HE基因受體結(jié)合域變異對牛冠狀病毒感染的影響

摘 要： 為研究HE基因受體結(jié)合域變異對牛冠狀病毒（BCoV）感染的影響，構(gòu)建了pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428重組質(zhì)粒。三種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HCT-8細(xì)胞，然后感染NX-2021-B2-HE424分離株通過RT-qPCR檢測病毒mRNA在吸附、內(nèi)化和復(fù)制階段的表達(dá)水平以及通過TCID50檢測胞內(nèi)和胞外的病毒滴度。結(jié)果顯示，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428三種重組質(zhì)粒均能在HCT-8細(xì)胞中表達(dá)。與pEGFP-HE424相比，HE基因受體結(jié)合域缺失或插入不影響病毒的吸附、內(nèi)化、復(fù)制及胞內(nèi)病毒滴度；HE基因受體結(jié)合域缺失降低了BCoV胞外病毒滴度；HE基因受體結(jié)合域插入不影響B(tài)CoV胞外病毒滴度。本研究通過構(gòu)建僅受體結(jié)合域變異的三種HE基因的重組質(zhì)粒在HCT-8細(xì)胞上探究了其對牛冠狀病毒感染的影響，為研究牛冠狀病毒的感染機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞： 牛冠狀病毒；HE基因；受體結(jié)合域變異；病毒感染

中圖分類號(hào)：

S852.659.6"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1336-08

收稿日期：2024-05-07

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021BEF03005）；青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022-NK-118）；西藏自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（XZ202101YD0001C）

作者簡介：姜慧華（1997-），女，壯族，廣西貴港人，碩士生，主要從事分子病原學(xué)與免疫研究，E-mail：3462350283@qq.com

*通信作者：郭抗抗，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn

Effect of HE Gene Receptor Binding Domain Variation on Bovine Coronavirus Infection

JIANG" Huihua， ZHAO" Long， GUO" Kangkang^*

（College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China）

Abstract： To study the effect of HE gene receptor binding domain variation on bovine coronavirus （BCoV） infection， recombinant plasmids pEGFP-HE420， pEGFP-HE424 and pEGFP-HE428 were constructed. Three recombinant plasmids were transfected into HCT-8 cells respectively and then infected with NX-2021-B2-HE424 to detect viral mRNA expression levels at adsorption， internalization and replication stages by RT-qPCR， and to detect viral intracellular and extracellular titers by TCID50. The results showed that pEGFP-HE420， pEGFP-HE424 and pEGFP-HE428 could be expressed in HCT-8 cells. Compared with pEGFP-HE424， deletion or insertion of HE gene receptor binding domain did not affect the adsorption， internalization， replication and intracellular virus titer. Deletion of HE gene receptor binding domain decreased extracellular titers of BCoV. HE gene receptor binding domain insertion did not affect the BCoV extracellular virus titer. In this study， three recombinant plasmids of HE genes with only receptor binding domain variation was constructed to explore its effect on bovine coronavirus infection in HCT-8 cells， providing data support for the study of the infection mechanism of BCoV.

Keywords： bovine coronavirus; HE gene; receptor binding domain vibration; viral infection

*Corresponding author：" GUO Kangkang， E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）是造成犢牛腹瀉、成年牛冬季痢疾以及各年齡段牛呼吸道疾病的重要病原體，給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失^［1］。BCoV屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬A系，單股正鏈RNA病毒，其基因組長度為27 kb～32 kb，是目前已知的最大的RNA病毒^［2］。根據(jù)致病特點(diǎn)，可將BCoV分為腸道型和呼吸道型^［3］。

