟導(dǎo)致超過(guò)138萬(wàn)只豬死亡^［3］，是全球養(yǎng)豬業(yè)的“頭號(hào)殺手”。非洲豬瘟早在1921年就被發(fā)現(xiàn)，但由于病毒結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、對(duì)病毒和宿主相互作用以及免疫保護(hù)機(jī)制的認(rèn)知有限，目前仍然沒(méi)有有效的商品化疫苗和藥物可用。

ASFV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是已知唯一的蟲(chóng)媒DNA病毒^［4］。病毒的基因組大小170～194 kb，編碼超過(guò)150種蛋白質(zhì)，許多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能仍然未知^［5］。ASFV在自然界長(zhǎng)期傳播，造成病毒遺傳多樣。目前根據(jù)B646L基因（p72）C-末端的核苷酸序列差異和紅細(xì)胞吸附差異可將非洲豬瘟病毒分為24個(gè)基因型和8個(gè)血清型^［6-7］。在我國(guó)主要是基因Ⅱ型毒株^［8］，但據(jù)報(bào)道已經(jīng)出現(xiàn)Ⅰ型^［9］以及Ⅰ型和Ⅱ型的重組強(qiáng)毒株^［10］。

非洲豬瘟病毒粒子呈正二十面體結(jié)構(gòu)，具有5層膜結(jié)構(gòu)，每個(gè)病毒顆粒包含3萬(wàn)多個(gè)蛋白質(zhì)亞基，病毒粒子直徑約為260 nm^［11］。其中非洲豬瘟病毒H108R蛋白位于病毒內(nèi)囊膜上^［12］，是一種重要的毒力基因，在ASFV-Georgia2007（ASFV-G）基因組敲除該基因后能夠影響病毒在巨噬細(xì)胞的復(fù)制，免疫后能抵抗親本毒株的攻擊^［13］，但對(duì)該蛋白的參與的生物學(xué)功能及機(jī)制研究并不全面，尤其是尚未對(duì)該蛋白是否可作為非洲豬瘟亞單位疫苗候選抗原的潛力進(jìn)行評(píng)估。本研究通過(guò)對(duì)ASFV H108R蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)合成原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)，并免疫小鼠從體液和細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)其免疫原性，旨在為H108R蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究及疫苗候選抗原開(kāi)發(fā)提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器

BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和TMB顯色液均購(gòu)自索萊寶生物公司；小鼠抗6×His 標(biāo)簽單克隆抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG （H+L）和HRP-山羊抗豬IgG （H+L）、DAPI染色液和山羊抗小鼠IgG Hamp;L （Alexa Fluor 594）均購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；HisTrap HP親和層析柱購(gòu)自Cytiva 公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自賽默飛科技公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-4 的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自達(dá)科為生物公司；FITC anti-mouse CD3e、APC anti-mouse CD4和PE anti-mouse CD8a流式抗體均購(gòu)自聯(lián)科生物；刺激成熟的豬骨髓巨噬細(xì)胞（BMDC）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；ASFV-GFP重組病毒（在ASFV-CN-GS/2018毒株基因重組插入GFP標(biāo)簽）和ASFV豬陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室提供。

主要儀器：AKTA pure150蛋白純化儀（Cytiva 公司）；美國(guó)激光共聚焦顯微鏡（萊卡公司）；熒光倒置顯微鏡（賽默飛公司）。

1.2 H108R蛋白生物信息學(xué)分析

NCBI下載非洲豬瘟HLJ/2018毒株H108R蛋白的氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)：QBH90605.1），利用Protparam^［14］（https：//web.expasy.org/protparam/）在線進(jìn)行分析H108R蛋白質(zhì)的氨基酸組成及理化性質(zhì)；使用TMHMM-2.0^［15］（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析H108R蛋白的跨膜區(qū)；利用SignalP 5.0^［16］（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）分析H108R蛋白是否存在信號(hào)肽；通過(guò)ExPASY網(wǎng)站的SOPMA^［17］（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）預(yù)測(cè)H108R蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用I-TASSER（https：//zhanggroup.org/I-TASSER/）^［18］在線預(yù)測(cè)H108R蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 重組表達(dá)載體的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)H108R蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果，去掉蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)部分，以（G3S）3柔性Linker將H108R的33～108位的氨基酸重復(fù)串聯(lián)連接設(shè)計(jì)基因序列，選擇EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)由金唯智生物公司合成并插入到pET-28a原核表達(dá)載體中。合成的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序正確后命名為pET-H108R。

