胚蛋給養(yǎng)核黃素對(duì)雞骨骼肌發(fā)育的影響

摘 要： 旨在研究核黃素（又稱(chēng)維生素B2，VB2）對(duì)雞胚胎骨骼肌發(fā)育的影響，以促進(jìn)其在胚胎給養(yǎng)中的應(yīng)用。本研究利用CCK-8、EdU和免疫熒光等檢測(cè)方法，鑒定添加不同濃度的VB2（1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1）對(duì)雞原代成肌細(xì)胞增殖和分化的影響，并通過(guò)在7胚齡雞胚卵黃囊部位注射不同濃度的VB2溶液（50、100 和200 μg），并設(shè)置0.9%的生理鹽水為對(duì)照組，檢測(cè)VB2對(duì)雞胚胎骨骼肌發(fā)育的影響，試驗(yàn)共分為4組，每組25個(gè)胚蛋。研究結(jié)果表明，在細(xì)胞水平添加不同濃度的VB2都不同程度的促進(jìn)了雞原代成肌細(xì)胞的增殖活力，但是6.25 μmol·L^-1 VB2為最佳添加濃度。此外，添加6.25 μmol·L^-1 VB2可顯著促進(jìn)增殖標(biāo)志基因CCND1（Plt;0.01）、PCNA（Plt;0.05）和CDK1（Plt;0.01）的表達(dá)，而對(duì)分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG和MYHC的表達(dá)無(wú)顯著影響（Pgt;0.05）；同時(shí)，EdU試驗(yàn)也證實(shí)了在細(xì)胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2可以顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖（Plt;0.05）。此外，雞胚卵黃囊部位注射VB2溶液試驗(yàn)表明注射50 μg VB2后顯著提高18胚齡雞胚胸肌組織中增殖標(biāo)志基因CDK1（Plt;0.01）、PCNA（Plt;0.001）及分化標(biāo)志基因MYOD（Plt;0.05）、MYOG（Plt;0.05）的表達(dá)水平；同時(shí)，50 μg VB2的添加也顯著增加了18胚齡雞胚胸肌肌纖維直徑（Plt;0.05）和胸肌重（Plt;0.05）。上述結(jié)果表明，VB2可促進(jìn)雞原代成肌細(xì)胞的增殖作用和雞胚的胸肌發(fā)育。因此，本研究結(jié)論表明VB2是影響雞胚胸肌發(fā)育的一個(gè)重要的營(yíng)養(yǎng)素，該研究為我國(guó)優(yōu)質(zhì)肉雞早期胚胎營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 核黃素；骨骼肌發(fā)育；雞；胚胎給養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：

S831.5"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1159-11

收稿日期：2024-10-03

基金項(xiàng)目：雞生長(zhǎng)性狀精準(zhǔn)評(píng)價(jià)與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)核心種質(zhì)創(chuàng)制 （SN01-2022-05）；重要農(nóng)業(yè)動(dòng)植物優(yōu)異性狀共性調(diào)控元件挖掘與基因資源設(shè)計(jì) （2023YFF1001100）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （GZC20233467）

作者簡(jiǎn)介：李遠(yuǎn)方（1991-），女，河南平頂山人，博士，主要從事畜禽資源分子評(píng)價(jià)的研究，E-mail： yuanfangli1991@163.com

*通信作者：劉翹銘，主要從事生物信息學(xué)研究，E-mail： cslqm@hit.edu.cn；李國(guó)喜，主要從事家禽遺傳育種的研究，E-mail： liguoxi0914@126.com；王丹丹，主要從事功能基因挖掘與利用的研究，E-mail： wangdd1993@126.com

The Effect of Riboflavin Supplementation in Embryonic Eggs on the Development of Skeletal Muscle of Chickens

LI" Yuanfang "ZHANG" Hongyuan^3，4， LI" Hongtai^3，4， LI" Zhi "WEI" Qianran "WANG" Yadong