BCoV有5種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白、跨膜蛋白、纖突蛋白（spike protein，S蛋白）、小衣殼蛋白和血凝素酯酶蛋白（hemagglutinin-esterase，HE蛋白）^［4］。冠狀病毒屬成員的結(jié)構(gòu)蛋白大多數(shù)由除HE蛋白外的其他4種構(gòu)成，但β冠狀病毒屬A系成員都具有HE蛋白。HE蛋白單體具有雙模塊結(jié)構(gòu)，主要由兩端的膜近端結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域以及中間的凝集素結(jié)構(gòu)域構(gòu)成^［5-6］。凝集素結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《具M(jìn)入和釋放有重要作用^［7］。凝集素結(jié)構(gòu)域具有血凝活性和受體結(jié)合活性，可以凝集小鼠紅細(xì)胞，也可以結(jié)合宿主細(xì)胞上的唾液酸受體，因此HE蛋白被視作除S蛋白外的第二個(gè)起始感染的第二附著蛋白^［8-9］。酯酶結(jié)構(gòu)域具有乙酰酯酶活性，可以破壞受體的酶活性，移除細(xì)胞表面受體，利于病毒的釋放，從而更快地生成子代病毒^［7］。

凝集素結(jié)構(gòu)域凝集素結(jié)構(gòu)域由6個(gè)表面環(huán)組成，R1、R2、R3、R4和RBS枝接在凝集素結(jié)構(gòu)域的β-三明治核心上，另一個(gè)環(huán)則來自酯酶結(jié)構(gòu)域，受體結(jié)合域就位于R3環(huán)上^［10］。424 aa的HE基因其R3環(huán)為207～219位氨基酸，“FLSN”為其受體結(jié)合域，420 aa的HE基因在208～211位缺失了“NGKF”，428 aa的HE基因在212～215位插入了“KATV”（圖1）。目前研究報(bào)道的BCoV毒株其HE蛋白由424個(gè)氨基酸編碼^［11-12］，但近年來發(fā)現(xiàn)HE基因受體結(jié)合域發(fā)生了缺失或插入，這使得HE蛋白由420或428個(gè)氨基酸編碼。2020年，中國報(bào)道了一種新的BCoV變體，在其HE基因中插入了12個(gè)核苷酸，導(dǎo)致HE基因的受體結(jié)合域增加了4個(gè)氨基酸，即“KATV”^［13］。美國2022年發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道了BCoV的HE基因受體結(jié)合域“KATV”的插入以及“NGKF”的缺失，但試驗(yàn)表明HE蛋白仍然具有酯酶活性以及受體結(jié)合能力^［14］。

本實(shí)驗(yàn)室在寧夏回族自治區(qū)某養(yǎng)牛場的鼻拭子樣本中檢測到BCoV，通過蝕斑純化分離純化得到BCoV分離株。經(jīng)全基因組測序發(fā)現(xiàn)，其中兩株BCoV的HE基因的受體結(jié)合域也發(fā)生了如上所述的變異，即以NX-2021-B2-HE424為對照，NX-2021-B1-HE420的HE基因受體結(jié)合域發(fā)生了“NGKF”的缺失，NX-2021-B3-HE428的HE基因受體結(jié)合域發(fā)生了“KATV”的插入。HE基因受體結(jié)合域變異對病毒感染性的影響在BCoV中尚未見報(bào)道。因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的NX-2021-B2-HE424的HE基因序列及受體結(jié)合域發(fā)生的變異，分別構(gòu)建了pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428重組質(zhì)粒，并將三種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HCT-8細(xì)胞然后感染病毒以探究HE基因受體結(jié)合域變異對病毒吸附、內(nèi)化、復(fù)制和釋放過程的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、質(zhì)粒

BCoV毒株NX-2021-B1-HE420、NX-2021-B2-HE424和NX-2021-B3-HE428分離自2021年寧夏地區(qū)發(fā)生腹瀉牛的鼻拭子樣本；HCT-8細(xì)胞、真核表達(dá)載體pEGFP-N1由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

