塔里木馬鹿抗氧化基因PRDX1的功能初探

摘 要： 旨在探討塔里木馬鹿抗氧化功能基因過氧化物酶1（PRDX1）在氧化應(yīng)激中對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究利用塔里木馬鹿PRDX1基因（CeyPRDX1）過表達(dá)載體（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP）感染人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT后，通過MTT法建立HaCaT細(xì)胞在高溫、鹽（NaCl）和過氧化氫（H2O2）等脅迫條件下的損傷模型。在這3種氧化應(yīng)激脅迫條件下檢測(cè)過表達(dá)CeyPRDX1基因?qū)?xì)胞的凋亡率、線粒體膜電位變化（JC-1）、活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）含量以及SOD1、PTEN和Caspase-3等基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，將200 mmol·L^-1的NaCl干預(yù)細(xì)胞24 h、0.50 mmol·L^-1的H2O2處理細(xì)胞12 h和42 ℃培養(yǎng)細(xì)胞4 h選為細(xì)胞氧化損傷的最佳脅迫條件。在此脅迫條件下，過表達(dá)CeyPRDX1基因能夠增加細(xì)胞存活率，并減少由NaCl、H2O2和高溫等脅迫條件誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位的損傷、ROS以及MDA含量，從而有效降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。qRT-PCR結(jié)果表明，在3種脅迫條件下，與未感染和感染空載慢病毒的HaCaT細(xì)胞相比，感染CeyPRDX1過表達(dá)慢病毒的HaCaT細(xì)胞中SOD1的mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.001），而PTEN和凋亡相關(guān)基因Caspase-3的mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）。本研究結(jié)果表明， CeyPRDX1基因可能在塔里木馬鹿適應(yīng)極端干旱環(huán)境和耐受高鹽飲食的過程中起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。其作用可能與SOD1、PTEN和Caspase-3等基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 塔里木馬鹿；PRDX1基因；HaCaT細(xì)胞；CeyPRDX1過表達(dá)；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)：

S825.2"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1216-15

收稿日期：2024-10-09

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022D01B40）

作者簡介：布威海麗且姆·阿巴拜科日（1988-），女，維吾爾族，新疆和田人，副教授，博士，主要從事野生哺乳動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)和適應(yīng)性進(jìn)化、藥用植物系統(tǒng)進(jìn)化及其相關(guān)研究，E-mail：hediqe9@163.com

*通信作者：單文娟，主要從事新疆珍稀瀕危及特有野生哺乳動(dòng)物的保護(hù)遺傳學(xué)及分子系統(tǒng)演化研究，E-mail：swj@xju.edu.cn

Preliminary Study on the Function of PRDX1 Antioxidant Gene in Tarim Red Deer

ABABAIKERI" Buweihailiqiemu ^3，4， AIHEMAITIJIANG" Aihemaitiniyazi1，

MOHAMMADTURSUN Nabijan^1，3， SHAN Wenjuan^2*

（1.Xinjiang Hetian College， Hotan 848000， China; 2.Xinjiang Key Laboratory of

Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，

Xinjiang University， Urumqi 830017， China;

3.Xinjiang Key Laboratory of Hotan

Characteristic Chinese Traditional Medicine Research， Hotan 848000， China;

4.College

of Life Sciences，Wuhan University， Wuhan 430072， China）

Abstract：" This study was conducted to investigate the protective effect of the antioxidant gene peroxiredoxin I （PRDX1） of Tarim red deer in cells under oxidative stress. The Tarim red deer PRDX1 （CeyPRDX1） overexpression vector （pLJM1-CeyPRDX1-EGFP） was used to infect human immortalized keratinocyte HaCaT cells， and MTT method was used to establish the injury model of HaCaT cells under high temperature， salt （NaCl） and hydrogen peroxide （H2O2） stress conditions. Under this stress conditions， the effects of overexpression of CeyPRDX1 on cell apoptosis rate， mitochondrial membrane potential changes （JC-1）， reactive oxygen species （ROS） content， malondialdehyde （MDA） content， and relative expression levels of SOD1， PTEN， and Caspase-3 genes were examined. The results showed that the 24 h of intervention with 200 mmol·L^-1 NaCl， 12 h of treatment with 0.50 mmol·L^-1 H2O2， and 4 h of cultivation at 42 ℃ were selected as the optimal stress conditions for cellular oxidative damage. Under stress conditions， overexpression of CeyPRDX1 gene could increase cell survival rate， and reduce apoptosis rate， mitochondrial membrane potential damage， ROS and MDA content induced by stress conditions such as NaCl， H2O2 and high temperature， effectively reducing oxidative stress-induced cell damage. The qRT-PCR results showed that under 3 stress conditions， compared to HaCaT cells that were not infected and HaCaT cells infected with empty lentivirus， HaCaT cells infected with CeyPRDX1 overexpressing lentivirus showed significantly increased mRNA expression level of SOD1 （P＜0.001）， while significantly decreased mRNA expression levels of PTEN and apoptosis related gene Caspase-3 （P＜0.01）. The results indicate that CeyPRDX1 gene may play an important role in protecting cells from oxidative stress damage in the adaptation of Tarim red deer to extreme drought environments and tolerance to high salt diets. Its role may be related to the expression regulation of genes such as SOD1， PTEN and Caspase-3.

