綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀核心基因和關(guān)鍵lncRNA的篩選與分析

摘 要： 旨在篩選與季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的核心基因和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。本研究選取2～3歲空懷的中國美利奴羊和湖羊母羊（乏情期、發(fā)情期和發(fā)情間期各3只），采集卵巢組織樣本，采用 RNA-seq 技術(shù)篩選差異表達(dá)的基因（differentially expressed genes， DEGs）和 lncRNAs，并通過 GO、KEGG 富集分析、PPI 分析及 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建鑒定與繁殖性能相關(guān)的核心基因和 lncRNAs。結(jié)果，構(gòu)建了6個(gè)不同生理狀態(tài)下的 RNA 文庫，篩選得到 1 495 個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes， DEGs）和 454 個(gè)差異表達(dá) lncRNAs，其中共性 DEGs 和 lncRNAs 分別為 313 個(gè)和 435 個(gè)，特有 DEGs 和 lncRNAs 分別為 1 182 個(gè)和 19 個(gè)。GO 和 KEGG 富集分析顯示，共性 DEGs 在細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期等方面顯著富集，而差異表達(dá)的 lncRNAs 靶基因富集于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及負(fù)調(diào)控 RNA 聚合酶 II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄等。特有 DEGs 在細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)中富集，lncRNAs 的靶基因集中于細(xì)胞間粘附和整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路等。通過 PPI 篩選出 19 個(gè)核心基因，主要富集在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞周期信號(hào)通路。聚類分析結(jié)果顯示，核心基因在乏情期表達(dá)量較高。ceRNA 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步揭示基因在細(xì)胞周期等信號(hào)通路的富集。RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)果與高通量測序一致。篩選出 19 個(gè)核心基因和 28 個(gè) lncRNAs，并發(fā)現(xiàn) 42 個(gè) lncRNA-miRNA-mRNA 靶向關(guān)系，為理解綿羊季節(jié)性繁殖的分子機(jī)制提供了潛在調(diào)控靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞： 綿羊；季節(jié)性發(fā)情；RNA-seq；核心基因；lncRNA

中圖分類號(hào)：

S826.3"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1264-14

收稿日期：2024-08-28

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目;兵團(tuán)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新工程（NCG202221）;中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目;省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)（2022CA002）

作者簡介：楊 楊（1989-），女，河南西平人，碩士，主要從事動(dòng)物分子遺傳與育種研究，E-mail：1010975408@qq.com

*通信作者：代 蓉，主要從事動(dòng)物分子遺傳與育種研究，E-mail：dairong1@163.com;周 平，主要從事動(dòng)物分子遺傳與育種研究，E-mail：zhpxqf@163.com

Screening and Analysis of Core Genes and Key lncRNAs for Seasonal Estrus Traits in Sheep

YANG" Yang1， LI" Liangyuan2， WAN" Pengcheng1， LU" Shouliang¹ ， LIU" Changbin¹ ，

YANG" Hua1， WANG" Limin1， DAI" Rong^1*， ZHOU" Ping^1*

（1.State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production，

Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi 832000，" China;

2.Institute of Traditional Chinese Medicine and Ethnical Medicine Resources， Guizhou