1.4 重組 pH108R 蛋白的表達(dá)及可溶性分析

將pET-H108R原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單菌落轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基（含20 μg·mL^-1卡那霉素）中，37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液OD600 nm吸光值約0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol·L^-1 IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)置未加IPTG的對(duì)照組。轉(zhuǎn)移至17 ℃搖床培養(yǎng)15 h，收集菌體并用PBS溶液重懸，超聲破碎后，高速離心收集上清和沉淀，進(jìn)行 SDS-PAGE確定蛋白質(zhì)表達(dá)形式。并以小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體作為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)。

1.5 重組pH108R 蛋白的純化及特異性鑒定

收集超聲破碎后的菌體沉淀，利用含8 mol·L^-1尿素的PBS溶液重懸后，置于4 ℃搖床震蕩過(guò)夜。12 000 r·min^-1高速離心收集上清，利用PBS稀釋至含2 mol·L^-1尿素后用于上樣。將HisTrap HP親和層析柱連接到AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，將稀釋后的上清樣品通過(guò)親和層析柱后，用含2 mol·L^-1尿素100 mmol·L^-1咪唑的PBS緩沖液去除雜蛋白，用含2 mol·L^-1尿素500 mmol·L^-1咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白。目標(biāo)蛋白質(zhì)通過(guò)PBS緩沖液透析后，用于后續(xù)試驗(yàn)。并以ASFV豬陽(yáng)性血清（稀釋比1∶600）作為一抗，HRP-山羊抗豬IgG （H+L）為二抗（稀釋比1∶5 000）進(jìn)行Western blot鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)。

1.6 小鼠免疫及血清抗體效價(jià)檢測(cè)

取10只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)均分為兩組，將100 μg H108R重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化后，在背部皮下免疫，同時(shí)對(duì)照組用等體積PBS與弗氏佐劑乳化后免疫。間隔14 d后將H108R與弗氏不完全佐劑1∶1乳化進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在14 d后摘眼球采血，分離血清，用于抗體的反應(yīng)原性及效價(jià)檢測(cè)。將H108R 稀釋蛋白至1 mg·L^-1，100 μL·孔^-1加入酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜包被。PBST洗滌后，用5% 脫脂奶粉封閉2 h。再用PBST洗滌后，將制備的多克隆抗體從1∶1 000開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。每個(gè)梯度重復(fù)3孔，每孔加入100 μL，室溫結(jié)合1.5 h。洗滌5次，加入 HRP-山羊抗小鼠IgG （H+L）（1∶5 000稀釋），室溫結(jié)合1 h。洗滌6次，加入TMB顯色液顯色后，加入50 μL終止液（2 mol·L^-1 H2SO4）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD450 nm吸光度值。

1.7 多克隆抗體的特異性檢測(cè)

1.7.1 Western blot檢測(cè)

將純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)H108R蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以H108R多克隆抗體為一抗（稀釋比例為1∶800），HRP-山羊抗豬IgG （H+L）作為二抗（稀釋比1∶10 000）進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

1.7.2 細(xì)胞免疫熒光（IFA）試驗(yàn)

將豬骨髓巨噬細(xì)胞鋪于專用的共聚焦小皿，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜，接種ASFV-GFP毒株48 h后，棄去上清。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS輕柔洗滌3次，用PBS配制3%的BSA封閉2 h。PBS 輕柔洗滌，以小鼠 H108R多克隆抗體作為一抗，加小鼠陰性血清作為對(duì)照組（1∶200稀釋），加PBS作為Mock組，在37 ℃，孵育1 h。以山羊抗小鼠IgG Hamp;L （Alexa Fluor 594）作為二抗（1∶500稀釋），避光室溫孵育30 min。再加入DAPI染色液約2 min后，用PBS 洗滌干凈后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 脾組織T細(xì)胞活化水平檢測(cè)

分離加強(qiáng)免疫兩周小鼠的脾臟，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入5 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，利用2 mL注射器的活塞溫和研磨。將研磨后的細(xì)胞懸液利用70 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾到新的50 mL離心管中，將細(xì)胞離心后棄去上清液，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞靜置3 min后，加入5 mL PBS并離心。用PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液使用FITC anti-mouse CD3e、 APC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8a標(biāo)記，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用FlowJo軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.9 細(xì)胞因子檢測(cè)

