丁酸鈉對幼鼠回腸發(fā)育、炎癥因子及物理屏障功能的調(diào)控作用

摘 要： 旨在利用細(xì)胞試驗確定丁酸鈉對人小腸上皮細(xì)胞（FHS 74 int cells）中細(xì)胞因子和緊密連接蛋白表達(dá)調(diào)控的最適濃度，并進(jìn)一步探討在該濃度范圍下丁酸鈉對幼鼠回腸發(fā)育、炎癥因子及物理屏障功能的影響。細(xì)胞試驗選取FHs 74 int細(xì)胞，探究不同濃度丁酸鈉對細(xì)胞活力、炎癥因子及緊密連接蛋白表達(dá)水平的影響。動物試驗選取剛出生的C57BL/6J幼鼠，共32只，隨機分為4組，每組8只，分別為對照組（0.9%生理鹽水）、SB20組（20 mg·kg^－1 BW丁酸鈉）、SB350組（350 mg·kg^－1 BW丁酸鈉）和SB1000組（1 000 mg·kg^－1 BW丁酸鈉），連續(xù)給藥30 d后對幼鼠體重、血常規(guī)以及回腸組織學(xué)形態(tài)、回腸細(xì)胞因子和緊密連接蛋白基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。在細(xì)胞試驗中，12.5、25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著提高了細(xì)胞閉鎖蛋白（occludin）的基因和蛋白表達(dá)量，25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著上調(diào)了細(xì)胞GPR109A的基因表達(dá)量以及閉鎖小帶蛋白（ZO-1）的基因和蛋白表達(dá)量。在動物試驗中各組幼鼠的體增重以及血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異。通過回腸病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，350 mg·kg^－1 BW丁酸鈉顯著提高了幼鼠的回腸絨毛高度，降低了隱窩深度，同時提高了回腸抗炎因子IL-4、IL-10的mRNA相對表達(dá)量，降低促炎因子IL-18的mRNA相對表達(dá)量；1 000 mg·kg^－1 BW丁酸鈉顯著提高了回腸絨毛高度/隱窩深度的比值（Plt;0.05），降低隱窩深度和促炎因子TNF-α的mRNA相對表達(dá)量。綜上，25 mmol·L^－1的丁酸鈉能夠促進(jìn)FHS 74 int細(xì)胞occludin和ZO-1以及GPR109A的基因表達(dá)，維護(hù)屏障功能；350 mg·kg^－1 BW的丁酸鈉能夠促進(jìn)幼鼠回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育，提高回腸絨毛高度，降低隱窩深度，同時調(diào)節(jié)腸道炎癥因子和緊密連接蛋白的基因表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 丁酸鈉；FHS 74 int細(xì)胞；腸道屏障；緊密連接蛋白

中圖分類號：

S815.7"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1278-12

收稿日期：2024-04-16

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1600104）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS36）

作者簡介：張 萱（2000-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士生，主要從事奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估和營養(yǎng)功能評價研究，E-mail： 18647394594@163.com

*通信作者：孟 璐，主要從事奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估和營養(yǎng)功能評價研究，E-mail： menglu@caas.cn

The Regulatory Effects of Sodium Butyrate on Ileal Development， Inflammatory Factors and Physical Barrier Function" in Young Mice

ZHANG" Xuan "YANG" Xue "LI" Xinke "ZHENG" Nan "MENG" Lu^1，2*

（1.Key Laboratory of Quality amp; Safety Control for Dairy Products of China Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Beijing 100193，" China;

2.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment

for Dairy Products of China Ministry of Agriculture and Rural Affairs （Beijing）， Institute of Animal

Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Beijing 100193，" China）

Abstract：" The purpose of this study was to determine the optimal concentration of sodium butyrate in regulating the expression of cytokines and tight junction proteins in human intestinal epithelial cells （FHS 74 int cells） by cell experiments， and to further explore the effects of sodium butyrate on ileum development， inflammatory factors and physical barrier function in young rats. In cell experiments， FHS 74 int cells were selected to explore the effects of different concentrations of sodium butyrate on cell viability， expression levels of inflammatory factors and tight junction protein. In animal experiment， 32 newborn C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups， each with 8 mice， namely the control group （0.9% normal saline）， SB20 group （20 mg·kg^－1 BW sodium butyrate）， SB350 group （350 mg·kg^－1 BW sodium butyrate）， and SB1000 group （1 000 mg·kg^－1 BW sodium butyrate）. After continuous administration for 30 days， body weight， blood routine， ileal histological morphology， ileal cytokine and tight junction protein gene expression levels of mice were detected. In vitro， 12.5 and 25 mmol·L^－1 sodium butyrate increased the gene and protein expression of occludin in cells， and 25 mmol·L^－1 sodium butyrate significantly increased the gene expression of GPR109A and the gene and protein expression of ZO-1. In animal experiment， there were no significant differences in body weight and blood routine indexes among the groups of mice. Through ileal pathology， it was found that 350 mg·kg^－1 BW sodium butyrate significantly increased the ileal villus height but reduce the crypt depth of young mice （Plt;0.05）. At the same time， it increased the relative mRNA expression of ileal anti-inflammatory factors IL-4 and IL-10， while decreasing the relative mRNA expression of pro-inflammatory factor IL-18. 1 000 mg·kg^－1 BW sodium butyrate significantly increased the ratio of villus height to crypt depth of ileum （Plt;0.05）， decreased the crpyt depth and the relative mRNA expression of pro-inflammatory factor TNF-α. In conclusion， 25 mmol·L^－1 sodium butyrate can promote the gene expression of occludin， ZO-1， and GPR109A in FHS 74 int cells， maintaining barrier function. Sodium butyrate at 350 mg·kg^－1 BW can promote the development of the ileum morphological structure of mice， increase villus height， reduce crypt depth， and simultaneously regulate the gene expression of intestinal inflammatory factors and tight junction proteins.

Keywords： sodium butyrate; FHS 74 int cells; intestinal barrier; tight junction protein

*Corresponding author：MENG Lu， E-mail： menglu@caas.cn

丁酸是一種可由腸道微生物發(fā)酵蔬菜、谷物等富含纖維素食物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，在維護(hù)腸道健康方面具有重要作用；而丁酸鈉是丁酸補充劑最常見的一種形式^［1-2］。丁酸作為腸道微生物發(fā)酵纖維素的主要代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)能夠借助轉(zhuǎn)運蛋白被腸道黏膜吸收，為機體提供能量并調(diào)控機體的生理代謝。一項對小鼠腸道健康的益生菌補充研究中發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）作為產(chǎn)丁酸的主要菌株，在和唾液乳桿菌（Ligilactobacillus salivarius）聯(lián)合使用后可以提高小鼠日增重，促進(jìn)黏蛋白的分泌，增加結(jié)腸黏膜厚度及糞便中的丁酸濃度，并顯著降低腸道中致病菌的相對豐度，從而改善腸道微生態(tài)平衡^［3］。在飼料中添加丁酸鈉可以顯著緩解仔豬因斷奶引起的空腸絨毛損傷，維持腸道形態(tài)完整性，同時能夠降低腸道pH，促進(jìn)有益菌增殖，抑制病原微生物生長，對于腸道發(fā)育和形態(tài)完整性具有一定的益處^［4］。G蛋白偶聯(lián)受體109A（G protein-coupled receptor 109A，GPR109A）是一種在腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)的受體，丁酸可以通過GPR109A發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白的表達(dá)，促進(jìn)免疫球蛋白A的分泌從而減少腸道炎癥反應(yīng)。IL-4、IL-10和IL-18是與腸道免疫屏障功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子。其中IL-4和IL-10是兩種重要的抗炎細(xì)胞因子，能夠參與腸道免疫反應(yīng)，抑制促炎因子的產(chǎn)生，維持腸上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。而IL-18是一種促炎細(xì)胞因子，通常與IL-1β協(xié)同作用參與炎癥過程的調(diào)節(jié)，IL-18的表達(dá)增加與多種炎癥性疾病有關(guān)，包括炎癥性腸病等^［5-7］。