University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，" China）

Abstract：" The aim of this study was to screen core genes and long non-coding RNAs related to seasonal estrus. Ovarian tissue were collected from 2 to 3 years old， non-pregnant female Chinese Merino and Hu sheep （3 sheep per group， each in anestrus， estrus and interestrus）. RNA-seq technology was employed to identify differentially expressed genes and lncRNAs. GO and KEGG enrichment analyses， protein-protein interaction （PPI） network analysis and ceRNA network construction were performed to identify core genes and lncRNAs related to reproductive performance. RNA libraries for 6 distinct physiological states were constructed. There were 1 495 differentially expressed genes （DEGs） and 454 differentially expressed long non-coding RNAs （lncRNAs） be identified. Among these， 313 DEGs and 435 lncRNAs were common， while 1 182 DEGs and 19 lncRNAs were unique. GO and KEGG enrichment analyses revealed that common DEGs were significantly enriched in the processes related to cell division and the cell cycle， whereas the target genes of differentially expressed lncRNAs were enriched in intracellular signaling pathways and negative regulation of RNA polymerase II promoter transcription. Unique DEGs were primarily associated with the positive regulation of cell migration. The target genes of lncRNAs were enriched in cell adhesion and integrin-mediated signaling pathways. There were 19 core genes identified by protein-protein interaction network analysis， which were predominantly enriched in oocyte meiosis and cell cycle pathways. These core genes exhibited higher expression level during the anestrus phase than those in interestrus. Further analysis of the ceRNA network highlighted the enrichment of genes in cell cycle-related signaling pathways. RT-qPCR results were consisted with the RNA-seq results. A total of 19 core genes and 28 lncRNAs were identified， along with 42 lncRNA-miRNA-mRNA interactions， providing potential regulatory targets for understanding the molecular mechanisms of seasonal reproduction in sheep.

Keywords： sheep; seasonal estrus; RNA-seq; core gene; lncRNA

*Corresponding authors：" DAI Rong， E-mail： dairong1@163.com; ZHOU Ping， E-mail： E-mail：zhpxqf@163.com

綿羊繁殖效率是影響?zhàn)B羊效益的重要指標(biāo)，但大多數(shù)綿羊品種都表現(xiàn)出季節(jié)性發(fā)情特性^［1］，不僅影響了母羊的生產(chǎn)力，同時(shí)也顯著影響了規(guī)模化養(yǎng)羊和全年均衡供應(yīng)羔羊肉生產(chǎn)^［2-3］。因此，解析綿羊季節(jié)性發(fā)情機(jī)制對(duì)于理解和提高綿羊的繁殖力、實(shí)現(xiàn)常年自然發(fā)情至關(guān)重要。越來越多的研究已經(jīng)證明，BMPRIB^［4］、BMP15^［5］ 和 GDF9^［6］ 等是影響綿羊繁殖性能的主效基因，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為從多組學(xué)角度深入理解畜禽特性形成機(jī)制提供了技術(shù)思路，并取得了較多的研究成果^［7-8］。Yu 等^［9］利用全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究雞胚卵巢的退化，鑒定出 22 個(gè)與卵巢發(fā)育和退化相關(guān)的基因。Mao等^［10］從豬卵巢組織鑒定出 DEGs 585 個(gè)和差異表達(dá) lncRNA 398 個(gè)，利用功能注釋和富集分析發(fā)現(xiàn)它們與催乳素受體活性、誘導(dǎo)液泡形成的線粒體吞噬和減數(shù)分裂紡錘體有關(guān)，還發(fā)現(xiàn) lncRNA MSTRG.3902.1 的靶基因 NR5A2 參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、排卵和雌激素分泌。Miao和Qin^［11］比較了陶賽特和小尾寒羊的卵巢組織全轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá) lncRNAs 顯著富集在催產(chǎn)素信號(hào)通路。Wang等^［12］比較了小尾寒羊和新吉細(xì)毛羊的卵巢組織轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)mRNA HSD17B1和 lncRNA MSTRG 表達(dá)水平存在顯著差異；其中，小尾寒羊中HSD17B1 低水平表達(dá)，導(dǎo)致雌二醇、孕酮和促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌量降低，進(jìn)而減少顆粒細(xì)胞凋亡，維持卵泡發(fā)育；MSTRG.28645 過表達(dá)增加了黃體生成激素受體、卵泡刺激素受體和雌激素受體β的表達(dá)水平，從而影響了雌激素分泌。Feng等^［13］從高、低產(chǎn)羔數(shù)湖羊的卵巢組織鑒定出76個(gè)DEGs和5個(gè)差異表達(dá)lncRNA，顯著富集在免疫應(yīng)答、肌動(dòng)蛋白絲的切斷和吞噬作用等條目中，推測參與免疫應(yīng)答和溶酶體相關(guān)的基因與排卵過程調(diào)節(jié)相關(guān)。但從分子水平研究與綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的編碼基因和非編碼元件，特別是它們相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究報(bào)道仍然非常有限。

