母豬死胎和木乃伊全基因組關聯(lián)分析

摘 要： 旨在鑒定大白母豬初胎的死胎和木乃伊性狀相關候選基因與遺傳標記。本研究采用“中芯一號”50K SNP芯片對1 805 頭大白母豬進行全基因組基因分型，經(jīng)過數(shù)據(jù)結(jié)果的過濾與篩選，結(jié)合初胎死胎數(shù)和木乃伊數(shù)的表型數(shù)據(jù)，開展全基因組關聯(lián)分析（GWAS）。研究結(jié)果表明，有24個SNPs與初胎死胎數(shù)、18個SNPs與木乃伊性狀顯著相關，并注釋得到34個候選基因。其中，25個基因與死胎性狀相關（如SIL1、FSTL4、DHX38、PLK2、PDE4D等），9個基因與木乃伊性狀相關（如LRRTM4、ERC2、ARHGEF3、U6等）。通過豬QTL數(shù)據(jù)庫（Pig QTLdb）進行比對分析發(fā)現(xiàn)，部分候選基因位于已有文獻報道的與死胎和木乃伊性狀相關的基因區(qū)域內(nèi)，且顯著SNPs存在連鎖現(xiàn)象。GO和KEGG富集分析揭示了顯著SNPs的上、下游注釋基因與免疫反應、細胞信號傳導、細胞凋亡與分裂以及疾病的產(chǎn)生等過程密切相關。此項研究篩選了大白豬群體的初胎死胎和木乃伊性狀相關候選基因，并為分子育種提供重要參考。

關鍵詞： 母豬；初胎；死胎數(shù)；木乃伊；GWAS；SNP；QTL

中圖分類號：

S828.3"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1231-11

收稿日期：2024-08-09

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1200801）；四川省科技計劃（2021YFYZ0030；2021ZDZX0008）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系四川生豬創(chuàng)新團隊（SCCXTD-2024-8）；國家生豬產(chǎn)業(yè)體系（CARS-35）；中央引導地方科技發(fā)展資金項目（2023ZYDF056）

作者簡介：周泰增（2003-），男，遼寧鞍山人，本科，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： zhoutaizeng666666@163.com

*通信作者：沈林園，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： shenlinyuan@sicau.edu.cn

Genome-wide Association Study of Stillbirths and Mummies in Sows

ZHOU" Taizeng ³， YANG" Yiting ³， ZHU" Yuehua4， QIAN" Hongxi4， LIU" Yihui5，

GAN" Mailin ³， ZHU" Li ³， SHEN" Linyuan ^3*

（1.National Key Laboratory of Pig and Poultry Seed Industry， Sichuan Agricultural

University， Chengdu 611130， China; 2.Sichuan Provincial Key Laboratory of Exploration

and Innovative Utilization of Livestock and Poultry Genetic Resources， Sichuan

Agricultural University， Chengdu 611130， China;

3.Key Laboratory of Livestock

and Poultry Biomics of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， College of Animal

Science and Technology， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;

4.Tieqi Lishi Food Co.， Ltd.， Chengdu 610000， China;

5.Sichuan Provincial Animal Husbandry Station， Chengdu 610066， China）

Abstract：" The aim of this research was to identify candidate genes and genetic markers associated with stillbirth and mummified fetus traits in the first litter of Large White sows. A total of 1 805 Large White sows were genotyped using the \"Zhongxin No. 1\" 50K SNP chip. After filtering and selecting the data， a genome-wide association study （GWAS） was conducted， incorporating phenotypic data of stillbirths and mummified fetuses from the first litter. The results showed that 24 SNPs were significantly associated with the number of stillbirths， and 18 SNPs were significantly associated with mummified fetus traits， identifying a total of 34 candidate genes. Among these， 25 genes were related to stillbirths （such as SIL1， FSTL4， DHX38， PLK2， PDE4D， etc.）， while 9 genes were associated with mummified fetus traits （including LRRTM4， ERC2， ARHGEF3， U6， etc.）. A comparison with the Pig QTL database （Pig QTLdb） revealed that some of the candidate genes were located within previously reported genomic regions associated with stillbirth and mummified fetus traits， and significant SNPs exhibited linkage disequilibrium. Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses indicated that the genes annotated upstream and downstream of the significant SNPs were closely associated with biological processes such as immune responses， cell signaling， apoptosis and cell division， as well as disease development. This study screened the candidate genes related to the traits of stillbirth and mummy in Large White pig population， and provided an important reference for molecular breeding.