剛出生的幼齡動物機體發(fā)育不成熟，與成年動物相比處在生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，面臨多種內(nèi)外因素的挑戰(zhàn)。幼齡動物的腸道敏感且發(fā)育尚不成熟，使其極易出現(xiàn)消化吸收功能紊亂、腸道屏障受損以及免疫功能低下的問題，不僅會制約現(xiàn)階段的生長發(fā)育，甚至?xí)Τ赡旰蟮慕】禒顟B(tài)產(chǎn)生持續(xù)的不利影響^［8-9］?；啬c作為小腸的遠(yuǎn)端部分，不僅在消化過程中發(fā)揮一定作用，而且還具有維護(hù)腸道免疫的重要功能。此外，回腸還涉及脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵過程，一些與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的基因在回腸中具有較高表達(dá)的水平^［10］。目前丁酸鈉已被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)，其對動物健康的積極作用已有較多的數(shù)據(jù)試驗支撐，早期的營養(yǎng)干預(yù)對于幼齡動物的腸道健康具有重要意義。因此，本試驗的主要目的是：探究不同濃度的丁酸鈉對人小腸上皮細(xì)胞（FHS 74 int cells）的細(xì)胞因子和緊密連接蛋白表達(dá)調(diào)控的最適濃度范圍，同時進(jìn)一步探討丁酸鈉對幼鼠生長性能、回腸組織學(xué)形態(tài)、炎癥因子和物理屏障發(fā)育的影響，旨在為丁酸鈉在幼齡動物上的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動物及試劑

FHS 74 int細(xì)胞（人小腸上皮細(xì)胞），來自實驗室保存樣本。從液氮罐中復(fù)蘇FHS 74 int細(xì)胞，采用完全培養(yǎng)基（Hybri-Care medium+10%胎牛血清+30 ng·mL^－1表皮生長因子+1%雙抗）于37 ℃、5%CO2條件下復(fù)蘇細(xì)胞。

SPF級C57BL/6J哺乳期母鼠及1日齡小鼠（體重為1.5 g±0.1 g），性別不限，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于北京百奧思科生物技術(shù)公司動物試驗平臺提供的屏障系統(tǒng)內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22 ℃±1 ℃，環(huán)境濕度為50%±5%，每天12 h光照和12 h黑暗交替，飼養(yǎng)過程嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)管理規(guī)章。無菌清潔級生長繁殖飼料（SPF-F01-003）購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。動物試驗之前已通過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物試驗福利倫理審查，倫理號為IAS2022-108。

丁酸鈉（Sigma，V900464-5G）、碳酸氫鈉（Sigma，31437）；TRIzol Reagent（Invitrogen，15596018）；Hybri-Care Medium（ATCC，46-X）；胎牛血清FBS（Gibco，10099-141）；4%多聚甲醛固定液（碧云天，P0099-500 mL、0.25%胰酶消化液（碧云天，C0203-100 mL）；表皮生長因子EGF（上海生工，C600219-0010）；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液（索萊寶，P7630）；RNase Free dH2O（索萊寶，BDHL0729）；Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊，Q712-02）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（諾唯贊，R323-01）；牛血清白蛋白BSA（賽維爾，GC305010）、一抗Anti-Occludin Rabbit pAb（賽維爾，GB111401-100）和Anti-ZO1 tight junction protein Rabbit pAb（賽維爾，GB111402-100）、二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（賽維爾，GB23303）、DAPI染色試劑（賽維爾，GC305010）。