本研究以季節(jié)性發(fā)情的中國美利奴羊和常年發(fā)情的湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象^［14］，探討繁殖特性不同的綿羊品種中卵巢組織轉(zhuǎn)錄組與季節(jié)性發(fā)情的關(guān)系，挖掘核心基因，進(jìn)一步了解 lncRNA 在綿羊卵巢中的調(diào)控作用，提升對(duì)綿羊季節(jié)性發(fā)情調(diào)控機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

中國美利奴羊來自新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場，湖羊購買于新疆鑫寶牧業(yè)。根據(jù)生產(chǎn)記錄選擇體況和年齡（2～3歲）相近，生殖生理狀態(tài)相似的空懷母羊。所有羊只都在新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場同圈飼喂管理。試情公羊每天早晚兩次試情，確定母羊的發(fā)情狀態(tài)，記錄發(fā)情周期，以母羊第一次接受交配當(dāng)天為發(fā)情周期的第1天。在春季，連續(xù) 36 d（約2個(gè)發(fā)情周期）以上不發(fā)情確定進(jìn)入乏情期。每只羊均經(jīng)過大于兩個(gè)發(fā)情周期的觀察，以確保羊只健康且有正常繁殖能力。

1.2 試驗(yàn)試劑

OMEGA 的 RNA 提取試劑盒（R6734-01）、TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）、羅氏定量檢測試劑盒（0470751601）購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 卵巢樣品采集

羊發(fā)情階段的判定標(biāo)準(zhǔn)：乏情期是春季連續(xù)兩個(gè)情期無發(fā)情表現(xiàn)，發(fā)情期指發(fā)情周期的第1 天，發(fā)情間期是發(fā)情周期的第13天。嚴(yán)格按照發(fā)情周期時(shí)間點(diǎn)，屠宰后收集中國美利奴羊在春季乏情期（M_A，n=3）、秋季發(fā)情間期（MBD，n=3）、秋季發(fā)情期（MBE，n=3）以及湖羊春季發(fā)情間期（HAD，n=3）、春季發(fā)情期（HAE，n=3）和秋季發(fā)情期（HBE，n=3）的卵巢組織，液氮速凍，－80 ℃保存。

1.3.2 樣品總RNA提取及測序

采用 Trizol 法提取卵巢組織總 RNA。從同一分組 3只羊的卵巢樣本中各取3 μg 質(zhì)檢合格的 RNA，混合成 6個(gè)樣品池。分別從 6 個(gè)混池中取3 μg RNA 樣品生成測序文庫^［15］。卵巢 RNA 的質(zhì)量測定、文庫構(gòu)建和測序由北京康普森生物技術(shù)有限公司采用 Illumina HiSeq 2000 系統(tǒng)進(jìn)行。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