Keywords： sow; first parity; the number of stillborn; mummy; GWAS; SNP; QTL

*Corresponding author：SHEN Linyuan， E-mail：shenlinyuan@sicau.edu.cn

豬是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物，全球每年消費豬肉超過1億噸。母豬的繁殖性能是影響母豬生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益的關鍵因素，通常作為重要的經(jīng)濟生產(chǎn)性狀進行量化。出生時死亡仔豬數(shù)量作為重要的經(jīng)濟性狀，是生豬產(chǎn)業(yè)體系育種工作中不可或缺的重要指標。死胎數(shù)（the number of stillborn， NS）和木乃伊數(shù)（the number of mummy， NM）共同構(gòu)成出生時死亡仔豬數(shù)量。目前的研究表明，NS與宮內(nèi)窒息、產(chǎn)程長或難產(chǎn)、窩產(chǎn)仔數(shù)多、母豬體重的降低或胎齡的增大、傳染性疾病和缺鐵性貧血等因素有關^［1-6］，NM與子宮空間不足、傳染性疾病、胎次和產(chǎn)仔數(shù)有關^{［2，7-8］}。從已報道的研究來看，不同胎次的NS或者NM相關基因差異較大^［9-11］，其中初胎是仔豬死亡比例較高的胎次，由于受環(huán)境（母豬對周圍環(huán)境的不適應）和母體自身（產(chǎn)道較其他胎次狹窄^［6］等）等非遺傳效應影響很大，遺傳力較低，基于最佳線性無偏預測（best linear unbiased prediction， BLUP）的繼代選育方法對其遺傳改良是有限的^［12-13］。因此，為了更精確的利用分子標記輔助選擇來提高繁殖性能，快速提高大白豬遺傳進展，篩選更多與繁殖性狀相關的候選基因顯得尤為重要。

隨著基因組選擇（genomic selection， GS）的出現(xiàn)，SNP基因分型芯片已被廣泛應用于家畜的遺傳育種工作^［14-16］。目前，利用單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism sign， SNPs）作為分子遺傳標記的全基因組關聯(lián)分析（genome wide association study， GWAS）是一種主流方法，使用高密度DNA芯片對豬的數(shù)量性狀進行GWAS，尋找重要的分子標記和數(shù)量性狀基因座，以提高豬的繁殖性狀。吳平先等^［17］在探究榮昌豬初產(chǎn)繁殖性狀時，將MSH3和CBLB基因列為影響榮昌豬NM的重要候選基因；Wu等^［10］通過對大白豬和長白豬多胎次NS和NM性狀的研究，將ASTN1作為NS的候選基因，將HMGB1等基因作為NM的候選基因。而本試驗針對大白豬的初胎NS和NM性狀進行研究。

本試驗以重慶某核心育種場的1 805 頭大白母豬為研究對象，收集其初胎NS和NM表型數(shù)據(jù)，基于“中芯一號”芯片數(shù)據(jù)進行GWAS，篩選與NS性狀相關的SNPs、數(shù)量性狀基因座 （quantitative trait locus， QTL）以及候選基因。本研究旨在為降低豬NS和NM的育種工作提供新的遺傳標記，推進生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)母豬繁殖性能的遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 表型統(tǒng)計

本試驗以重慶某核心育種場的1 805 頭大白母豬為研究對象，收集母豬初胎NS和NM數(shù)據(jù)各1 805條。

1.2 動物樣本采集與基因分型

對1 805 頭母豬采集約1～2 g耳組織樣，浸泡于裝有75%酒精的2 mL Ep離心管中，采用氯仿抽提的方法提取基因組DNA（genomic DNA，gDNA），所有樣品的gDNA利用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000（Themro Scientific， Waltham， MA，USA）的方法進行定量分析。對所有樣品進行全基因組擴增，將獲得的DNA片段加到芯片上，進行雜交。然后通過清洗去掉非特異性結(jié)合的DNA，剩下特異性結(jié)合的位點進行單堿基延伸，染色后利用Illumina iScan Reader進行掃描。對提取的DNA進行質(zhì)檢，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量符合分型標準后，使用“中芯一號”50K SNP芯片進行分型?；蚍中陀杀本┛灯丈锛夹g有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)過濾

使用Plink（v1.90）軟件^［18］對SNP數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，剔除次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）lt;0.01的位點、SNP缺失率大于10%的位點（Geno）、哈代-溫伯格平衡檢驗（HWE）Plt;10^-6的位點。