1.2 試驗儀器

CFX96型熒光定量PCR儀（美國伯樂）；Nano-Drop 2100核酸蛋白檢測儀、酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛）；正制光學(xué)顯微鏡（日本尼康）；低溫高速離心機（艾本德）；HF-3800型血液分析儀（康宇）。

1.3 試驗設(shè)計及樣品采集

1.3.1 細(xì)胞試驗

待細(xì)胞傳代培養(yǎng)至形成單層完全覆蓋培養(yǎng)板底部后，用胰酶消化，稀釋后培養(yǎng)板中每個孔加入約2 000～5 000個細(xì)胞，再次長滿至2/3時，吸去舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基配置的丁酸鈉溶液（濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mmol·L^－1）處理24 h，利用CCK-8法測定細(xì)胞活力，在不影響細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上選擇適宜的處理濃度。在適宜丁酸鈉濃度下處理FHS 74 int細(xì)胞，收集細(xì)胞樣品并進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.3.2 動物試驗

試驗選用8只SPF級C57BL/6J健康孕鼠，取孕鼠自然分娩24 h內(nèi)的32只新生幼鼠進(jìn)行試驗，性別不限，將32只C57BL/6J幼鼠隨機分為4組，避免母鼠喂養(yǎng)帶來的差異。在前期細(xì)胞試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計1個對照組和3個丁酸鈉給藥組，4個試驗組分別為對照組（0.9%生理鹽水）、SB20濃度組（20 mg·kg^－1 BW丁酸鈉）、SB350組（350 mg·kg^－1 BW丁酸鈉）、SB1000組（1 000 mg·kg^－1 BW丁酸鈉），每組8只，各組初始平均體重為1 g±0.2 g，幼鼠進(jìn)行丁酸鈉口服給藥，斷奶前給藥體積為10 μL，斷奶后給藥體積為20 μL，給藥期為30 d，同時正常由母鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，在第17天進(jìn)行斷奶，斷奶后自由采食飲水（各組飼料營養(yǎng)成分一致），每3 d記錄一次體重。在第30天眼眶采血后用脊椎脫臼法處死幼鼠，用無菌手術(shù)鉗和剪刀從腹部剪開，分離出回腸組織，用于后期相關(guān)指標(biāo)測定?；啬c樣品分為兩部分，一部分固定用于結(jié)構(gòu)觀察，另一部分存儲在-80 ℃，用于分子試驗。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 FHS 74 int細(xì)胞基因表達(dá)水平

利用TRIzol法提取細(xì)胞的RNA，測定RNA濃度，并記錄OD260/280的比值，確保比值在1.8～2.1之間。將提取得到的RNA用無菌無酶水稀釋至500 ng·mL^－1，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)程序為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷卻至-4 ℃。利用Nano-Drop 2100測定cDNA濃度后，用無菌無酶水稀釋至80 ng·μL^－1。提前設(shè)計的引物序列如表1，按照反應(yīng)體系加入96孔板后，2 500 r·min^-1低速離心。實時熒光定量PCR儀中反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s后60 ℃ 30 s循環(huán)40次、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min。目的基因的相對表達(dá)量按照公式2^-ΔΔCt計算，用內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行相對表達(dá)量分析，按照統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行分析。

1.4.2 FHS 74 int細(xì)胞免疫熒光染色

將細(xì)胞培養(yǎng)在預(yù)先放置有蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿80%～90%，更換無血清配置的不同濃度丁酸鈉溶液，處理24 h后用PBS清洗，再用4%多聚甲醛固定，加入100 μL的0.3% Triton X-100室溫孵育5 min，以5%牛血清白蛋白封閉2 h。用PBS清洗，于爬片上滴加1∶200比例稀釋的一抗50 μL，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌含細(xì)胞的爬片后，加1∶500稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 50 μL，濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育1 h后，再以PBS洗滌，加入DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇3個不同視野，并運用ImageJ軟件對3張圖片進(jìn)行量化分析。