DNA Marker，艾科瑞公司產(chǎn)品; 2×Prime STAR Max DNA Polymerase、限制性核酸內(nèi)切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，TaKaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、TurboFect transfection reagent，賽默飛公司產(chǎn)品；RIPA強(qiáng)裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，Biosharp公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白Marker（10～180 ku），Dining公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）、GAPDH Antibody， ImmunoWay公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)凝膠電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)上、下游引物，并在合適位置加入酶切位點(diǎn)，送西安擎科生物公司合成。內(nèi)參GAPDH基因（GenBank登錄號(hào)：NM_002046.7），N基因（GenBank登錄號(hào)：NW711287.1）。引物序列見表1。

1.4 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

將培養(yǎng)至24 h的病毒液NX-2021-B1-HE420和NX-2021-B2-HE424分別收集0.2 mL至離心管中，采用Trizol法提取總RNA，立即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。HE-F和HE-R為上下游引物擴(kuò)增HE420和HE424基因全長；利用HE-F、HE-R、Lig-HE-F、Lig-HE-R引物進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增HE428基因全長。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，對陽性產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將真核表達(dá)載體pEGFP-N1 和“1.4”中的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳后再次膠回收純化。利用T4 DNA連接酶將回收片段與線性化的pEGFP-N1載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定。將陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒送至西安擎科生物公司測序。

1.6 重組質(zhì)粒表達(dá)的Western blot鑒定

HCT-8細(xì)胞鋪至12孔板中，待細(xì)胞密度生長至60%～70%，用Turbofect分別將重組質(zhì)粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428轉(zhuǎn)染至HCT-8細(xì)胞，同時(shí)以pEGFP-N1為陰性對照，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞樣品冰上裂解后并煮沸制備蛋白樣。進(jìn)行100 g·L^-1 SDS-PAGE電泳；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜；用50 g·L^-1脫脂奶粉室溫膜孵育3 h；用GFP標(biāo)簽抗體（1∶8 000）及鼠抗GAPDH抗體（1∶12 000）為一抗分別孵育1 h；用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶12 000）為二抗室溫孵育1 h；用ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯色，每次孵育結(jié)束用TBST清洗10 min，清洗3遍。

1.7 檢測HE基因受體結(jié)合域變異對病毒感染的影響

1.7.1 檢測HE基因受體結(jié)合域變異對病毒吸附的影響

1.7.1.1 用TurboFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1、pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428至HCT-8細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，感染NX-2021-B2-HE424（MOI=1）。

1.7.1.2 置于4 ℃吸附1 h，然后用預(yù)冷的PBS清洗未吸附的病毒粒子，加入Trizol收取細(xì)胞樣品用RT-qPCR檢測病毒mRNA的表達(dá)水平。

1.7.1.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系為2×Fast qPCR Master Mixture（Green） 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，dd H2O 7 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為機(jī)器默認(rèn)。N基因和GAPDH基因引物見表1。

1.7.2 檢測HE基因受體結(jié)合域變異對病毒內(nèi)化的影響

轉(zhuǎn)染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，4 ℃吸附1 h，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃培養(yǎng)1 h，用檸檬酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和PBS交替清洗3次，加入Trizol收取樣品用RT-qPCR檢測病毒mRNA的表達(dá)水平。

1.7.3 檢測HE基因受體結(jié)合域變異對病毒復(fù)制的影響

轉(zhuǎn)染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，37 ℃吸附1 h，然后用PBS清洗，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃培養(yǎng)7 h，PBS清洗3次，加入Trizol收取樣品檢測病毒mRNA的表達(dá)水平。

1.7.4 檢測HE基因受體結(jié)合域變異對病毒釋放的影響

1.7.4.1 轉(zhuǎn)染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，37 ℃吸附1 h，然后用PBS清洗，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至24 h。

收集24 h的培養(yǎng)液，然后PBS清洗細(xì)胞3次，用胰酶消化后加入與收集的培養(yǎng)液等體積的2% FBS DMEM吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞混合液。培養(yǎng)液和細(xì)胞混合液經(jīng)一次凍融后，離心除去細(xì)胞碎片，分別收集胞外上清和胞內(nèi)上清。將胞外上清和胞內(nèi)上清按梯度稀釋接至96孔板，測定其TCID50。