LI" Guoxi^3，4*， WANG" Dandan^5*， LIU" Qiaoming^1，2*

（1.School of Medicine and Health， Harbin Institute of Technology， Harbin 150001，" China;

2.Zhengzhou Research Institute， Harbin Institute of Technology， Zhengzhou 450000，" China;

3.The Shennong Laboratory， Zhengzhou 450002，" China; 4.College of Animal Science and

Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China; 5.Institute of

Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effect of riboflavin （also known as vitamin B2， VB2） on the development of skeletal muscle in chicken embryos to promote its application in embryo feeding. The CCK-8， EdU， and immunofluorescence detection methods were used to identify the effects of adding different concentrations of VB2 （1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5 and 25 μmol·L^-1） on the proliferation and differentiation of chicken primary myoblasts. Different concentrations of VB2 solution （50， 100 and 200 μg） were injected into the yolk sac of 7 embryonic age chicken embryos， and a 0.9% saline control group was set up to detect the effect of VB2 on the development of skeletal muscle in chicken embryos. The experiment was divided into 4 groups， with 25 embryo eggs in each group. The results showed that adding different concentrations of VB2 at the cellular level promoted the proliferation activity of chicken primary myoblasts to varying degrees， but 6.25 μmol·L^-1 VB2 was the optimal addition concentration. In addition， adding 6.25 μmol·L^-1 VB2 significantly promoted the expression of proliferation marker genes CCND1 （Plt;0.01）， PCNA （Plt;0.05）， and CDK1 （Plt;0.01）， but had no significant effect on the expression of differentiation marker genes MYOD， MYOG， and MYHC （Pgt;0.05）; at the same time， EdU experiments also confirmed that adding 6.25 μmol·L^-1 VB2 at the cellular level could significantly promote the proliferation of myoblasts （Plt;0.05）. In addition， the experiment of injecting VB2 solution into the yolk sac of chicken embryos showed that the injection of 50 μg VB2 significantly increased the expression levels of proliferation marker genes CDK1 （Plt;0.01）， PCNA （Plt;0.001） and differentiation marker genes MYOD （Plt;0.05）， MYOG （Plt;0.05） in the breast muscle tissue of 18 embryonic age chicken embryos; at the same time， the addition of 50 μg VB2 also significantly increased the fiber diameter （Plt;0.05） and breast muscle weight （Plt;0.05） of the breast muscle of 18 embryonic age chicken embryos. The above results show that VB2 can promote the proliferation of chicken primary myoblasts and the development of the breast muscle of chicken embryos. Therefore， the VB2 is an important nutrient that affects the development of the breast muscle of chicken embryos. This study provides an important theoretical basis and application value for the early embryonic nutritional regulation of high-quality broilers in China.

Keywords： riboflavin; skeletal muscle development; chicken; embryonic nutrition

*Corresponding authors：" LIU Qiaoming， E-mail： cslqm@hit.edu.cn; LI Guoxi， E-mail： liguoxi0914@126.com; WANG Dandan， E-mail： wangdd1993@126.com