1.4.3 幼鼠體增重

每3 d記錄一次小鼠的體重，統(tǒng)計小鼠的初始體重、解剖前終體重及體增重。

1.4.4 幼鼠回腸絨毛隱窩形態(tài)

將幼鼠回腸中段去掉食糜后取1 cm在4%多聚甲醛中固定24 h，包埋成組織蠟塊。將組織蠟塊切成3 μm厚度后烘干。用蘇木素、伊紅進(jìn)行染色，脫水封片，室溫保存。使用顯微鏡觀察HE染色切片，測量3個視野下5根絨毛的絨毛高度、隱窩深度并計算絨隱比。

1.4.5 幼鼠回腸細(xì)胞因子基因表達(dá)水平

與細(xì)胞RNA提取及檢測方法相同，引物序列如表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2019整理，使用SPSS statistics 20軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計及單因素方差分析，分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異。采用Graphpad prism 9.1進(jìn)行作圖，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。*Plt;0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞試驗

2.1.1 丁酸鈉作用濃度篩選

首先設(shè)置9個濃度梯度的丁酸鈉培養(yǎng)FHS 74 int細(xì)胞24 h，利用CCK8法測定細(xì)胞活力。由圖1可以看出丁酸鈉濃度在0～25 mmol·L^－1時對FHS 74 int的細(xì)胞活力沒有顯著影響，無細(xì)胞毒性。從50 mmol·L^－1丁酸鈉開始顯著降低了細(xì)胞活力（Plt;0.05），因此后續(xù)丁酸鈉對細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平的影響選取4個濃度梯度0、6.25、12.5、25 mmol·L^－1進(jìn)行探究。

2.1.2 丁酸鈉對FHS 74 int細(xì)胞因子表達(dá)的影響

圖2對細(xì)胞炎癥因子的基因表達(dá)水平進(jìn)行了探究?？梢钥闯鲈诩?xì)胞層面，不同濃度丁酸鈉對于FHS 74 int細(xì)胞抗炎因子IL-10和促炎因子IL-18的mRNA表達(dá)沒有顯著影響（Pgt;0.05）。可能是由于細(xì)胞未經(jīng)藥物誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，正常細(xì)胞用丁酸鈉處理后對于炎癥因子表達(dá)沒有顯著影響。

2.1.3 丁酸鈉對FHS 74 int細(xì)胞緊密連接蛋白和GPR受體表達(dá)的影響

圖3為丁酸鈉處理后對FHS 74 int細(xì)胞緊密連接蛋白的基因和蛋白表達(dá)水平的影響。圖3A對細(xì)胞occludin、ZO-1以及GPR109A的mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明12.5、25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著提高了細(xì)胞occludin的基因表達(dá)量，6.25、12.5、25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著提高了細(xì)胞ZO-1的基因表達(dá)量。圖3B和3C對細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了免疫熒光染色，結(jié)果顯示12.5、25 mmol·L^－1丁酸鈉處理顯著提高了細(xì)胞occludin蛋白熒光的表達(dá)量，25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著提高了ZO-1蛋白的熒光表達(dá)量。

2.2 動物試驗

2.2.1 幼鼠體增重變化

為評估不同濃度丁酸鈉對幼鼠體重的影響，試驗期間每3 d對幼鼠稱重并記錄，最后一次體重于解剖當(dāng)天測定。結(jié)果如表2所示，各組小鼠體重在試驗初始無顯著差異（Pgt;0.05）；試驗結(jié)束后，丁酸鈉處理的三組幼鼠體重及體增重與對照組的差異并不顯著（Pgt;0.05）。

2.2.2 幼鼠血常規(guī)指標(biāo)測定

如表3所示，利用血常規(guī)分析儀對幼鼠血液指標(biāo)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，四組幼鼠的白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)以及單核細(xì)胞數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.2.3 幼鼠回腸絨毛隱窩形態(tài)