通過 FASTQ 對(duì)每個(gè)樣品池的原始數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行過濾，利用 HISAT2 軟件將質(zhì)控后的 clean reads 比對(duì)到綿羊的參考基因組（Oar_v3.1）上。使用 HTSeq-count（v0.6.0）對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因表達(dá)量進(jìn)行分析；利用 StringTie 軟件將 mapped reads 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，鑒定 lncRNA，包括篩選和潛在編碼能力分析，限定條件分別為：選擇長度≥200 bp，exon 個(gè)數(shù)≥2，F(xiàn)PKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）≥0.1 的轉(zhuǎn)錄本和利用 CPC、CNCI 和 CPAT 三種編碼潛能的分析方法評(píng)估 lncRNA^［16］；使用順式作用（lncRNA 鄰近100 kb）和反式作用（LncTar 軟件）兩種方法預(yù)測 lncRNA 的靶基因。采用 edgeR 方法對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，差異分組為：M_A vs. MBD、M_A vs. MBE、M_A vs. HAD、M_A vs. HAE、M_A vs. HBE，以log2FC≥2和P-adjustlt;0.05 為閾值，獲得 DEGs 和差異表達(dá) lncRNAs。使用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行富集分析，以 Plt;0.05 篩選出顯著的 Gene Ontology（GO）條目和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信號(hào)通路^［17］。使用STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/，交互閾值gt;0.4）預(yù)測并繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactions， PPI），利用 Cytoscape（v3.9.1）的 Cytohubba 插件^［18］最大聚集中心（Maximal Clique Centrality，MCC）算法篩選出 PPI 網(wǎng)絡(luò)中前 10 位作為 hub 基因，結(jié)合 MCODE 插件挖掘核心功能模塊及對(duì)應(yīng)基因^［19］。通過 MiRanda（http：www.miranda.orgl）預(yù)測 lncRNA-miRNA 和 miRNA-mRNA 的靶向關(guān)系，利用共同靶向 miRNA 的 lncRNA 和 mRNA 構(gòu)建出競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）關(guān)系對(duì)^［20-21］，以斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)大于 0.7、顯著性 Plt;0.05 為條件進(jìn)行篩選，使用 Cytoscape 軟件（v3. 9. 1）進(jìn)行結(jié)果可視化處理。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）

分別從各樣品池取 1.5 μg RNA。TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行 cDNA 第一鏈的合成，羅氏 Light Cycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行 RT-qPCR。擴(kuò)增體系（20 μL）：模板 cDNA 1.0 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各0.5 μL，LightCycler 480 SYBR Green I Master 10 μL，ddH2O 8 μL。在測序結(jié)果中隨機(jī)各挑選 3 個(gè) DEGs 進(jìn)行 RT-qPCR 驗(yàn)證，GAPDH 作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用 2^-ΔΔCt 法計(jì)算 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，使用Graphpad Prism 9 軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 RNA-seq 數(shù)據(jù)比對(duì)概況

raw datas 過濾后，共獲得 83.27 Gb 的 clean reads。6個(gè)文庫的 clean reads 與綿羊參考基因組比對(duì)（表2、圖1），mapping 率在 94.40%～95.93%，Q30 值均在 92.86% 以上。共鑒定到682個(gè) lncRNAs（圖1C）。

2.2 不同分組間差異表達(dá) lncRNAs 和 DEGs 的篩選

經(jīng)差異比對(duì)，在 M_A vs. MBD、M_A vs. MBE、M_A vs. HAD、M_A vs. HAE、M_A vs. HBE 五個(gè)差異分組中（表3）分別獲得 466、463、475、471 和 473 個(gè)差異表達(dá) lncRNAs，2 140、2 110、3 082、1 093 和 2 174 個(gè) DEGs。

2.3 不同差異分組中共有和特有的差異表達(dá) lncRNAs 和 DEGs

如圖 2 所示，在 5 個(gè)比較組中，綿羊乏情期與發(fā)情間期（M_A vs. HAD和M_A vs. MBD）共有的 DEGs 和差異表達(dá) lncRNAs 數(shù)量分別為 1 335 和 448 個(gè)，乏情期與發(fā)情期（M_A vs. HAE、M_A vs. MBE 和 M_A vs. HBE）共有的 DEGs 和差異表達(dá) lncRNAs 分別為 473 和 441 個(gè)。以上不同對(duì)比組的 DEGs 和差異表達(dá) lncRNAs 有 1 495 和 454 個(gè)，其中共有的是 313 和 435 個(gè)，特有 1 182 和 19 個(gè)。

2.4 RT-qPCR 驗(yàn)證分析

為驗(yàn)證 RNA-seq 結(jié)果的可靠性，隨機(jī)挑選3個(gè) DEGs 進(jìn)行 RT-qPCR 驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖 3），A2M、E114 和 FSHR 的 RT-qPCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表達(dá)趨勢相似，表明測序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可以用于后續(xù)研究。