Keywords： Tarim red deer; PRDX1 gene; HaCaT cells; overexpression of CeyPRDX1; oxidative stress

*Corresponding author：SHAN Wenjuan， E-mail：swj@xju.edu.cn

塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）是中國新疆塔克拉瑪干沙漠周邊塔里木盆地特有的典型的耐旱鹿科動(dòng)物。塔里木盆地極端的干旱棲息環(huán)境決定了UV輻射、溫度、鹽度和干旱是塔里木馬鹿生存過程中不可避免的脅迫因素。極端干旱^［1］、鹽^［2］和高溫^［3］等逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量積累，當(dāng)ROS的形成超過靶細(xì)胞的抗氧化防御能力時(shí)，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致氧化損傷。為了維持細(xì)胞ROS的代謝平衡，有效減弱脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，生物體在長期的進(jìn)化過程中體內(nèi)形成了完整的抗氧化系統(tǒng)來清除多余的ROS。

過氧化物還原酶（PRDXs）是一種在哺乳動(dòng)物中高度保守的半胱氨酸依賴型過氧化物酶家族蛋白，具有高度的抗氧化活性，可去除過氧化物，包括過氧化氫、有機(jī)氫過氧化物和過氧亞硝酸鹽等^［4-5］。在哺乳動(dòng)物中已鑒定出6個(gè)PRDX成員（PRDX1-PRDX6）并分為3個(gè)亞家族^［4-5］。PRDX1是典型的2-Cys-PRDX亞家族的成員，需要兩個(gè)半胱氨酸的氧化來激活其酶活性，催化過氧化氫和有機(jī)過氧化氫分別還原為水和醇^［4］。PRDX1調(diào)節(jié)與ROS相關(guān)的各種信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化和清除自由基的功能^［6-7］，可以保護(hù)角質(zhì)化細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的凋亡，參與表皮屏障修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合，減輕氧化應(yīng)激對(duì)皮膚造成的損傷，是氧化應(yīng)激條件下保護(hù)皮膚和維持皮膚穩(wěn)態(tài)的新策略^［8］。在前期研究中利用全基因組重測(cè)序（WGS）進(jìn)行的FST-θπ和XP-EHH選擇消除分析方法檢測(cè)到在塔里木馬鹿中PRDX1基因具有較強(qiáng)的選擇消除信號(hào)^［9］。與此同時(shí)，將塔里木馬鹿皮膚組織作為研究對(duì)象進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PRDX1基因在塔里木馬鹿皮膚組織中上調(diào)表達(dá)并顯著富集在氧化還原酶活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、催化活性和分子功能等6條GO功能類別以及過氧物酶體等KEGG通路^［10］。這些GO功能類別與雙峰駝（Camelus ferus）和單峰駝（Camelus dromedarius）干旱-沙漠環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)^［11］。此外，PRDX1基因在極端干旱-沙漠環(huán)境適應(yīng)埃及肥尾羊（Ovis aries）中也受選擇并富集到氧化還原酶活性和抗氧化活性相關(guān)的多種生物學(xué)過程^［12］?；谝陨涎芯繄?bào)道，結(jié)合本課題組前期研究的WGS數(shù)據(jù)、皮膚組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)在塔里木馬鹿極端干旱環(huán)境適應(yīng)中PRDX1基因可能發(fā)揮著潛在的作用。然而，細(xì)胞在不同脅迫條件下的氧化應(yīng)激過程中塔里木馬鹿PRDX1是否發(fā)揮作用尚不清楚。