維生素是動(dòng)物體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以影響動(dòng)物的代謝、免疫和生長(zhǎng)發(fā)育，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育必不可缺的^［1-2］。核黃素又稱(chēng)維生素B2 （VB2），是動(dòng)物體不可缺少的維生素之一^［3-4］。核黃素可以參與生物氧化還原反應(yīng)^［5］以及能量代謝^［6］等過(guò)程，核黃素的缺乏可導(dǎo)致機(jī)體多種代謝障礙，其中最主要的就是生長(zhǎng)障礙^［7］。在人體上，有關(guān)于核黃素缺乏導(dǎo)致的肌肉萎縮研究，例如，Nimmo等^［8］研究發(fā)現(xiàn)SLC52A2和SLC52A3中的雙等位基因致病變異可能導(dǎo)致核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺乏，從而引起核黃素缺乏進(jìn)而導(dǎo)致肌肉無(wú)力、肌萎縮等，口服核黃素后可阻止疾病進(jìn)展并可能逆轉(zhuǎn)該癥狀。He等^［9］利用D-半乳糖誘導(dǎo)構(gòu)建的肌肉衰老大鼠模型鑒定到了核黃素生物合成和能量代謝等關(guān)鍵途徑的改變導(dǎo)致了骨骼肌的衰老。此外，通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加關(guān)鍵代謝物核黃素可促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。在雞上，目前只有日糧添加VB2對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育影響的報(bào)道，例如，Leiber等^［10］研究發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)日糧中添加4.0 mg·kg^-1 的VB2不會(huì)引起種雞或肉雞的任何健康或生產(chǎn)性能問(wèn)題，而每公斤飼料添加 2.5 mg 則會(huì)導(dǎo)致雞體重減少。根據(jù)生產(chǎn)性能和生化數(shù)據(jù)，快速生長(zhǎng)肉雞的日糧VB2需要量應(yīng)設(shè)定為5 mg·kg^-1［11］。此外也有大量關(guān)于雞核黃素結(jié)合蛋白的研究^［12］，在無(wú)法合成核黃素結(jié)合蛋白 （RfBP） 的母雞中，會(huì)產(chǎn)生缺乏核黃素的胚蛋，這些胚蛋中的胚胎在孵化后約第13天左右時(shí)死亡，伴有嚴(yán)重的低血糖和脂肪酸氧化受損^［13］。目前，維生素添加試驗(yàn)在雞活體水平已經(jīng)有大量的研究，表明VB2對(duì)雞生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要^［14］，但是目前缺乏關(guān)于VB2對(duì)機(jī)體分子水平影響的機(jī)制研究。

胚蛋給養(yǎng)是將外源營(yíng)養(yǎng)素或者外源活性物質(zhì)注射到孵化時(shí)期的家禽胚蛋中，從而達(dá)到促進(jìn)家禽胚胎期和孵化出殼后的健康生長(zhǎng)^［15］。在1982年，首次報(bào)道采用胚蛋注射技術(shù)將各種氨基酸混合物注射到8胚齡的胚胎卵黃囊中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射組可以顯著提高雞胚胎后期的發(fā)育，并促進(jìn)第56天雞的體重^［16］，該研究首次通過(guò)胚蛋注射為家禽胚胎提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為胚胎給養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)家先后進(jìn)行了大量的胚蛋給養(yǎng)研究，研究證實(shí)胚蛋給養(yǎng)維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)促進(jìn)雛雞機(jī)體免疫和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有顯著的效果。Zhu等^［17］分別在種蛋胚胎第11胚齡時(shí)注射生理鹽水和維生素C，在第19胚齡時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組對(duì)差異表達(dá)基因的功能富集表明，胚胎給養(yǎng)維生素C通過(guò)影響嘌呤核苷酸代謝通路和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)調(diào)節(jié)脾臟的發(fā)育和成熟。Sawosz等^［18］將肉雞種蛋隨機(jī)分為注射ATP組和未注射對(duì)照組，在孵化第20天時(shí)發(fā)現(xiàn)ATP注射組雞胚可促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 2 （FGF2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF） 以及 Na^（+）/K^（+） 轉(zhuǎn)運(yùn) ATP 酶 （ATP1A1） 的表達(dá)，這表明更多的能量來(lái)源可以增強(qiáng)肌肉細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

早期胚胎給養(yǎng)在投入較少成本的情況下可能獲得較大的收益，開(kāi)展?fàn)I養(yǎng)素胚胎給養(yǎng)的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值^［19］。目前國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)家已經(jīng)逐步開(kāi)展關(guān)于胚胎給養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)素對(duì)雞胚生長(zhǎng)發(fā)育的研究，VB2對(duì)于雞機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育十分重要^［20-21］，然而對(duì)于其在胚胎給養(yǎng)中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制研究相對(duì)缺乏。因此，關(guān)于VB2在雞胚胎水平的添加所引起的機(jī)體變化也亟待進(jìn)一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