1.4 GWAS分析

采用ASRgwas（v. 1.0.0）^［19］軟件的重復力模型進行關聯(lián)分析。在構(gòu)建模型時將配種季節(jié)和分娩季節(jié)納入固定效應，具體模型如下：

y=μ+αisi+Xβ+Z1u+Qδ+Z2a+e

其中，μ為總體均值； αi 是第 i 個標記相關聯(lián)的斜率； si 是從標記矩陣M中提取的第 i 個標記的值（0、1、2）的向量； β 是固定效應的向量； u 是隨機效應的向量，且滿足 u～N（0，Iσ2u） ； δ 是固定群體或群體效應的向量； a 是隨機加性效應的向量，且滿足 a～N（0，GAσ2A）；e 為隨機殘差效應的向量，且滿足 e～N（0，Iσ2u） 。矩陣X、Z1和Z2是關聯(lián)矩陣，1是1的向量，Q是描述種群結(jié)構(gòu)的q個向量矩陣，最后 GA 是由標記推導出的基因組關系矩陣（GRM）。

本研究使用ASRgwas（v. 1.0.0）軟件的參考閾值，Pgt;5×10^-4的SNPs被認為是顯著的SNPs。曼哈頓圖（Manhattan）和分位數(shù)-分位數(shù)圖（quantitle-quantitle plot， Q-Q圖）由R包（https：//cran.r-project.org/web/packages/CMplot/index.html）繪制。

1.5 QTL及LD分析

基于數(shù)據(jù)庫（Pig QTLdb，https：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/srchloc，2024年7月6日），與顯著SNPs位置信息進行比對分析，探索本研究所鑒定到的顯著SNPs是否位于已知的NS和NM性狀相關QTL中。此外，為了檢測顯著SNPs之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），使用Plink（v1.90）軟件和Haploview軟件^［20］將同一染色體上且物理位置較近的顯著SNPs進行連鎖不平衡分析。

1.6 GO和KEGG富集分析

將GWAS篩選到的顯著及潛在顯著性位點上、下游500 kb的區(qū)域定為候選區(qū)域，使用豬參考基因組Sus scrofa11.1版本（http：//ensembl.Org/Sus_scrofa/Info/Index），利用Ensemble數(shù)據(jù)庫進行候選基因注釋。此外，利用clusterProfiler包^［21］進行進一步的基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計與芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

對1 805頭母豬的NS和NM進行描述性統(tǒng)計，詳細信息如表1所示。

經(jīng)檢測合格的1 805 個DNA樣品，利用“中芯一號”50K SNP芯片對全基因組SNPs進行檢測，共檢測出49 361 個SNPs，將性染色體上的位點去除后，最終得到49 352 個SNPs，在染色體上分布如圖1A所示。對獲得的基因分型數(shù)據(jù)使用Plink軟件進行質(zhì)量控制，剔除次等位基因頻率小于0.01的位點、SNP缺失率大于10%的位點、哈代-溫伯格平衡檢驗P＜10^-6的位點，共獲得41 368 個SNPs進行后續(xù)分析。質(zhì)控前后各染色體SNPs數(shù)量對比如圖1B所示。

2.2 GWAS分析結(jié)果

2.2.1 死胎

通過GWAS檢測芯片數(shù)據(jù)，篩選與NS性狀顯著關聯(lián)的SNPs。使用豬參考基因組Sus Scrofa 11.1，利用Ensemble數(shù)據(jù)庫通過注釋顯著位點上、下游40 kb基因，在選擇窗口區(qū)域內(nèi)注釋與NS性狀相關的功能基因，如圖2中曼哈頓圖所示，共篩選到高于閾值的24個顯著SNPs并用紅色標出。如表2所示，有18個SNPs注釋到基因，分別位于1、2、4、6、7、9、10、16和18號染色體。在2號染色體上，位點CNCB10002244和CNCB10002245均注釋到CTNNA1和LRRTM2基因，CNCB10002246和CNC10023000均注釋到SIL1基因上，CNC10023000還注釋到了CTNNA1基因，CNC10022904位于FSTL4基因上，CNC10022911位于TCF7和SKP1基因上。位于6號染色體的位點CNCB10004339注釋到DHODH、TXNL4B、DHX38和PMFBP1基因。位于16號染色體上的位點CNC10160815、CNCB10011377和CNC10161206分別注釋到了基因PLK2、PDE4D和TENM2。

如圖2中QQ圖所示，左下角顯著性低的位點位于對角線上，這些位點的-log10（P）的觀測值與期望值一致，說明分析模型是適當?shù)摹６鴪D形右上角顯著性較高的位點逐漸開始向上傾斜，說明本研究所使用的Q矩陣是合適的，很好的控制了假陽性。