通過圖4A回腸組織學(xué)切片可以觀察到完整的腸上皮和隱窩結(jié)構(gòu)，且腸絨毛和隱窩表面的單層柱狀細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰。圖4B比較了四組的回腸絨毛高度，結(jié)果顯示SB350組的絨毛高度顯著高于對照組（Plt;0.05），而SB20和SB1000組的回腸的絨毛高度與對照組相比沒有顯著差異（Pgt;0.05）。圖4C顯示了四組小鼠的回腸隱窩深度，可以看出SB350組和SB1000組回腸隱窩深度顯著低于對照組（Plt;0.05），而SB20組的隱窩深度與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05）。由圖4D可知口服不同濃度的丁酸鈉溶液對幼鼠回腸的絨毛高度和隱窩深度之比產(chǎn)生了一定的影響，SB350組和SB1000組的回腸絨隱比顯著高于對照組（Plt;0.05）。

2.2.4 幼鼠回腸免疫及物理屏障相關(guān)基因的相對表達(dá)量

由圖5可以觀察到，與對照組相比SB350組幼鼠回腸組織抗炎因子IL-4、IL-10的mRNA相對表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05），促炎因子IL-18的mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組（Plt;0.05）；SB1000組促炎因子TNF-α的相對表達(dá)量顯著低于對照組（Plt;0.05）。由圖5E和圖5F可以看出，與對照組相比，SB20組的回腸occludin的mRNA相對表達(dá)量顯著增加（Plt;0.05）；SB20組中回腸黏蛋白2（MUC2）的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組（Plt;0.05）。

3 討 論

3.1 丁酸鈉對FHS 74 int細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)的影響

FHS 74 int細(xì)胞是一株小腸上皮細(xì)胞系，常被用來研究病毒、寄生蟲感染及腸道炎癥等^［11-12］。腸上皮細(xì)胞能夠在腸道中建立一個選擇性的滲透屏障，支持營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和廢物的分泌，腸上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)量對于維持腸道屏障功能的完整性具有重要作用^［13］。Silveira等^［14］研究發(fā)現(xiàn)，在飲水中補充0.066 g·kg^－1丁酸鈉能夠提高潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)水平，減輕腸道炎癥。Li等^［15］通過小鼠和Caco-2細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉能夠逆轉(zhuǎn)由高尿酸引起的小鼠腸道MUC2、ZO-1、occludin的蛋白表達(dá)下降，保護(hù)腸道物理屏障。Chen等^［16］通過腸炎性小鼠模型發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠通過激活GPR109A促進(jìn)MUC2、occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平，降低腸黏膜通透性。Feng等^［17］研究發(fā)現(xiàn)，用150 ng·mL^－1的TNF-α處理Caco-2細(xì)胞后，添加1.5 mmol·L^－1的丁酸鈉能夠上調(diào)Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-3、occludin和ZO-1的基因表達(dá)水平，敲除GPR109A后抑制了丁酸鈉誘導(dǎo)的claudin-3的表達(dá)，表明丁酸鈉可能是通過結(jié)合GPR109A，促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)從而發(fā)揮腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究中，25 mmol·L^－1丁酸鈉對于FHS 74 int細(xì)胞免疫因子IL-10和IL-18的mRNA表達(dá)沒有顯著影響，可能是由于細(xì)胞未經(jīng)藥物誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，正常細(xì)胞用丁酸鈉處理后對于炎癥因子表達(dá)沒有顯著影響。但25 mmol·L^－1丁酸鈉顯著提高了occludin和ZO-1的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)量，提高了腸道緊密連接蛋白的表達(dá)水平，25 mmol·L^－1丁酸鈉處理后細(xì)胞GPR109A基因表達(dá)量提高，丁酸鈉能夠作為GPR109A的激動劑提高腸細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)^［18］。由于細(xì)胞試驗在藥物有效性和安全性評價等方面存在的局限，丁酸鈉是否能夠在小鼠體內(nèi)發(fā)揮提高緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1等基因表達(dá)，具體發(fā)揮的生理功能仍需要進(jìn)一步的探究。