所用胚蛋為AA肉雞商業(yè)化雞胚，購(gòu)買(mǎi)于開(kāi)封興達(dá)種雞場(chǎng)。

1.2 RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）

Trizol法提取雞原代成肌細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA，日本）試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)熒光定量用cDNA為模板，使用SYBR Green（TaKaRa，日本）染料進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板 1 μg，上、下游引物各 0.2 μmol·L^-1，RNase Free dH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，循環(huán) 40 次。雞的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，用 2^{-△△CT［22］}方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 雞原代成肌細(xì)胞的分離、純化和鑒定

1.3.1 雞原代成肌細(xì)胞的分離

按標(biāo)準(zhǔn)孵化方法孵化胚蛋至11胚齡，胚蛋表面用75%乙醇消毒后超凈臺(tái)紫外照射30 min以上，用無(wú)菌鑷子在胚蛋鈍端敲開(kāi)蛋殼，去除氣室上部蛋殼帽后，換另一個(gè)新的無(wú)菌鑷子去除氣室卵殼膜，用無(wú)菌眼科鑷子夾取胚胎移到已加PBS（含1%雙抗）溶液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中；用鑷子輕輕剝開(kāi)腿部皮膚，沿雞胚腿根部剪下腿部后放進(jìn)完全培養(yǎng)基（含1%雙抗+20%血清）中，仔細(xì)分離肌肉，去除骨骼，將分離后的肌肉放進(jìn)新加了完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；用鑷子小心去除軟骨，轉(zhuǎn)移肌肉組織到無(wú)菌1.5 mL的離心管中，將組織剪碎后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌50 mL離心管中；在漩渦振蕩器上高速震蕩混合1 min后放置試管架上，靜置后吸取上清液，經(jīng)200目尼龍膜細(xì)胞篩過(guò)濾至100 mL小燒杯中；加入8～10 mL完全培養(yǎng)基重懸管內(nèi)組織，再次過(guò)濾，重復(fù)3～4次直至上清液呈透亮沒(méi)有懸浮細(xì)胞為止;用1 000～1 200 g離心機(jī)離心上述所得細(xì)胞液5 min，重復(fù)一次，棄上清；用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.2 雞原代成肌細(xì)胞的純化

利用差速貼壁法對(duì)成肌細(xì)胞進(jìn)行純化。將上述獲得的細(xì)胞培養(yǎng)40 min后，把上清液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)兩次，以消除成纖維細(xì)胞。成肌細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，每天注意觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞達(dá)90%以上的密度時(shí)即可進(jìn)行傳代或鋪板。

1.3.3 雞原代成肌細(xì)胞的鑒定

采用肌肉細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的desmin蛋白的免疫熒光來(lái)鑒定雞胚分離的雞成肌細(xì)胞的純度，具體步驟如下所示（以24孔細(xì)胞板為例）：待細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1～3次；加4%冷的甲醛固定液，20 min后棄去固定液，PBS洗1～3次；加0.1% TritonX×100破膜液，10 min后棄去破膜液，PBS洗1～3次；加與二抗宿主相同的血清封閉1 h，或者4% BSA封閉1 h，200 μL·孔^-1；棄去封閉液，加desmin一抗，4 ℃過(guò)夜，注意細(xì)胞板保持水平，棄去desmin，PBS洗1～3次；加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h，棄二抗，PBS洗1～3次；加入1 μg·mL^-1的DAPI孵育細(xì)胞1 min，棄DAPI，PBS洗1～3次；在倒置熒光顯微鏡中觀察，有熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞的90%以上，則純度滿(mǎn)足要求，即可進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1.4 CCK-8和EdU檢測(cè)

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，步驟參考Cell Counting Kit-8 （美侖，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)。用EdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)量，步驟參考廣州市銳博生物有限公司的EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)（成像檢測(cè)）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

1.5 MYHC免疫熒光檢測(cè)

試驗(yàn)步驟與“1.3.3”相同，加入的一抗為anti-MYHC antibody （B103；DHSB， 美國(guó)），二抗為anti-mouse IgG FITC-conjugated antibody（bs-0296G-FITC；Bioss， 北京， 中國(guó)）。