2.5 DEGs 的功能富集分析

不同差異分組中共有的 DEGs 313個(gè)被富集到 87 個(gè) GO 條目和 28 個(gè) KEGG 通路，其中顯著富集在生物學(xué)過程（biological process，BP）的細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期，細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外隙，分子功能（molecular function，MF）主要是 ATP 結(jié)合和 DNA 結(jié)合等（圖 4A）。KEGG 富集分析顯示（圖 4B），顯著富集在中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成和細(xì)胞周期。特有的1 182個(gè)DEGs富集在212個(gè)GO條目和63個(gè)KEGG通路，顯著富集在 BP 的細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)和對(duì) ERK1 和 ERK2 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)，CC 主要包括膜的組成部分和質(zhì)膜，MF 主要有鈣離子結(jié)合和蛋白質(zhì)同源二聚化活性（圖 4C）。KEGG 顯著富"" 集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和 PI3K-Akt 信號(hào)通路等（圖 4D）。共有和特有的 DEGs 都顯著富集在 CC 的細(xì)胞外隙和胞外區(qū)，以及中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成通路。

2.6 不同差異分組中共有和特有差異 lncRNAs 靶基因的功能富集分析

共有的 435 個(gè)差異表達(dá) lncRNAs 靶基因預(yù)測有 659 個(gè)，富集到 73 個(gè) GO 條目和 15 個(gè) KEGG 通路，其中顯著富集在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì) RNA 聚合酶 II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控等 BP，CC 主要包括細(xì)胞膜和質(zhì)膜的組成部分，MF 主要集中在 ATP 結(jié)合和絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性等（圖 5A）。KEGG 顯著富集在磷脂酶 D 信號(hào)通路和 ECM 與受體的相互作用等信號(hào)通路（圖 5B）。特有的 19 個(gè) lncRNAs 的 76 個(gè)靶基因，主要富集在細(xì)"" 胞間粘附和整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路等 GO 條目（圖 5C），細(xì)胞粘附分子和 TNF 信號(hào)通路等 KEGG 通路（圖5D）。共有和特有 lncRNAs 的靶基因顯著富集于 GO 條目的細(xì)胞基質(zhì)粘附，KEGG 的 ECM 與受體的相互作用。

2.7 共有DEGs 和 lncRNAs 靶基因的 PPI 和核心基因分析

利用 STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)不同差異分組共有998 個(gè) DEGs 和 lncRNAs 的靶基因構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖 6A）。Cytohubba 計(jì)算蛋白質(zhì)相互作用最緊密的 10 個(gè) hub 基因（圖 6B），MCODE 篩選 PPI 中重要蛋白質(zhì)互作功能模塊，其中得分最高的核心功能模塊由 18 個(gè)基因組成（圖 6C、6D）。篩選出的 hub 基因與 MCODE 獲得的核心功能模塊內(nèi)基因重合，其中 BUB1B、TOP2A、BUB1、CDCA8、CCNB2、DLGAP5、KIF2C、KIF11、SPAG5 和 CDC20 可能是影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的核心基因。

2.8 特有DEGs 和 lncRNAs 靶基因的 PPI 和核心基因分析

對(duì)不同差異分組特有的 1 239 個(gè) DEGs 和 lncRNAs 的靶基因構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖 7A）。Cytohubba 篩選出綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的 10 個(gè) hub 基因（圖 7B），進(jìn)一步通過 MCODE 分析確定了 14 個(gè)組成核心功能模塊的基因（圖 7C、7D），重疊的基因包括 NCAPG、CDK1、AURKA、KIF20A、PRC1、TPX2、SMC2、ESPL1、ECT2 和 CDCA8，其中 CDCA8 同時(shí)被識(shí)別為共有 DEGs 和靶基因的核心基因。