1.7.4.2 通過間接免疫熒光法測定TCID50，即4%多聚甲醛孵育細(xì)胞10 min；

1% Triton X-100孵育10 min；50 g·L^-1脫脂奶粉室溫孵育1 h；用自制的兔源BCoV N蛋白多克隆抗體（1∶100）為一抗室溫孵育1 h；Coralite488-conjugated goat anti-rabbit IgG（H+L）（1∶800）為二抗室溫避光孵育1 h；用DAPI進(jìn)行染核10 min，每次孵育完成后均用PBS清洗3遍。置于倒置熒光顯微鏡下記錄發(fā)熒光孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

由于本研究中的NX-2021-B3-HE428毒株其HE基因序列除受體結(jié)合域不同于NX-2021-B1-HE420和NX-2021-B2-HE424，還存在個(gè)別氨基酸突變，不能以之為模板，故采用融合PCR法擴(kuò)增本研究的HE428基因全長。用普通PCR法成功擴(kuò)增出基因HE428的前段630 bp和后段647 bp（圖2A）。用普通PCR法及融合PCR法成功擴(kuò)增出約1 263 bp的HE420全長、約1 275 bp的HE424全長和約1 287 bp的HE428全長（圖2B）。對重組質(zhì)粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428以及空質(zhì)粒pEGFP-N1進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒均出現(xiàn)了符合預(yù)期大小的目的條帶和線性化載體（圖2C）。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序驗(yàn)證，顯示插入序列除受體結(jié)合域有所變異外其余序列與NX-2021-B2-HE424分離株的HE基因序列一致，無堿基突變，說明重組質(zhì)粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428構(gòu)建成功。

2.2 HE基因表達(dá)的Western blot結(jié)果

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-8細(xì)胞24 h后，用Western blot檢測HE基因的表達(dá)，如圖3所示，重組質(zhì)粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428均在約75 ku處出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的條帶，表明HE420、HE424和HE428蛋白在HCT-8細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.3 HE基因受體結(jié)合域變異對病毒吸附的影響

與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入對病毒吸附不產(chǎn)生影響（圖4）。

2.4 HE基因受體結(jié)合域變異對病毒內(nèi)化的影響

如圖5所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428對病毒的mRNA表達(dá)水平顯著下降（Plt;0.01）；pEGFP-HE424對病毒的mRNA表達(dá)水平極顯著下降（Plt;0.001）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入不影響病毒內(nèi)化。

2.5 HE基因受體結(jié)合域變異對病毒復(fù)制的影響

與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424、pEGFP-HE428對病毒的mRNA表達(dá)水平無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。這表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入對病毒復(fù)制不產(chǎn)生影響（圖6）。

2.6 HE基因受體結(jié)合域變異對病毒釋放的影響

結(jié)果如圖7a所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424、pEGFP-HE428對病毒的胞內(nèi)病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-"" HE428組的胞內(nèi)病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）。表明了HE基因受體結(jié)合域缺失或插入對BCoV胞內(nèi)病毒滴度不產(chǎn)生影響。

結(jié)果如圖7b所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420對病毒的胞外病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）；pEGFP-HE424和pEGFP-HE428對病毒的胞外病毒滴度有顯著差異（Plt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420組的胞外病毒滴度有極顯著差異（Plt;0.01），表明HE基因受體結(jié)合域缺失可降低胞外病毒滴度；pEGFP-HE428組的胞外病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05），表明HE基因受體結(jié)合域插入不影響胞外病毒滴度。

3 討 論

BCoV主要感染牛，但也存在跨物種感染的可能性^［15-17］，還與人類冠狀病毒密切相關(guān)。從一名兒童腹瀉樣本中分離得到的冠狀病毒其S基因和HE基因與BCoV的核苷酸同源性高達(dá)99%，甚至比人類冠狀病毒OC43的相關(guān)性更密切，因此推測人類樣本中分離的冠狀病毒可能來源于BCoV^［18］，提示BCoV對人類公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