1.6 雞原代成肌細(xì)胞的VB2處理試驗(yàn)

細(xì)胞水平添加維生素B2（Sigma，德國(guó)），其分子量為376.36，在常溫下，中性和偏酸性溶液中，核黃素的溶解度很低，通常不超過(guò)250 mg·L^-1（660 μmol·L^-1）。在成肌細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)添加5個(gè)不同梯度的VB2溶液，參考He等^［9］的研究設(shè)置添加濃度，分別設(shè)置為1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1，并設(shè)置培養(yǎng)基添加為對(duì)照組，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)收細(xì)胞。

1.7 雞胚胎注射給養(yǎng)VB2試驗(yàn)

在雞胚胎時(shí)期于胚胎中注射不同濃度的維生素B2溶液，觀察維生素B2對(duì)雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響。每只雞胚注射維生素B2溶液體積為0.1 mL，注射部位為卵黃囊。

VB2溶液配制：參考White等^［23］的研究設(shè)置VB2溶液注射劑量，將VB2溶解在生理鹽水中，分別配制成每100 μL生理鹽水含50、100和200 μg的VB2溶液，設(shè)置生理鹽水為對(duì)照組，試驗(yàn)共分為4組，每組25個(gè)重復(fù)，共100枚蛋。

種蛋孵化第7天進(jìn)行注射，注射前先照蛋，剔除死胚蛋和無(wú)精蛋，并測(cè)量蛋重。同時(shí)確定胚胎位置，在氣室下方進(jìn)行打孔。注射前用75%酒精擦拭注射位置并對(duì)周?chē)M(jìn)行消毒，注射針頭和管徑要適中。一枚蛋換一個(gè)針頭，注射完用蠟封口立刻放回孵化箱。

在18胚齡時(shí)測(cè)量蛋重、雞胚重、腿肌重和胸肌重，另外每組挑選3只雞胚的胸肌組織制作切片檢測(cè)肌纖維直徑和面積。用VB2酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)胸肌組織中VB2含量。

1.8 雞胚胸肌石蠟切片制作和HE（蘇木素-伊紅）染色

將18胚齡雞胚的胸肌肌肉組織制作石蠟切片，經(jīng)4%甲醛溶液固定24 h以上，之后進(jìn)行洗滌和脫水12 h，石蠟包埋和切片、展片、貼片后進(jìn)行脫蠟和蘇木精-伊紅染色，再水洗和分化以及漂洗和脫水后再?gòu)?fù)染，之后再進(jìn)行脫水和透明處理，最后封藏后成片。用系統(tǒng)生物顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

目的基因的相對(duì)表達(dá)量用2^-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，雞的GAPDH基因作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。采用SPSS 20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t-test分析，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，Plt;0.05 表示差異顯著（用*表示），Plt;0.01 表示差異極顯著（用**表示），Plt;0.001 表示差異極顯著（用***表示），Pgt;0.05時(shí)表示無(wú)顯著性差異，結(jié)果使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行作圖，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 （mean±SEM）”。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度VB2添加后對(duì)雞原代成肌細(xì)胞增殖活力的影響