2.2.2 木乃伊

基于初胎NM性狀數(shù)據(jù)共篩選到18個顯著SNPs，其中有7個顯著SNPs通過Ensemble數(shù)據(jù)庫被注釋到其上、下游40 kb基因，如圖3中的曼哈頓圖所示，分別位于2、3、10和13號染色體。如表3所示，位于2號染色體上的位點CNC10021238注釋到MYO9B和HAUS8基因。位于3號染色體的位點CNC10013054和CNC10031386分別注釋到基因U1和LRRTM4?；騍PATA17被位于10號染色體的CNCB10007328注釋到。在13號染色體上，CNC10130837和CNCB10008586分別注釋到ERC2和CFAP20DC，位點CNC10130848在基因ARHGEF3和U6上。

2.3 QTL及LD分析

基于與死胎和木乃伊性狀顯著相關的SNPs位置信息，通過數(shù)據(jù)庫（Pig QTLdb， https：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/srchloc，2024年7月6日）檢索本研究所鑒定到的顯著SNPs是否位于已知的相關QTL中。

針對顯著SNPs分布較密集的性狀的染色體區(qū)域，在顯著位點上、下游進行連鎖不平衡分析，如圖4所示，得到多個連鎖不平衡塊。

2.4 GO和KEGG富集分析

利用clusterProfiler包將顯著SNPs上、下游500 kb的功能基因進行富集分析。如圖5A所示，GO富集分析在生物學過程（biological process， BP）、細胞成分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）3個層面進行描述。結(jié)果表明，這些功能基因主要參與調(diào)節(jié)先天免疫反應、內(nèi)吞作用的負調(diào)控、對生物刺激反應的積極調(diào)節(jié)、有絲分裂細胞周期的調(diào)控等與NS和NM性狀相關聯(lián)的過程。如圖5B所示，KEGG富集分析結(jié)果表明，這些功能基因主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、細胞周期、Hippo信號通路、糖酵解/糖異生、卵母細胞減數(shù)分裂、癌癥中的中心碳代謝、人類免疫缺陷病毒1型感染等通路。

3 討 論

出生時死亡仔豬數(shù)量包括死胎數(shù)和產(chǎn)木乃伊數(shù)，是判定母豬繁殖性能高低的重要標準，直接影響生豬產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。其中，初胎時死亡的仔豬比例相對其他胎次更多，且多胎次數(shù)據(jù)會增加模型的復雜度，容易出現(xiàn)假陽性位點，不利于挖掘與表型有關的SNPs，減少頭胎死胎率更是育種工作者們長期研究的重要方向。先前關于出生時死亡仔豬數(shù)量的研究大多著眼于多個胎次^［13］，相較于Wu等^［10］利用250 頭大白母豬的1～5胎次數(shù)據(jù)，本研究選取了1 805 頭大白母豬的初胎死胎數(shù)和產(chǎn)木乃伊數(shù)作為樣本，母豬個體數(shù)量更大，胎次更具有針對性。

在篩選初胎死胎數(shù)性狀潛在候選基因時，在2號染色體上出現(xiàn)了較多的顯著SNPs。其中，發(fā)現(xiàn)SIL1同時被2個SNPs注釋到，在有關大白豬的研究中^［22］，發(fā)現(xiàn)SIL1的異常表達會導致身體尺寸減小。由此可以推斷，SIL1可能使得使胎兒體型較小，增大了其死亡的概率。被SNPs（CNC10022904）注釋到的FSTL4是TGF-β卵泡抑素基因家族的成員，F(xiàn)STL4被發(fā)現(xiàn)與人類的高血壓有關以及在人類胎兒的發(fā)育過程中發(fā)揮作用^［23-24］?；騀STL4可能導致母豬或胎兒較高的血壓，進而影響胎兒發(fā)育，使得死胎數(shù)量增多?；駾HX38被位于6號染色體上的SNPs（CNCB10004339）注釋到。DHX38也稱為PRP16，在Li等^［25］的研究中，DHX38基因被視為豬生長率選擇的遺傳標記。位于16號染色體上的SNPs（CNC10160815、CNCB10011377）分別注釋到基因PLK2和PDE4D，其中PLK2是PLK家族5個成員（PLK1～5）之一，PLK屬于絲氨酸和蘇氨酸激酶，對細胞周期的調(diào)節(jié)至關重要。在Kulus等^［26］對豬卵泡顆粒細胞的研究中，PLK2的表達增加被發(fā)現(xiàn)會影響顆粒細胞的細胞周期。在GO富集分析中，PLK2參與了有絲分裂細胞周期的G1（GO：0000082）等共10個與細胞周期或有絲分裂相關的生物學過程（BP）。PDE4D已被證實在豬的心臟中發(fā)揮重要作用^［27］。此外，PDE4D在哺乳動物大腦中高度表達，在認知增強方面具有重要作用，PDE4D也是導致肢端發(fā)育不良的主要基因^［28］。因此，PDE4D可能使得胎兒心臟和肢蹄存在發(fā)育缺陷，導致其出生時死亡。在GO富集中，PDE4D參與的24個生物學過程（BP）均與物質(zhì)代謝有關，例如，嘌呤核糖核苷酸分解代謝過程（GO：0009154）、芳香族化合物分解代謝過程（GO：0019439）等。