本研究擬利用塔里木馬鹿PRDX1基因（CeyPRDX1）編碼區(qū)CDS序列構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，并將其感染到皮膚相關(guān)細(xì)胞人角質(zhì)化細(xì)胞系 HaCaT中進(jìn)行過表達(dá)后建立HaCaT細(xì)胞在高溫、鹽和過氧化氫等脅迫條件下的損傷模型，并在這3種氧化應(yīng)激脅迫條件下檢測(cè)過表達(dá)CeyPRDX1對(duì)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。本研究結(jié)果可為闡明PRDX1基因在塔里木馬鹿適應(yīng)環(huán)境脅迫過程中的重要作用提供有價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料和試劑

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購于萬類生物公司；慢病毒表達(dá)載體（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP）由本課題組提供；2×Sybr Green qPCR Mix （High ROX）和First Strand cDNA Synthesis Kit購于北京金百特生物技術(shù)有限公司；MTT檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒和活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒均購于萬類生物；過硫酸銨（APS）、胰蛋白酶-EDTA消化液、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）均購于北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、DMEM 和胎牛血清（FBS）均購于Invitrogen公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）、BSA牛血清蛋白（美國Biosharp 公司）、DMSO溶液和青鏈霉素均購于美國Sigma公司；Tris、H2O2（30 mL·L^-1）、NaCl和其他化學(xué)試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 CeyPRDX1過表達(dá)慢病毒感染HaCaT細(xì)胞

開始感染HaCaT細(xì)胞之前，病毒從－80 ℃冰箱取出后置于冰浴慢慢融化，加入培養(yǎng)基稀釋慢病毒，混勻分裝后即用（或4 ℃保存）。將HaCaT細(xì)胞以3×105個(gè)·mL^-1接種于24孔板，培養(yǎng)12～20 h。根據(jù)MOI值（20），使用1/2小體積感染法，加入250 μL慢病毒稀釋液，4 h后，加入polybrene（終濃度為8 μg·mL^-1）和完全培養(yǎng)基補(bǔ)足至500 μL并置于37 ℃，50 mL·L^-1 CO2箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)慢病毒感染率，感染48 h后開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 篩選構(gòu)建HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的最佳脅迫條件

HaCaT細(xì)胞用含10 mL·L^-1 FBS、100 U·mL^-1青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，50 mL·L^-1 CO2以及飽和濕度條件下培養(yǎng)至90%，再傳代并制成5×103個(gè)·mL^-1的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分別用高鹽（0、50、100、150、200和250 mmol·L^-1濃度的NaCl溶液干預(yù)細(xì)胞4、6、12、18和24 h）、高溫（37 ℃、39 ℃、41 ℃和42 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞1、2、3和4 h）和H2O2（0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00和2.50 mmol·L^-1濃度的H2O2培養(yǎng)細(xì)胞6、12、18和24 h）等3種不同脅迫條件處理后，加MTT溶液20 μL（5 mg·mL^-1）37 ℃孵育4 h。PBS清洗后每孔加l50 μL二甲基亞砜（Formazan溶解液，DMSO），振蕩10 min，570 nm處測(cè)光吸收值 D（570 nm）。 每個(gè)處理?xiàng)l件設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)脅迫重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，并根據(jù)細(xì)胞存活率篩選對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的最佳處理?xiàng)l件。

細(xì)胞存活率（Cell viability）= D（570 nm）處理組-D（570 nm）空白D（570 nm）對(duì)照組-D（570 nm）空白×100%

對(duì)于同一時(shí)間的鹽和H2O2脅迫處理，以沒加入NaCl和H2O2的細(xì)胞作為對(duì)照組，其他藥物干預(yù)的細(xì)胞作為處理組；在同一時(shí)間的高溫脅迫處理，以37 ℃的細(xì)胞作為對(duì)照組，其余高溫刺激的細(xì)胞作為處理組。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道^［13-19］，本試驗(yàn)以細(xì)胞存活率為60%～80%的脅迫處理?xiàng)l件為對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的最佳適宜脅迫條件，如果細(xì)胞存活率過低或過高都不利于后續(xù)試驗(yàn)。

后續(xù)試驗(yàn)共設(shè)為4組，分別是未脅迫處理的正常HaCaT細(xì)胞（Control，對(duì)照組）、慢病毒未感染48 h的HaCaT細(xì)胞（NC，空白組）、空載慢病毒感染48 h的HaCaT細(xì)胞（pLJM1-EGFP-vector，空載組）和CeyPRDX1過表達(dá)慢病毒感染48 h的HaCaT細(xì)胞（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP，CeyPRDX1過表達(dá)組）。