分離加強(qiáng)免疫兩周的小鼠血清，利用細(xì)胞因子ELISA定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量，并利用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的差異性。

1.10 H108R多克隆抗體抑制ASFV-GFP病毒復(fù)制

在將1×105 BMDC細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將小鼠 H108R多克隆抗體和陰性血清（PBS組）56 ℃ 30 min滅活，分別進(jìn)行倍比稀釋到1∶64，同時(shí)設(shè)置RPMI 1640培養(yǎng)基（Mock組）分別與等體積的ASFV-GFP病毒在37 ℃孵育3 h，棄掉細(xì)胞上清液，將病毒孵育混合物加入到細(xì)胞中進(jìn)行孵育2 h，用含5% FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基替換上清液。并繼續(xù)在37 ℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中還有綠色熒光的斑點(diǎn)差異。選擇1∶64稀釋的血清孵育后感染的細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，通過(guò)絕對(duì)定量PCR^［19］測(cè)定樣品的病毒拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 H108R生物信息學(xué)分析

H108R蛋白含原子總數(shù)為1 772，分子式組成C580H880N140O169S3，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量為12.614 ku。其氨基酸組成見(jiàn)表1，帶負(fù)電荷的殘基數(shù)（Asp+Glu）為11， 帶正電荷的殘基數(shù)（Arg+Lys）為7，等電點(diǎn)pI 5.20；總評(píng)價(jià)親水性平均疏水性Grand average of hydropathicity （GRAVY）為-0.218，判斷H108R為親水性蛋白?？缒^(qū)和信號(hào)肽及親疏水性分析結(jié)果顯示，H108R蛋白全長(zhǎng) 108個(gè)氨基酸，其中10—32 AA 為跨膜區(qū)（圖1），不存在信號(hào)肽序列（圖2），對(duì)其氨基酸序列親疏水性預(yù)測(cè)前，1—35 AA疏水性較強(qiáng)（圖3）。SOPMA軟件在線預(yù)測(cè)H108R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要含有α-螺旋（Ｈh）、延伸鏈（Ｅe）及無(wú)規(guī)則卷曲（Ｃc），占比分別為37.96％、17.59％和36.11%（圖4）。根據(jù)I-TASSER預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，H108R蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)存在較多的α-螺旋（圖5），與二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。本研究我們選取編碼H108R 33～108 AA 的基因序列串聯(lián)融合，選擇酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI連接到pET-28a載體中，獲得pET-H108R。

2.2 重組質(zhì)粒pET-H108R的鑒定

重組質(zhì)粒pET-H108R經(jīng)雙酶切后，利用瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)與預(yù)期設(shè)計(jì)基因大小相一致的目標(biāo)條帶（見(jiàn)圖6）。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相一致，成功構(gòu)建了含有H108R基因序列的重組質(zhì)粒。

2.3 重組蛋白H108R的表達(dá)鑒定

pET-H108R 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE 和Western blot鑒定結(jié)果顯示，在27 ku左右有一條明顯的條帶，重組H108R 蛋白主要是在超聲破碎后的菌體沉淀中（見(jiàn)圖7），以包涵體形式存在。

2.4 重組H108R蛋白純化及鑒定

通過(guò)利用8 mol·L^-1尿素變性后的菌體沉淀進(jìn)行純化，成功獲得重組蛋白 H108R。利用ASFV陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot鑒定，也在與預(yù)期目標(biāo)蛋白大小處出現(xiàn)特異性條帶（見(jiàn)圖8），表明成功純化后得到ASFV H108R蛋白。

2.5 H108R蛋白多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定

分離加強(qiáng)免疫后2周的血清，通過(guò)間接 ELISA 測(cè)定血清抗體效價(jià)。結(jié)果顯示（圖9）其抗體效價(jià)可達(dá)1∶128 000。

2.6 H108R多克隆抗體的特異性鑒定

以多克隆抗體為一抗，經(jīng)Western blot鑒定（圖10A），多克隆抗體能識(shí)別純化的H108R蛋白質(zhì)，說(shuō)明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。以多克隆抗體為一抗，經(jīng)間接免疫熒光鑒定ASFV-GFP感染的細(xì)胞。與陰性血清相比（圖10B），在H108R多克隆抗體組中出現(xiàn)特異性紅色熒光。即制備的抗H108R多克隆抗體與ASFV-GFP病毒感染的細(xì)胞具有良好的反應(yīng)性。