在篩選初胎產(chǎn)木乃伊數(shù)性狀潛在候選基因時，發(fā)現(xiàn)基因LRRTM4被位于3號染色體的SNPs（CNC10031386）注釋到，LRRTM4同自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）等神經(jīng)類疾病相關^［29］。先前對幽州黑山羊產(chǎn)仔數(shù)的研究中，將LRRTM4作為候選基因^［30］。位于13號染色體的SNPs注釋到基因ECR2、ARHGEF3和U6。ERC2被認為與荷斯坦奶牛的子宮炎相關^［31］，在有關人類的研究中，ERC2被認為與胎兒的神經(jīng)精神疾病^［32］以及幼兒的熱性驚厥^［33］相關，推測ERC2可以使母豬患子宮炎，增加胎兒患熱性驚厥和神經(jīng)精神性疾病的可能性，導致木乃伊仔豬的產(chǎn)生。ARHGEF3是一種促鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF），目前的研究發(fā)現(xiàn)其參與受傷后的骨骼肌再生以及血管和紅細胞的生成^［34-35］。Metodiev等^［36］通過對大白豬的研究，篩選到ARHGEF3是影響斷奶仔豬數(shù)量（斷奶時母豬身邊的仔豬數(shù)量）的重要基因。U6被證實與豬的終身非生產(chǎn)天數(shù)占壽命的比例、終身妊娠天數(shù)、腹圍、胸圍和乳頭數(shù)等性狀相關^［37-38］。

通過將與NS和NM顯著相關的42個SNPs在豬QTL數(shù)據(jù)庫中搜索，發(fā)現(xiàn)這些SNPs落在與兩性狀相關的QTL區(qū)域內(nèi)，它們中大多數(shù)與母豬的繁殖性狀、免疫系統(tǒng)和疾病或病原體相關。在與NS顯著相關的24個SNPs中，篩選到仔豬死亡率、妊娠期長度、產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)和子宮角長度等與死胎數(shù)相關的QTL區(qū)域。位于13號染色體，與NM相關的3個SNPs（CNC10130837、CNC10130848、CNCB10008586）所在QTL與先前研究發(fā)現(xiàn)的死胎數(shù)量相關。此外，兩性狀相關的SNPs均落在補體蛋白C3c濃度、IL-10、IFN-γ、溶血補體活性、肝臟重量和白細胞數(shù)量相關QTL上，它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，影響個體對疾病的抵抗能力。相較于NS，篩選NM相關SNPs得到的與血液中IFN-γ含量、血液中IL-10含量、肝臟重量和白細胞數(shù)相關的QTL數(shù)量明顯增多，溶血補體活性相關QTL明顯減少。此外，在篩選NM相關SNPs時，位于3號染色體上的6個顯著SNPs在與CD-8陰性白細胞和CD-8陽性白細胞相關的QTL區(qū)域內(nèi)，這兩種細胞在機體抵御細菌、病毒等方面具有重要作用，在Getmantseva等^［39］關于豬腿部缺陷的研究中，同樣提到了這兩種細胞。在疾病或病原體方面，兩性狀相關SNPs所在QTL區(qū)域均與黑色素瘤、破傷風、軟骨病和沙門氏菌有關。此外，NS相關SNPs所在QTL區(qū)域與胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、破傷風、臍疝和偽狂犬病相關，NM相關SNPs所在QTL區(qū)域同豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）和米氏肉孢子蟲相關。

4 結(jié) 論

根據(jù)GWAS結(jié)果，共篩選出42個與大白母豬死胎和產(chǎn)木乃伊數(shù)性狀有關的SNPs作為死胎的候選標記SNP，通過功能分析與QTL定位，挖掘了與二者可能相關的SIL1、FSTL4、DHX38、PLK2、PDE4D、LRRTM4、ERC2、ARHGEF3、U6等34個候選基因。本研究結(jié)果為大白母豬群體初胎的死胎和木乃伊性狀的遺傳機理解析提供了理論基礎，并為分子育種提供了新的分子標記。

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（編輯 郭云雁）