1.4 MTT法測(cè)定過表達(dá)CeyPRDX1基因?qū)aCaT細(xì)胞損傷的影響

4組HaCaT細(xì)胞以5×103個(gè)·mL^-1濃度接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)篩選出來的最佳脅迫條件分別處理細(xì)胞后，加MTT溶液20 μL（5 mg·mL^-1），在37 ℃孵育4 h。PBS清洗后每孔加l50 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，570 nm處測(cè)光吸收值。其中，以未脅迫處理的正常HaCaT細(xì)胞為對(duì)照組，以空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組為處理組，按“1.3”的公式計(jì)算細(xì)胞存活率，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞以5×105個(gè)·mL^-1的密度接種于6孔板中，2 mL·孔^-1，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)篩選出來的最佳脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組HaCaT細(xì)胞后，分別收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)后再次收集。每組細(xì)胞加入500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞于流式管；加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻；加入10 μL的碘化丙啶染色液（PI），輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨后上機(jī)檢測(cè)（Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶（PI）為紅色熒光）。

1.6 過表達(dá)CeyPRDX1基因?qū)?xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

為了檢測(cè)過表達(dá)基因?qū)?xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，將細(xì)胞以5×105個(gè)·mL ^-1的密度接種于6孔板中，置于37 ℃、50 mL·L^-1 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)篩選出來的最佳脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組的HaCaT細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法按照線粒體膜電位（JC-1）檢測(cè)試劑盒和活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒說明書分別檢測(cè)細(xì)胞的JC-1變化和細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。同樣的方法處理各組細(xì)胞后按照丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒說明書和以下公式計(jì)算MDA含量（nmol·mg^-1 prot）：

MDA含量=D（532 nm）測(cè)定-D（532 nm）對(duì)照D（532 nm）標(biāo)準(zhǔn)-D（532 nm）空白×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測(cè)樣本蛋白濃度。

1.7 qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

將細(xì)胞以2×105個(gè)·mL^-1的密度接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)篩選出來的最佳脅迫條件處理后分別收集空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組的HaCaT細(xì)胞。按照TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA后，將檢測(cè)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以此為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。以未轉(zhuǎn)染慢病毒的正常HaCaT細(xì)胞為對(duì)照組，以脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組的HaCaT細(xì)胞為試驗(yàn)組，以β-actin（正向引物序列：5′-GGCACCCAGCACAAT-GAA-3′，反向引物序列：5′-TAGAAGCATTTGCGG-TGG-3′）作為內(nèi)參基因，檢測(cè)超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）（正向引物序列：5′-GGTCCTCACTTTAATCCTCT-3′，反向引物序列：5′-CTTCATTTCCACCTTTGC-3′）、10 號(hào)染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源體（phosphatase and tensin hommolog deleted on chromosome ten，PTEN）（正向引物序列：5′-ACCATAACCCACCA-CAGC-3′，反向引物序列：5′-CAGTTCGTCCCTT-TCCAG-3′）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease 3，Caspase-3）（正向引物序列：5′-TGGTTCATCCAGTCGCTTTG-3′，反向引物序列：5′-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3′）等基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，采用 2^-ΔΔCt 方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)基因做3次重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prisim軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA）進(jìn)行比較，兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，ns表示沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 篩選HaCaT細(xì)胞損傷的最佳脅迫條件

為建立細(xì)胞的損傷模型，本研究將HaCaT細(xì)胞分別用NaCl、H2O2和高溫等3種不同脅迫條件處理后，通過MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，不同濃度的NaCl處理細(xì)胞至18 h對(duì)細(xì)胞存活率影響不大，而隨著作用時(shí)間的推移，對(duì)細(xì)胞存活率的影響變大。其中，200 mmol·L^-1的NaCl處理細(xì)胞24 h以及250 mmol·L^-1 NaCl處理細(xì)胞18 h和24 h時(shí)，細(xì)胞存活率在80%以下（圖1A）。200 mmol·L^-1的NaCl干預(yù)細(xì)胞24 h的存活率為（72.35±3.17）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），因此將此條件選為最佳NaCl脅迫條件。

將HaCaT細(xì)胞用6種不同濃度的H2O2進(jìn)行處理后，隨著H2O2濃度和處理時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖活性逐漸下降（圖1B）。當(dāng)0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2，處理細(xì)胞12 h時(shí)，細(xì)胞存活率從（95.12±3.74）%降低到（68.67±2.37）%（P＜0.01）；時(shí)間延長至18 h和24 h后細(xì)胞存活率慢慢降低，分別為（62.90±5.97）%和（60.77±5.89）%。為了避免長時(shí)間的H2O2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響，將0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2處理細(xì)胞12 h選為最佳H2O2的脅迫條件。