3.2 丁酸鈉對幼鼠體增重及血常規(guī)指標(biāo)的影響

母鼠的乳汁中含有大量易消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子以及免疫因子，有助于幼鼠機體快速發(fā)育成熟，抵御外界細(xì)菌和病毒的侵?jǐn)_。小鼠斷奶時，其營養(yǎng)來源由液態(tài)易消化吸收的乳汁，瞬間轉(zhuǎn)變?yōu)楦晌镔|(zhì)日糧，容易降低小鼠對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率，造成生長緩慢或腹瀉的發(fā)生^［19］。目前對丁酸功能的研究主要集中在出生犢牛和斷奶仔豬等幼齡動物。王燕南^［20］研究發(fā)現(xiàn)，從犢牛2日齡開始飼喂添加2 g·L^－1三丁酸甘油酯的牛奶，對2～12周內(nèi)犢牛的日增重、飼料轉(zhuǎn)化率沒有顯著影響（Pgt;0.05）。同時于猛等^［21］研究發(fā)現(xiàn)，在健康的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬飼糧中添加0.5 kg·t^－1和1.5 kg·t^－1包被丁酸鈉，飼喂42 d后斷奶仔豬的日增重和日采食量與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05），與本研究相符。本試驗中，丁酸鈉口服給藥的小鼠體重和體增重與對照組相比，有高于對照組的趨勢但差異不顯著，表明丁酸鈉對幼鼠生長性能等表型的影響不明顯。血常規(guī)分析是常見的血液檢驗方法，能夠檢測出血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和分布情況，血常規(guī)指標(biāo)與動物機體的健康狀況和新陳代謝密切相關(guān)，在判斷疾病等方面能夠發(fā)揮重要作用^［22］。本試驗中各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)沒有顯著差異，表明在此濃度范圍內(nèi)飼喂不同濃度丁酸鈉對于幼鼠的正常生理代謝無不良影響。

3.3 丁酸鈉對幼鼠回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小腸絨毛主要由功能性吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞排列，而絨毛中含有干細(xì)胞和促增殖的細(xì)胞等，小腸絨毛不僅增加了小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，還起到過濾物質(zhì)的作用^［23］。完整健康的腸道屏障有利于幼鼠的健康生長，減少有害菌的定植，是促進(jìn)幼鼠機體生長的重要因素。當(dāng)腸道物理屏障受到損傷時，容易誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，影響生長發(fā)育。楊良輝和蔣澤菊^［24］探究了人工乳中添加20%丁酸鈉對3日齡新生仔豬小腸發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加丁酸鈉的人工乳飼喂顯著增加了仔豬的空腸和回腸的絨毛高度，促進(jìn)了仔豬的腸黏膜發(fā)育。朱榮生等^［25］在斷奶仔豬飼糧添加0.2%三丁酸甘油酯和0.15%核苷酸后，提高了仔豬的回腸絨毛高度，降低了回腸隱窩深度。Liu等^［26］在斷奶仔豬日糧中添加0.2%的丁酸鈉，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠提高十二指腸和回腸的絨毛高度，降低結(jié)腸和空腸的隱窩深度。本研究中，與對照組相比，口服350 mg·kg^－1 BW的丁酸鈉顯著提高了幼鼠的回腸絨毛高度，降低了回腸隱窩深度，提高了絨隱比，有利于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，這與前人的研究結(jié)果一致。