2.9 核心基因的表達(dá)模式和染色體上的分布

共有和特有DEGs 和lncRNAs靶基因的 19 個(gè)核心基因分布在綿羊的 11 條染色體上，其中 1 號(hào)常染色體上分布最多（圖 8）。這些核心基因在 KEGG 通路中顯著富集于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞周期等通路。使用 TBtools 軟件對(duì) 19 個(gè)核心基因的 FPKM 表達(dá)量進(jìn)行聚類分析（圖9），發(fā)現(xiàn) MBD 和 MBE 首先聚到一起，再依次向 HAD、HAE、HBE 和 M_A 聚集，表明同一品種、同一季節(jié)的發(fā)情間期和發(fā)情期的基因表達(dá)模式更相似。核心基因在乏情期的表達(dá)水平高于發(fā)情間期和發(fā)情期。

2.10 ceRNA網(wǎng)絡(luò)與功能富集分析

從預(yù)測得到的 lncRNA-miRNA-mRNA 關(guān)系對(duì)中，以rgt;0.7和 Plt;0.05 為閾值，構(gòu)建了與綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)（圖 10）。該網(wǎng)絡(luò)由 42 條靶向相互作用組成，涉及 12 個(gè)核心基因、28 個(gè) lncRNA和 19 個(gè) miRNA。這 12 個(gè)核心基因與靶基因在細(xì)胞周期信號(hào)通路中顯著富集，GO 條目則顯著富集于 CC 的核糖核蛋白復(fù)合物，BP 的染色體凝聚的正向調(diào)節(jié)，MF 的 ATP 結(jié)合和微管結(jié)合等相關(guān)功能類別。

3 討 論

季節(jié)性繁殖是動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)^［22］，其形成的內(nèi)在機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。有研究表明，季節(jié)性發(fā)情與光周期調(diào)節(jié)通路密切相關(guān)，穩(wěn)定變化的光周期通過褪黑素既可以介導(dǎo)下丘腦甲狀腺激素調(diào)節(jié)下的促性腺激素釋放激素神經(jīng)元的變化，又可以介導(dǎo) Kisspeptin 等繁殖相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化^［23］。綿羊作為一種重要的家畜，大部分綿羊品種都表現(xiàn)出季節(jié)性發(fā)情特性^［24-25］，成為影響綿羊高效繁殖的主要限制性因素^［26］。因此，深入研究綿羊季節(jié)性繁殖的內(nèi)在機(jī)制對(duì)于提高綿羊繁殖效率具有重要意義。

本研究選取繁殖力有明顯差異的中國美利奴羊和湖羊，對(duì)其卵巢組織進(jìn)行 RNA-seq 測序。結(jié)合綿羊發(fā)情周期的二期分法，即黃體期和卵泡期，作為分析框架^［27］。選擇卵巢處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的乏情期與發(fā)情周期的發(fā)情間期進(jìn)行比較（M_A vs. HAD和M_A vs. MBD），篩選出影響排卵后黃體形成、發(fā)育至最大的 DEGs 1 335 個(gè)和差異表達(dá)lncRNAs 448個(gè)。乏情期與發(fā)情期（M_A vs. HAE、M_A vs. MBE 和 M_A vs. HBE）對(duì)比結(jié)果顯示，篩選出對(duì)黃體消失、卵泡發(fā)育和排卵過程有潛在影響的 DEGs 473 個(gè)和差異表達(dá) lncRNAs 441 個(gè)。結(jié)合韋恩圖分析，比較了綿羊乏情期與不同繁殖狀態(tài)，篩選出在黃體活動(dòng)和卵泡發(fā)育中共同發(fā)揮作用的 DEGs 313個(gè)，差異表達(dá) lncRNAs 435 個(gè)；單獨(dú)發(fā)揮作用的 DEGs 1 182 個(gè)，差異表達(dá) lncRNAs 19 個(gè)。