將HaCaT細(xì)胞在4種不同溫度條件下培養(yǎng)至2 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率均在80%以上，都處于正常狀態(tài)（圖1C）。在42 ℃高溫刺激細(xì)胞3 h和4 h后，細(xì)胞存活率逐漸下降均小于80%。其中，3 h的細(xì)胞存活率（79.57±1.96）%跟同一時(shí)間39 ℃和41 ℃處理的細(xì)胞存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而42 ℃刺激細(xì)胞4 h的細(xì)胞存活率明顯降低（73.34±0.99）%，細(xì)胞存活率符合建立細(xì)胞損傷模型的范疇。因此，選42 ℃培養(yǎng)細(xì)胞4 h為最佳高溫處理脅迫條件。

2.2 不同脅迫條件下，過表達(dá)CeyPRDX1對(duì)細(xì)胞存活率的影響

利用最佳細(xì)胞損傷模型建立條件（200 mmol·L^-1的NaCl干預(yù)細(xì)胞24 h、0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2處理細(xì)胞12 h和42 ℃培養(yǎng)細(xì)胞4 h）來處理4組細(xì)胞后，通過MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率（圖2）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用以上脅迫條件處理的空白組和空載組細(xì)胞的存活率均顯著下降（P＜0.001）；CeyPRDX1過表達(dá)組的細(xì)胞存活率均高于空白組和空載組，并具有極顯著差異（P＜0.001）。NaCl和42 ℃脅迫條件下的CeyPRDX1過表達(dá)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率沒有顯著下降的趨勢(shì)（P＞0.05）。由此可見，在細(xì)胞中過表達(dá)CeyPRDX1對(duì)細(xì)胞增殖活力產(chǎn)生積極影響，比空白組和空載組更能耐受脅迫引起的細(xì)胞損傷。說明，CeyPRDX1基因在應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，從而提高受損細(xì)胞的存活率。

2.3 不同脅迫條件下，過表達(dá)CeyPRDX1對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示（圖3），在3種脅迫條件下，與對(duì)照組和CeyPRDX1過表達(dá)組相比，空白組和空載組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.001）。與空白組和空載組相比，CeyPRDX1基因的過表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞凋亡。此外，與對(duì)照組相比，CeyPRDX1過表達(dá)組在NaCl和H2O2脅迫條件下的細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.001，圖3A、3B和3D），而在42 ℃脅迫條件下的細(xì)胞凋亡率沒有顯著升高（P＞0.05，圖3C和3D）。以上結(jié)果表明，過表達(dá)CeyPRDX1基因能夠減輕由NaCl、H2O2和高溫脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，尤其是對(duì)高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮明顯的抑制作用。

2.4 線粒體膜電位變化的檢測(cè)

為了檢測(cè)細(xì)胞在不同脅迫條件下，過表達(dá)CeyPRDX1能否影響細(xì)胞的早期凋亡，利用JC-1檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位變化。結(jié)果顯示（圖4），脅迫處理細(xì)胞后，與對(duì)照組和CeyPRDX1過表達(dá)組相比，空白組和空載組細(xì)胞的平均紅綠熒光強(qiáng)度比值均為顯著下降（P＜0.001）。說明，脅迫條件對(duì)空白組和空載組細(xì)胞的膜電位產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。與對(duì)照組相比，在H2O2脅迫條件下，CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞的平均紅綠熒光強(qiáng)度比值顯著降低（P＜0.001，圖4B和4D），而在NaCl和42 ℃處理?xiàng)l件下的線粒體膜電位沒有顯著差異（P＞0.05，圖4A、4B和4D）。說明，過表達(dá)CeyPRDX1基因能夠減少由NaCl、H2O2和高溫等脅迫條件誘導(dǎo)的線粒體膜電位的損傷。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平

為探討過表達(dá)CeyPRDX1基因?qū)aCl、H2O2和高溫等脅迫條件處理細(xì)胞后的保護(hù)作用是否與ROS的清除有關(guān)，利用DCF的熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞的ROS含量顯著升高（P＜0.05），表明不同脅迫條件處理細(xì)胞后產(chǎn)生了較多的 ROS。其中，CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞的ROS含量顯著低于空載組和空白組的ROS 含量（P＜ 0.001）。結(jié)果表明，過表達(dá)的CeyPRDX1能夠清除細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的ROS。