2.7 H108R蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞的變化，結(jié)果顯示（圖11）H108R蛋白免疫后脾臟產(chǎn)生CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例都明顯升高，表明該蛋白能夠誘導(dǎo)脾臟T淋巴細(xì)胞的活化。

2.8 H108R蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子

通過(guò)檢測(cè)外周血的細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示（圖12）H108R蛋白免疫能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子。

2.9 H108R多克隆抗體抑制病毒的復(fù)制

H108R多克隆抗體與ASFV-GFP病毒孵育后，在48 h后明顯觀察到病毒復(fù)制形成的熒光病毒的斑點(diǎn)數(shù)減少，對(duì)應(yīng)的病毒基因拷貝數(shù)也更低，結(jié)果表明（圖13）H108R多克隆抗體可以抑制病毒的復(fù)制。

3 討 論

ASF是WOAH法定報(bào)告的豬烈性傳染病，急性致死率可達(dá)100%^［2］。2018年8月，ASF首次傳入我國(guó)并迅速擴(kuò)散，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無(wú)可用的疫苗和藥物防控，主要依賴嚴(yán)格的生物防控以及早期診斷及感染豬群撲殺策略^［20］。非洲豬瘟已在我國(guó)流行了6年多，由早期的Ⅱ型強(qiáng)毒株流行為主^［8］到田間出現(xiàn)基因Ⅰ型毒株^［9］，并與基因Ⅱ型毒株發(fā)生混合感染，其后出現(xiàn)Ⅰ/Ⅱ型重組毒株^［10］，更為嚴(yán)峻的是，利用基因Ⅱ型毒株制備的減毒疫苗不能對(duì)重組毒株提供交叉保護(hù)，這對(duì)國(guó)內(nèi)疫病的防控帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)^［21-22］。

ASFV一種細(xì)胞質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒，基因組龐大，編碼超過(guò)150種蛋白質(zhì)，其中結(jié)構(gòu)蛋白超過(guò)50種，但大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能并不清楚^［5］。目前已經(jīng)有多種非洲豬瘟蛋白質(zhì)利用原核系統(tǒng)表達(dá)，如p72、p30、p54、CD2v等結(jié)構(gòu)蛋白可用于非洲豬瘟血清學(xué)診斷和相關(guān)疫苗的研究^［23-25］。H018R蛋白又名J5R是一種位于病毒內(nèi)膜的蛋白^［26］，在ASFV-G毒株的基因組中刪除H108R基因后，病毒的毒力降低，并能夠?qū)τH本毒株的攻擊產(chǎn)生免疫性保護(hù)，是一個(gè)重要的毒力基因，但對(duì)該蛋白質(zhì)在病毒參與的生物學(xué)具體過(guò)程和機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以及能否作為亞單位疫苗候選抗原的潛力也需要評(píng)估。

本文利用生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)HLJ/18毒株H108R蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。我們選取親水性好的區(qū)域（33～108 AA），串聯(lián)后合成質(zhì)粒并利用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)后pH108R蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，可能是由于原核表達(dá)量高，蛋白質(zhì)不能有效正確折疊，以及抗原串聯(lián)的形式增加了蛋白質(zhì)可溶形式表達(dá)的難度。在本研究中原核表達(dá)產(chǎn)量較高，利用尿素變性再?gòu)?fù)性后能獲得大量的可溶性蛋白質(zhì)，且具有較好的抗原反應(yīng)性。但與真核系統(tǒng)相比缺少蛋白質(zhì)翻譯后修飾，后續(xù)也可選擇利用真核系統(tǒng)表達(dá)來(lái)提高蛋白質(zhì)的可溶性^［27］。將H108R蛋白免疫小鼠后，制備的多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶128 000。免疫后能夠刺激小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例升高，產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子，將抗體稀釋到1∶64與ASFV-GFP病毒孵育仍能明顯抑制病毒復(fù)制，本研究表明了H108R蛋白具有良好的免疫原性，具有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。這也為該蛋白質(zhì)參與的病毒生物學(xué)功能研究，以及在疫苗抗原研究方面提供良好的生物材料支持。

4 結(jié) 論

本研究成功制備了非洲豬瘟 H108R蛋白，免疫小鼠能夠誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞的活化，刺激產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子，制備的H108R多克隆抗體能夠抑制ASFV-GFP病毒的復(fù)制，具有較好的免疫原性。

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（編輯 白永平）