重組事件對病毒基因組擴(kuò)大和病毒進(jìn)化具有重要意義^［19］，不少研究表明BCoV的HE基因常常發(fā)生重組事件，可能對病毒感染和混合感染產(chǎn)生影響，導(dǎo)致更復(fù)雜的冠狀病毒譜系出現(xiàn)^［20-22］。Keha等^［11］認(rèn)為HE基因重組BCoV毒株已經(jīng)在中國奶牛中廣泛傳播，因?yàn)閺臓倥８篂a糞便樣本中分離到10株HE基因重組BCoV毒株，且分離的樣本地理距離較遠(yuǎn)。

盡管HE基因在BCoV發(fā)病機(jī)制中的確切作用尚不清楚，但在其他冠狀病毒中研究表明HE基因會(huì)影響病毒感染。人冠狀病毒OC43中，HE蛋白缺失或HE蛋白乙酰酯酶活性失活會(huì)抑制感染性病毒顆粒的產(chǎn)生^［23］。Bakkers等^［10］報(bào)道人冠狀病毒OC43為適應(yīng)在人呼吸道中的復(fù)制，HE蛋白凝集素結(jié)構(gòu)域突變的漸進(jìn)累積導(dǎo)致病毒喪失了受體結(jié)合功能，從而導(dǎo)致病毒粒子對基于唾液聚糖的簇狀受體決定因子的受體破壞活性降低。因此，我們猜測BCoV HE基因受體結(jié)合域變異不僅影響病毒的吸附，也可能影響病毒釋放。盡管我們在NX-2021-B2-HE424分離株上的吸附試驗(yàn)結(jié)果表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入都不影響病毒的吸附，但在試驗(yàn)中無法排除S蛋白作為病毒感染起始階段的第一個(gè)病毒黏附蛋白的作用，因此仍需更深入的研究確定HE基因受體結(jié)合域變異在病毒吸附中的作用。本研究中僅采用NX-2021-B2-HE424分離株（HE基因氨基酸長度為424）進(jìn)行研究仍不足夠，需以最早報(bào)道的Mebus毒株（HE基因氨基酸長度為424）作為標(biāo)準(zhǔn)株從而使結(jié)論更準(zhǔn)確和更具有說服力。

牛冠狀病毒HE蛋白包含凝集素結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域兩個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)Σ《具M(jìn)入和釋放有重要的作用^［7］。蛋白結(jié)構(gòu)軟件預(yù)測表明HE基因受體結(jié)合域的插入和缺失導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但并未使其喪失受體結(jié)合功能和酯酶活性，而這種變異是否引起其功能和活性上的差異目前未有研究能具體探清^［14］。本研究構(gòu)建了三種僅受體結(jié)合域變異的HE基因真核表達(dá)載體，測定吸附、內(nèi)化、復(fù)制和釋放階段的病毒mRNA表達(dá)水平和病毒滴度來初步研究HE基因受體結(jié)合域變異對病毒感染的影響，結(jié)果表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入對病毒吸附、復(fù)制、內(nèi)化以及胞內(nèi)病毒滴度不產(chǎn)生影響，但HE基因受體結(jié)合域缺失降低了胞外病毒滴度。本研究初步探索到HE基因受體結(jié)合域缺失對胞外病毒滴度產(chǎn)生影響，為BCoV的感染機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

通過構(gòu)建三種僅受體結(jié)合域變異的牛冠狀病毒HE基因真核表達(dá)載體，測定吸附、內(nèi)化、復(fù)制和釋放階段的病毒mRNA表達(dá)水平和病毒滴度，表明HE基因受體結(jié)合域缺失或插入對病毒吸附、復(fù)制、內(nèi)化以及胞內(nèi)病毒滴度不產(chǎn)生影響，但HE基因受體結(jié)合域缺失降低了胞外病毒滴度。

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（編輯 白永平）