2.6 丙二醛（MDA）含量的檢測(cè)

MDA含量的檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6），與對(duì)照組相比，不同脅迫條件處理的空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞的MDA含量均上升（P＜0.01）。其中，CeyPRDX1過表達(dá)組的MDA含量顯著低于空白組和空載組的MDA含量（P＜0.001）。機(jī)體內(nèi)MDA的含量可以直接反映生物體的氧化或損傷程度。以上結(jié)果可以看出，CeyPRDX1基因的過表達(dá)可能通過加強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，降低細(xì)胞損傷過程中發(fā)生的脂質(zhì)過氧化，從而減弱細(xì)胞的損傷程度。

2.7 qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

為探討脅迫條件下過表達(dá)CeyPRDX1基因是否影響氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，利用qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，在脅迫條件下，與對(duì)照組相比，在空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組中SOD1基因的mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.001）；其中，CeyPRDX1過表達(dá)組SOD1基因的mRNA表達(dá)量顯著高于空白組和空載組（P＜0.001）。與對(duì)照相比，空白組、空載組和CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞PTEN基因的 mRNA表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，而CeyPRDX1過表達(dá)組細(xì)胞PTEN的表達(dá)量顯著低于空白組和空載組（P＜0.001）。與對(duì)照組相比，NaCl、H2O2和高溫等脅迫處理使Caspase-3基因在空白組和空載組細(xì)胞的mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）；盡管，Caspase-3基因在CeyPRDX1過表達(dá)組中的表達(dá)量顯著低于空白組和空載組（P＜0.01），但在H2O2和42 ℃脅迫條件下CeyPRDX1過表達(dá)組Caspase-3基因的表達(dá)量非常接近于其在正常細(xì)胞的表達(dá)量（P＞0.05，圖7B和7C）。以上結(jié)果提示，細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下過表達(dá)CeyPRDX1可通過促進(jìn)抗氧化基因SOD1的mRNA表達(dá)，降低PTEN和凋亡相關(guān)基因Caspase-3的mRNA表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

3 討 論

3.1 細(xì)胞的選擇

皮膚作為哺乳動(dòng)物第一道保護(hù)屏障，要保護(hù)機(jī)體免受有害因素引起的氧化損傷^［20-21］。環(huán)境中強(qiáng)烈紫外線或污染以及機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)都會(huì)引起氧化應(yīng)激，抗氧化作用不足會(huì)造成毛囊中黑色素細(xì)胞凋亡和氧化損傷。塔里木馬鹿對(duì)塔里木盆地的各種應(yīng)激環(huán)境已表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，這意味著塔里木馬鹿皮膚中抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮著特別重要的角色。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，抗氧化基因PRDX1在塔里木馬鹿中受選擇并在皮膚組織中上調(diào)表達(dá)^［10］，從而推測(cè)塔里木馬鹿中PRDX1基因可能通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)和皮膚保護(hù)屏障的形成以及維持皮膚穩(wěn)態(tài)，從而可能發(fā)揮保護(hù)機(jī)體免受有害因素對(duì)細(xì)胞損傷的作用，但其細(xì)胞保護(hù)機(jī)制尚不清楚。HaCaT細(xì)胞是氧化應(yīng)激和自身免疫疾病的橋梁，具有許多與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，因其易于生存和穩(wěn)定的細(xì)胞特性常被用于表皮相關(guān)研究^［17］。為此，本試驗(yàn)選擇皮膚相關(guān)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT作為研究對(duì)象。