為了深入理解這些差異表達(dá)背后的生物學(xué)意義，進(jìn)一步開展了基因差異表達(dá)分析和富集分析等，篩選出了19個(gè)與繁殖力差異相關(guān)的核心基因，其中 7 個(gè)基因在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等繁殖相關(guān)信號(hào)通路中顯著富集（Plt;0.01）。核心基因中的CDC20 是同源染色體分離的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過影響減數(shù)分裂后期促進(jìn)復(fù)合物的活性，促進(jìn) Ⅱ 期姐妹染色體分離。研究發(fā)現(xiàn)，CDC20 蛋白表達(dá)量的降低會(huì)導(dǎo)致小鼠受精卵幾乎無法正常發(fā)育，失活會(huì)引起胚胎死亡^［28-29］。BUB1 作為紡錘體檢查點(diǎn)的平臺(tái)蛋白，可通過直接作用或形成復(fù)合物的形式，調(diào)控其他關(guān)鍵的紡錘體檢查點(diǎn)蛋白，如 CDC20 等，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程^［30］。Shabbir等^［31］對(duì)不同發(fā)育階段（包括 1、3和8 月齡）湖羊卵巢的 lncRNAs 和 mRNA 進(jìn)行全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn) CDC20 和 CDK1 是影響卵巢發(fā)育的重要基因。CDK1 是細(xì)胞周期 G2/M 期轉(zhuǎn)換和 DNA 損傷檢驗(yàn)點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)控因子^［32］。CDK1 激活啟動(dòng)AURKA 參與的有絲分裂過程，被激活的 AURKA 能夠與 CDK1 相互作用，促進(jìn)有絲分裂的進(jìn)行，并參與紡錘體形成和中心粒分裂^［33］。BUB1B 是紡錘體裝配檢驗(yàn)點(diǎn)的核心部件，能夠保證有絲分裂的精準(zhǔn)進(jìn)行^［34］。Wu 等 ^［35］發(fā)現(xiàn)，CCNB2 在 G1 期合成后表達(dá)量驟降，其缺失會(huì)導(dǎo)致 G2/M 檢查點(diǎn)失效，進(jìn)而引起細(xì)胞的劇烈增殖。ESPL1 是一種分離酶，最初在真菌中發(fā)現(xiàn)，編碼一種參與細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)，在染色體分離和細(xì)胞分裂中起著關(guān)鍵作用^［36］。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物基因組約 70% 被轉(zhuǎn)錄，但實(shí)際上能編碼蛋白質(zhì)的只有約 2%，其余被轉(zhuǎn)錄為非編碼 RNA^［25］。這些非編碼 RNA 可通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳修飾等影響基因和蛋白的表達(dá)，并與卵巢的生殖功能和內(nèi)分泌功能密切相關(guān)^［37-38］。為了深入探究綿羊季節(jié)性繁殖的機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)其中 12 個(gè)核心基因存在lncRNA-miRNA-mRNA 靶向關(guān)系。因此，針對(duì)以上核心基因構(gòu)建了 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測 lncRNA 與季節(jié)性繁殖核心基因之間的靶點(diǎn)組合，進(jìn)而探討差異表達(dá) lncRNA 在綿羊發(fā)情調(diào)控過程中的潛在作用。GO 和 KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，14 個(gè)差異表達(dá) lncRNAs 均靶向分子功能是 ATP 結(jié)合相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因 TOP2A、BUB1B、KIF11、KIF20A、BUB1 和 SMC2。ATP 結(jié)合參與卵子發(fā)生的調(diào)控^［39］。7 個(gè) lncRNAs 靶向細(xì)胞周期信號(hào)通路相關(guān)基因。細(xì)胞周期包括 DNA 復(fù)制和分裂，對(duì)細(xì)胞存活、增殖以及組織平衡和發(fā)育至關(guān)重要^［40］。細(xì)胞周期進(jìn)程主要由 CDKs 和細(xì)胞周期蛋白驅(qū)動(dòng)和調(diào)控^［41］。本研究篩選到與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因 CDCA8、CDC20、CDK1 和 CCNB2，在中國美利奴羊乏情期的表達(dá)水平高于其他繁殖時(shí)期。

4 結(jié) 論

季節(jié)性發(fā)情特性的形成可能與卵母細(xì)胞的發(fā)育過程存在密切關(guān)聯(lián)。本研究篩選出 19 個(gè)核心基因和 27 個(gè) lncRNA，并構(gòu)建了基于核心基因的 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)開展機(jī)制研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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（編輯 郭云雁）