本研究首先鑒定了分離的雞原代成肌細(xì)胞的純度，在培養(yǎng)48 h時(shí)對(duì)雞原代成肌細(xì)胞進(jìn)行了Desmin染色，免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的成肌細(xì)胞純度很高（圖1A），可以進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。為了檢測(cè)不同濃度的VB2對(duì)成肌細(xì)胞增殖活力的影響，共設(shè)置6個(gè)濃度梯度，分別為0、1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1，檢測(cè)了不同添加濃度對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響（圖1B）。結(jié)果表明，VB2添加量為6.25和12.5 μmol·L^-1時(shí)，在12、24和48 h均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞增殖活力；在36 h時(shí)添加量為3.125 μmol·L^-1 VB2組細(xì)胞表現(xiàn)出最高的增殖活力；1.562 5 μmol·L^-1 VB2添加組細(xì)胞增殖活力雖然不是最高，但是與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活力在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高（Plt;0.05）；然而25 μmol·L^-1 VB2添加組在12和24 h時(shí)與對(duì)照組相比顯著升高（Plt;0.05），在36和48 h時(shí)與對(duì)照組相比顯著降低（Plt;0.05）。因此，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6.25和12.5 μmol·L^-1 VB2添加組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高（Plt;0.05），在12、24和36 h時(shí)，6.25和12.5 μmol·L^-1 VB2添加組之間細(xì)胞活性差異不顯著（Pgt;0.05），在48 h時(shí)6.25 μmol·L^-1添加組細(xì)胞活性最高且與12.5 μmol·L^-1添加組相比差異顯著（Plt;0.05），因此6.25 μmol·L^-1添加組和12.5 μmol·L^-1添加組對(duì)細(xì)胞增殖活力的促進(jìn)作用均較好，本研究選擇了較小VB2添加量6.25 μmol·L^-1進(jìn)行下一步研究。

2.2 細(xì)胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞增殖的影響

本研究通過(guò)檢測(cè)在成肌細(xì)胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后增殖標(biāo)志基因的變化從而檢測(cè)VB2對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響（圖2A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增殖標(biāo)志基因CCND1（Plt;0.01）、CDK1（Plt;0.05）和PCNA（Plt;0.01）均顯著升高，這些結(jié)果證明VB2可能影響細(xì)胞增殖，因此接下來(lái)進(jìn)一步研究了VB2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。在細(xì)胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后進(jìn)行EdU檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后細(xì)胞增殖數(shù)量顯著增加（Plt;0.05）（圖2B）。因此，以上結(jié)果說(shuō)明添加6.25 μmol·L^-1 VB2可以促進(jìn)雞原代成肌細(xì)胞的增殖。

2.3 細(xì)胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞分化的影響

本研究檢測(cè)了VB2添加對(duì)雞原代成肌細(xì)胞分化的影響。首先在成肌細(xì)胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后檢測(cè)分化標(biāo)志基因的變化（圖3A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG和MYHC的變化均不顯著（Pgt;0.05），MYHC蛋白表達(dá)水平變化也不顯著（Pgt;0.05）（圖3B）。在成肌細(xì)胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后又進(jìn)行MYHC免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后細(xì)胞分化沒(méi)有明顯變化（Pgt;0.05）（圖3C）。

2.4 雞胚胎注射不同濃度VB2溶液后對(duì)雞胚胎骨骼肌發(fā)育的影響

上述結(jié)果表明，VB2可以增加成肌細(xì)胞的增殖活性，為了研究VB2對(duì)雞活體肌肉發(fā)育的影響，本研究進(jìn)一步在胚胎卵黃囊中（圖4A）注射不同濃度（50、100和200 μg·只^-1）的VB2，對(duì)照組注射0.9%的生理鹽水。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射50 μg時(shí)，體內(nèi)VB2含量顯著升高（Plt;0.05），100 μg時(shí)達(dá)到極顯著升高水平（Plt;0.001），但是在注射200 μg時(shí)變化并不顯著（Pgt;0.05）（圖4B）。本研究又檢測(cè)了不同濃度VB2的添加對(duì)胚胎體重、腿肌重和胸肌重的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度水平VB2的添加并未對(duì)胚胎體重產(chǎn)生顯著影響（Pgt;0.05）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)7胚齡（注射前）和18胚齡（注射后）的蛋重，以及胚胎腿肌重和胸肌重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與注射生理鹽水對(duì)照組相比，只有在50和200 μg VB2添加組中胸肌重顯著升高（Plt;0.05），蛋重和腿肌重變化均不顯著（Pgt;0.05）（圖4C）。