3.4 丁酸鈉對幼鼠回腸炎癥因子及屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響

腸道免疫屏障主要由免疫細(xì)胞及其分泌的抗體和細(xì)胞因子等組成，細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，它們在炎癥中的生理作用和病理作用越來越被人們所認(rèn)識^［27］。腸道免疫屏障的成熟和完善，對于幼齡動物的健康生長具有重要意義。IL-4等免疫因子在調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生、造血和炎癥以及效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)中具有重要作用^［28］。Xu等^［29］研究了口服丁酸鈉對新生仔豬腸道微生物群和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)口服150 mmol·L^－1丁酸鈉溶液降低了仔豬回腸IL-6、IL-8、IL-10的表達(dá)量，但對腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響較小，這表明口服丁酸鈉可能對新生仔豬的健康有一定的益處。常金金^［30］發(fā)現(xiàn)，給仔豬提供1 g·kg^－1體重的低聚半乳糖能夠提高回腸中丁酸的濃度，降低了8日齡仔豬炎癥因子IL-8、IFN-γ、IL-10、TGF-β基因的表達(dá)。陳想等^［31］研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶羔羊飼料中添加3 g·kg^－1的包被丁酸鈉后，可以顯著降低肝中的IL-2和IL-6的含量。Guo等^［32］研究表明，在奶牛生產(chǎn)中，添加過瘤胃三丁酸甘油酯后顯著降低了奶牛外周血淋巴細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6的相對表達(dá)量，表明三丁酸甘油酯可以通過減少淋巴細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來緩解奶牛熱應(yīng)激并提高其生產(chǎn)性能。相關(guān)研究顯示黏蛋白能夠與免疫細(xì)胞相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用^［33］。Occludin在腸道緊密連接中起著重要作用，是腸上皮細(xì)胞物理屏障的重要組成部分，因此一系列的腸道疾病與緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞密切相關(guān)^［34］。鄭成山等^［35］研究發(fā)現(xiàn)，300 mg·kg^－1丁酸鈉能夠緩解嘔吐毒素引起小鼠的腸道屏障損傷和腸道炎癥，提高空腸occludin蛋白的表達(dá)水平。腸道黏蛋白的異常表達(dá)，會導(dǎo)致腸道屏障破壞，使得有害物質(zhì)通過腸道進(jìn)入血液循環(huán)，引起免疫細(xì)胞的異?；罨?，誘發(fā)炎癥反應(yīng)并釋放炎癥介質(zhì)^［36］。在本研究中，口服350 mg·kg^－1 BW丁酸鈉顯著提高了幼鼠回腸組織抗炎因子IL-4、IL-10的mRNA相對表達(dá)量，顯著降低了促炎因子IL-18的mRNA相對表達(dá)量，并且能夠提高回腸occludin的mRNA表達(dá)水平，對于幼鼠的腸道物理和免疫屏障的完整性具有潛在的保護(hù)作用，但丁酸鈉對于幼鼠腸道屏障的長期影響，仍需要進(jìn)一步的深入探究。

4 結(jié) 論

根據(jù)本研究，在FHS 74 int細(xì)胞中，25 mmol·L^－1的丁酸鈉能夠促進(jìn)occludin和ZO-1以及GPR109A的表達(dá)；同時在幼鼠體內(nèi)350 mg·kg^－1 BW的丁酸鈉能夠促進(jìn)回腸絨毛隱窩的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育，調(diào)節(jié)回腸抗炎因子和促炎因子水平，促進(jìn)occludin蛋白的基因表達(dá)。丁酸鈉作為一種潛在的腸道健康調(diào)節(jié)劑，其在細(xì)胞層面的積極作用為后續(xù)的動物試驗和臨床研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。本研究為丁酸鈉在腸道健康領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的視角和科學(xué)依據(jù)，通過這些發(fā)現(xiàn)可以更好地將丁酸鈉的生物學(xué)效應(yīng)應(yīng)用于實際生產(chǎn)和生活中，尤其是在早期營養(yǎng)干預(yù)策略中，改善腸道健康和預(yù)防相關(guān)疾病，以維護(hù)和提升動物的健康狀態(tài)。

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（編輯 范子娟）