3.2 建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型

為探討過表達(dá)的CeyPRDX1是否能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，先篩選建立HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的最佳脅迫條件。在多種細(xì)胞損傷脅迫中H2O2由于穩(wěn)定性較好且操作簡便，不同細(xì)胞對(duì)H2O2刺激的敏感性不同，而常被用于建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型^［13-19］。此外，塔里木盆地極端的干旱環(huán)境導(dǎo)致該地區(qū)土壤的鹽堿度較高，塔里木馬鹿耐受飲用高礦化度的鹽水^［22］，且蘆葦（Phragmites communis）和檉柳（Tamarix ramosissima）是該物種的主要飼料，其鹽度明顯高于內(nèi)陸植物^［23-24］。因此，本研究選擇H2O2、NaCl和高溫作為刺激源建立氧化應(yīng)激模型的脅迫條件。關(guān)于最佳脅迫條件的選擇，不同研究建立細(xì)胞損傷模型所采用的最佳脅迫時(shí)間和作用時(shí)間也有所差別。如，Luo等^［15］的研究中利用不同濃度的H2O2處理細(xì)胞12 h后，選取0.50 mmol·L^-1的H2O2（細(xì)胞存活率約為62%）為構(gòu)建細(xì)胞損傷模型的最佳條件，此條件與高進(jìn)濤等^［16］的研究報(bào)道相一致。王建波等^［25］用不同濃度的NaCl 溶液干預(yù)人腎小管上皮細(xì)胞（HK2）24 h后誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷。許磊^［26］在探討安石榴苷抗高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷分子機(jī)制研究中，根據(jù)細(xì)胞存活率選取42 ℃處理細(xì)胞6 h（細(xì)胞存活率大概75%左右）為建立熱應(yīng)激模型條件?？梢钥闯?，建立氧化應(yīng)激模型時(shí)，細(xì)胞存活率不能太低也不能太高，若存活率太低說明細(xì)胞處于不可恢復(fù)的損傷狀態(tài)，不利于抗氧化機(jī)制的研究；若細(xì)胞存活率過高時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好，脅迫條件不會(huì)造成明顯的氧化損傷，不利于后續(xù)試驗(yàn)的開展。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道^［13-19］，本試驗(yàn)將細(xì)胞存活率一般在60%～80%的脅迫處理?xiàng)l件作為最適宜的脅迫條件。在此評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)下，將200 mmol·L^-1的NaCl干預(yù)細(xì)胞24 h（細(xì)胞存活率（72.35±3.17）%）、0.50 mmol·L^-1的H2O2處理細(xì)胞12 h（細(xì)胞存活率（68.67±2.37）%）和42 ℃培養(yǎng)細(xì)胞4 h（細(xì)胞存活率（73.34±0.99）%）作為建立氧化應(yīng)激模型的最佳脅迫條件。

3.3 過表達(dá)CeyPRDX1能夠有效降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

正常情況下，細(xì)胞的線粒體膜電位較高，線粒體中的JC-1以聚合物（J-aggregates）的形式存在于基質(zhì)并發(fā)出紅色熒光；細(xì)胞在各種脅迫條件下發(fā)生凋亡的時(shí)候線粒體膜電位也隨之下降，此時(shí)JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，而以單體（monomers）的形式存在，并發(fā)出綠色熒光，JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變能夠反映細(xì)胞早期凋亡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的活性氧ROS大量積累，從而引起細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激過程中大量ROS的產(chǎn)生會(huì)破壞線粒體跨膜電位的平衡，并導(dǎo)致線粒體損傷，從而進(jìn)一步加劇細(xì)胞凋亡過程^［27-28］。生物體因受到逆境脅迫條件被誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量ROS等自由基使生物膜上的脂質(zhì)物質(zhì)不斷遭受過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，最終降解成丙二醛（MDA）等有害代謝產(chǎn)物，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。因此，機(jī)體內(nèi)MDA的含量可以直接反映生物體的氧化或損傷程度^［29］。本試驗(yàn)用H2O2、NaCl和高溫的最佳脅迫條件處理4組細(xì)胞后，與對(duì)照組和CeyPRDX1過表達(dá)組相比，空白組和空載組的細(xì)胞存活率和線粒體膜電位顯著下降，細(xì)胞凋亡率、ROS和MDA含量顯著升高。可以看出，200 mmol·L^-1的NaCl、0.50 mmol·L^-1的H2O2和42 ℃的高溫對(duì)空白組和空載組HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化損傷。與此相反，與空白組和空載組相比，CeyPRDX1過表達(dá)組的細(xì)胞存活率和線粒體膜電位顯著增加，細(xì)胞凋亡率、ROS和MDA含量顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果與Jiang 等^［30］和Wen等^［31］的研究結(jié)果相一致?？梢钥闯?，過表達(dá)CeyPRDX1基因能夠減輕脅迫處理導(dǎo)致的線粒體膜電位的損傷，加強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，降低細(xì)胞損傷過程中發(fā)生的脂質(zhì)過氧化，從而降低HaCaT細(xì)胞凋亡并增加受損細(xì)胞的存活率，能夠有效降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