2.5 雞胚胎注射50 μg VB2后對(duì)骨骼肌肌纖維發(fā)育的影響

為了進(jìn)一步研究VB2對(duì)雞骨骼肌肌纖維發(fā)育的影響，本研究又檢測(cè)了VB2注射后胚胎胸肌組織增殖和分化標(biāo)志基因的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞水平相似，CDK1（Plt;0.01）和PCNA（Plt;0.001）顯著升高，CCND1升高，但是變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5A）。與細(xì)胞水平不同的是，MYOD和MYOG也顯著升高（Plt;0.05），MYHC變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5B）。說(shuō)明在胚胎注射VB2后，影響了活體胸肌肌肉組織的細(xì)胞增殖和分化過(guò)程。接下來(lái)本研究又檢測(cè)了VB2的添加對(duì)胚胎肌纖維發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加50 μg的VB2顯著促進(jìn)了雞胚胸肌肌纖維直徑（圖5C）（Plt;0.05），腿肌肌纖維變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5D）。

3 討 論

核黃素 （也是VB2） 作為嘌呤核苷酸代謝通路的下游代謝物，是機(jī)體新陳代謝中的一個(gè)重要成分，它與動(dòng)物體內(nèi)脂肪、碳水化合物以及氨基酸代謝有著密切的關(guān)系，VB2作為微量元素添加劑，具有提高飼料利用率， 促進(jìn)家禽正常生長(zhǎng)發(fā)育的作用^［24-25］。飼料中的核黃素易被吸收，核黃素在生物體內(nèi)的積蓄量并不多，大多隨尿液排出體外^［26］。Summers等^［27］在雞日糧中補(bǔ)充了11種維生素混合物，然后在每個(gè)處理組中去掉其中1種維生素，進(jìn)而研究哪個(gè)維生素對(duì)雞只的生長(zhǎng)發(fā)育影響最大，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究的11種維生素中，只有缺少VB2組會(huì)顯著降低雞3周齡的體重，VB2缺乏還會(huì)導(dǎo)致高比例的雞只癱瘓。此外，當(dāng)VB2缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致多種代謝障礙。家禽自身不能合成VB2，極易缺乏，缺乏時(shí)癥狀表現(xiàn)為肌肉無(wú)力麻痹和大腿肌肉萎縮等^［7］。這些研究暗示VB2可能對(duì)于肌肉發(fā)育具有重要的影響作用，但是目前尚未見(jiàn)有關(guān)VB2影響雞骨骼肌發(fā)育的機(jī)制研究。骨骼肌肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程需要成肌細(xì)胞的增殖和分化^［28］，本研究表明在成肌細(xì)胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后可以顯著增加細(xì)胞增殖活力，并且發(fā)現(xiàn)添加VB2后增殖標(biāo)志基因CCND1、CDK1和PCNA均顯著升高，分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG和MYHC變化不顯著，說(shuō)明VB2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞的分化沒(méi)有顯著影響。EdU試驗(yàn)也進(jìn)一步印證了VB2可以促進(jìn)細(xì)胞增殖的推測(cè)。成肌細(xì)胞增殖是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)^［29］，為了驗(yàn)證VB2對(duì)活體水平骨骼肌發(fā)育的作用，并更好的利用VB2進(jìn)行家禽早期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，本研究進(jìn)行了VB2胚蛋給養(yǎng)試驗(yàn)。