3.4 CeyPRDX1過表達(dá)影響SOD1、PTEN和Caspase-3等基因的表達(dá)調(diào)控

在氧化應(yīng)激下，為了保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，細(xì)胞表達(dá)出各種抗氧化酶，如SODs、GPXs和CAT等^［32］。Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）是一種細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，催化超氧化物歧化成氧和毒性較小的H2O2，并通過過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物蛋白進(jìn)一步將H2O2降解為氧和水，調(diào)節(jié)由線粒體和細(xì)胞質(zhì)超氧化物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平^［33］。Caspase-3是屬于Caspase家族的一種蛋白酶，能夠特異性的剪切多聚ADP核糖聚合酶和乙?；?DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素，活化蛋白水解作用，從而導(dǎo)致DNA裂解促進(jìn)細(xì)胞凋亡^［34］。細(xì)胞凋亡和壞死通常伴隨著氧化應(yīng)激^［35］，因此，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，通常會(huì)檢測(cè)到抗氧化活性指標(biāo)（如：SOD和GPx）的降低和氧化應(yīng)激活性指標(biāo)（MDA和ROS）的增加^［36］。本試驗(yàn)用H2O2、NaCl和高溫的最佳脅迫條件處理細(xì)胞后，與空白組和空載組相比，在CeyPRDX1過表達(dá)組中SOD1基因呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，而Caspase-3基因下調(diào)表達(dá)（圖7）。這表明，CeyPRDX1基因可能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，直接或間接調(diào)節(jié)抗氧化和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，降低ROS，進(jìn)而抵御氧化應(yīng)激反應(yīng)，但其詳細(xì)作用機(jī)制需要待進(jìn)一步的研究。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，通過多種相互作用在染色體穩(wěn)定性和遺傳完整性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并拮抗磷脂酰肌醇3-激酶/蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路參與細(xì)胞的凋亡和壞死^［37-38］。氧化應(yīng)激通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT通路來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞損傷，該通路是在氧化應(yīng)激過程中保護(hù)細(xì)胞存活的重要途徑^［39］。多項(xiàng)研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，產(chǎn)生的大量ROS可以激活PTEN，抑制PI3K/AKT通路的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死^［40-41］。PTEN水平與氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的細(xì)胞活力下降、SOD酶活性降低、ROS和MDA水平升高相關(guān)^［42］。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2、NaCl和高溫等脅迫條件下，空白組和空載組中ROS和MDA水平明顯高于CeyPRDX1過表達(dá)組和對(duì)照組（P＜0.001，圖 5和圖 6），PTEN和Caspase-3基因呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，而SOD1基因下調(diào)表達(dá)（P＜0.001，圖 7）?？梢钥闯?，細(xì)胞在氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的大量ROS促進(jìn)PTEN的表達(dá)，而上調(diào)表達(dá)的PTEN進(jìn)一步促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)，從而增加細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果與Jia等^［42］的研究報(bào)道相一致，此研究表明當(dāng)PTEN的表達(dá)降低時(shí)，可以升高SOD和 CAT 的水平，降低ROS和MDA含量。PTEN的負(fù)調(diào)控可以顯著提高PI3K/AKT的表達(dá)水平，從而有效防止細(xì)胞凋亡或壞死的發(fā)生^［39］。本研究中，與空白組和空載組相比，在CeyPRDX1過表達(dá)的細(xì)胞中SOD1基因上調(diào)表達(dá)，而PTEN和Caspase-3基因下調(diào)表達(dá)（圖 7）。因此，推測(cè)在氧化應(yīng)激條件下，CeyPRDX1的過表達(dá)可能通過促進(jìn)SOD1基因的表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，并隨著ROS的減少，PTEN的表達(dá)受到抑制。PTEN的下調(diào)表達(dá)可能降低Caspase-3基因的表達(dá)，進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率。然而在CeyPRDX1過表達(dá)的細(xì)胞中，PTEN基因的下調(diào)表達(dá)是否通過激活PI3K/AKT通路并對(duì)其他凋亡相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生影響需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在H2O2、NaCl和高溫等應(yīng)激條件下，在細(xì)胞中過表達(dá)CeyPRDX1基因能夠有效降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。其作用可能通過促進(jìn)SOD1基因的表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，并隨著ROS的減少，PTEN的表達(dá)受到抑制。PTEN的下調(diào)表達(dá)可能降低Caspase-3基因的表達(dá)，進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果初步揭示了，CeyPRDX1基因在塔里木馬鹿適應(yīng)極端干旱環(huán)境和耐受高鹽飲食的過程中可能起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。

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（編輯 郭云雁）