胚蛋注射給養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)素是調(diào)控家禽早期營(yíng)養(yǎng)的有效手段^［30］，但是目前還處于探索階段，尋找高效的外源性營(yíng)養(yǎng)素并闡明其調(diào)控胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。胚蛋注射營(yíng)養(yǎng)素的時(shí)期、部位以及注射劑量都需要十分精確，這樣才能保證注射效果且不影響孵化率。雞胚12胚齡前主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)自卵黃囊，因此卵黃囊的注射期在12胚齡前^［31］，此外，雞胚的生長(zhǎng)發(fā)育主要在8～18胚齡之間^［32］。有研究發(fā)現(xiàn)，7胚齡給養(yǎng)β-羥基-β-甲基丁酸效果優(yōu)于18胚齡，證明一些營(yíng)養(yǎng)素更適于禽胚的早期利用^［15］。因此，本研究選擇7胚齡注射不同濃度VB2溶液，在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的末期18胚齡時(shí)進(jìn)行蛋重、體重、腿肌重、胸肌重以及增殖、分化標(biāo)志基因表達(dá)變化的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著注射濃度的添加，雞胚體內(nèi)的VB2含量也顯著增加，但是添加200 μg時(shí)VB2含量變化并不顯著，其平均水平與添加50 μg組相似。機(jī)體貯存過(guò)多或補(bǔ)充過(guò)量VB2會(huì)造成吸收率下降^［33］，因此本研究表明每只胚蛋VB2的添加劑量不宜超過(guò)100 μg，以免造成營(yíng)養(yǎng)素的浪費(fèi)和對(duì)雞胚吸收造成負(fù)擔(dān)。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VB2的添加并沒(méi)有改變18胚齡時(shí)的胚蛋重、胚胎重和腿肌重，但是注射50 μg VB2添加組和200 μg VB2添加組的胸肌重與注射生理鹽水對(duì)照組相比顯著升高。汪張貴等^［34］的研究具有相似的結(jié)果，不同水平的核黃素添加能夠增加雛雞部分免疫器官的重量，但對(duì)其體重?zé)o明顯影響，這可能與添加劑量、遺傳背景、品種特性及應(yīng)激等多種因素有關(guān)。此外，VB2添加對(duì)腿肌重?zé)o顯著影響，而胸肌和腿肌在表型上的差異可能源于胚胎發(fā)育后期兩者生長(zhǎng)速度的不同所導(dǎo)致^［35］。Hughes^［36］研究表明，過(guò)量添加VB2對(duì)于機(jī)體生長(zhǎng)并無(wú)下降的影響，但由于添加200 μg組與50 μg組的VB2吸收率一樣，因此本研究試驗(yàn)結(jié)果表明每只胚蛋給養(yǎng)VB2的最適劑量為50 μg。此外，50 μg VB2添加組胸肌肌纖維直徑也顯著升高。本研究進(jìn)一步檢測(cè)增殖和分化標(biāo)志基因的表達(dá)變化，進(jìn)而探索VB2促進(jìn)胸肌發(fā)育表型背后的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞水平結(jié)果相似，50 μg VB2添加組增殖標(biāo)志基因CDK1和PCNA顯著升高。已有研究表明CDK1在成肌細(xì)胞增殖階段高度表達(dá)，具有促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖的作用^［37］，PCNA作為一種參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期的S期表達(dá)量最大，是細(xì)胞增殖的分子標(biāo)記^［38］。但是與細(xì)胞水平不同的是分化標(biāo)志基因MYOD和MYOG也顯著升高，MYHC變化不顯著。MYOD作為一種骨骼肌特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子^［39］，與MYOG共同作用，在肌肉發(fā)育和再生過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)肌肉生成的關(guān)鍵作用，是重要的成肌調(diào)節(jié)因子^［40］，因此，這些基因的變化可能是導(dǎo)致活體水平肌纖維變化的原因。此外，推測(cè)與細(xì)胞水平存在的差異一方面是不同水平所添加的VB2劑量的不同，另一方面可能由于作用時(shí)間的不同所導(dǎo)致。本研究結(jié)果表明，VB2具有顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖的作用，這為肌纖維在活體水平的形成提供了重要基礎(chǔ)。因此，本研究深入解析了VB2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞增殖、分化以及胚胎胸肌發(fā)育影響的分子機(jī)制，為肉雞分子營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制提供研究思路。

4 結(jié) 論

本研究明確了在細(xì)胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2促進(jìn)雞原代成肌細(xì)胞增殖的作用。此外，在胚胎水平添加50 μg VB2可以顯著增加雞胚胸肌重和肌纖維直徑。本試驗(yàn)為我國(guó)優(yōu)質(zhì)肉雞分子營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制研究提供了重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯 郭云雁）