基于轉錄組測序技術鑒別影響萊蕪豬滴水損失的關鍵基因

摘 要： 旨在篩選影響萊蕪豬滴水損失的關鍵基因，以提高豬肉質品質并減少滴水帶來的經濟損失。本研究選取胴體重為（72.30±1.26） kg的28頭萊蕪豬（公豬19頭，母豬9頭），測定48 h滴水損失、肉色、肌內脂肪含量和pH等肉質性狀，并進行背最長肌組織的轉錄組測序。利用滴水損失極端個體（每組各3頭公豬，1頭母豬），在log2（差異倍數）≥1且校正后P≤0.01的篩選標準下，篩選差異表達基因。結合差異基因與表型的相關分析和蛋白互作分析進一步鑒別影響萊蕪豬滴水損失的關鍵候選基因。結果發(fā)現，萊蕪豬滴水損失與肌內脂肪含量以及1 h和24 h肉色a*值呈顯著負相關（Plt;0.05）。滴水損失高、低組間共篩選到166個差異表達基因，這些基因顯著富集在與血管系統發(fā)育與功能、細胞骨架與運動、蛋白質調控與功能等相關的GO條目和通路中。在28個個體中的相關性分析發(fā)現，差異表達基因中有110個基因與滴水損失呈顯著相關（Plt;0.05），前10位顯著相關的差異表達基因包含了KLF2和IGF2等功能上與滴水損失密切相關的基因。進一步的蛋白互作分析發(fā)現，差異表達基因中UBR1和TTBK2所表達的蛋白與其它蛋白存在最多的互作，其基因mRNA表達量與滴水損失顯著相關（Plt;0.05），且已報道的基因功能也與滴水損失密切相關。因此，結合差異表達基因分析、相關性分析和蛋白互作分析將KLF2、IGF2、UBR1和TTBK2作為影響滴水損失的重要候選基因。本研究為豬滴水損失分子機制的解析奠定基礎，也為豬肉質性狀改良提供了重要借鑒。

關鍵詞： 萊蕪豬；滴水損失；RNA測序；肉質性狀；候選基因

中圖分類號：

S828.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1134-13

收稿日期：2024-10-08

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（2022LZGCQY007；2022LZGC003）；山東省生豬產業(yè)技術體系（SDAIT-08-03）；山東省自然科學基金（ZR2024MC064）

作者簡介：賈萬里（1996-），男，河南駐馬店人，碩士生，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究，E-mail：3311896682@qq.com

*通信作者：趙雪艷，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：zhaoxueyan0102@163.com；張傳生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：cszhang1976@126.com

Identification of Key Genes Affecting Drip Loss in Laiwu Pigs Based on Transcriptome

Sequencing Technology

JIA" Wanli "WANG" Jiying2， LI" Jingxuan2， WANG" Yanping2， GENG" Liying1，

ZHANG" Chuansheng^1*， ZHAO" Xueyan^2*

（1.College of Animal Science and Technology， Hebei Normal University of Science amp;

Technology， Qinhuangdao 066600，" China; 2.Key Laboratory of Livestock and Poultry

Multi-omics of Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shandong Key Laboratory of Animal Disease

Control and Breeding， Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，

Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，" China）

Abstract：" This study aimed to identify key genes affecting drip loss in Laiwu pigs to improve pork quality and reduce economic loss caused by drip. Twenty-eight Laiwu pigs， including 19 boars and 9 sows with carcass weight of （72.30±1.26） kg， were selected as experimental animals. The meat quality traits， including 48 h drip loss， meat color， intramuscular fat content， and pH， were measured. RNA sequencing was conducted on the longissimus dorsi muscle tissue of these pigs. Then， differentially expressed genes （DEGs） were detected based on the criteria of log2（fold change）≥1 and an adjusted P≤0.01 between groups with high and low drip loss. Each group included three boars and one sow. By combining correlation analysis between DEGs and drip loss， as well as protein-protein interaction （PPI） analysis， the candidate genes influencing drip loss in Laiwu pigs were further identified. The results indicated that drip loss was significantly negatively correlated with the intramuscular fat content and the a* value of meat color at both 1 h and 24 h post-mortem （Plt;0.05） in Laiwu pigs. A total of 166 DEGs were identified between the high and low drip loss groups. These DEGs were significantly enriched in Gene Ontology （GO） terms and pathways related to cardiovascular system development and function， cytoskeleton and motility， and protein regulation and function. Correlation analysis using the 28 individuals revealed that 110 of the 166 DEGs were significantly correlated with drip loss （Plt;0.05）. Among the top ten of the most significantly correlated DEGs， two genes， KLF2 and IGF2， were identified， whose functions were reported to be related to drip loss. Furthermore， PPI analysis of DEGs identified two proteins， which were encoded by UBR1 and TTBK2， having the highest number of interactions with other proteins， and the mRNA expression levels of the two genes were significantly correlated with drip loss （Plt;0.05）. These gene functions were also reported closely related to drip loss in previous studies. Therefore， by combining the results of DEG analysis， correlation analysis， and PPI analysis， KLF2， IGF2， UBR1 and TTBK2 were identified as candidate genes affecting drip loss. This study lays the ground for elucidating the molecular mechanisms underlying the drip loss in pigs and offers valuable insights for the improvement of meat quality traits in pigs.

Keywords： Laiwu pig; drip loss; RNA sequencing; meat quality traits; candidate genes

*Corresponding authors：ZHAO Xueyan， E-mail： zhaoxueyan0102@163.com; ZHANG Chuansheng， E-mail： cszhang1976@126.com

滴水損失（drip loss，DL）是指在豬只屠宰后，肌肉組織經歷一系列生理狀態(tài)變化，導致其對水分的束縛能力減弱，部分水分在重力作用下發(fā)生自然且緩慢的滲出，最終造成肌肉重量減少的現象。該指標作為衡量豬肉品質的重要參數，反映了豬肉的保水能力，也與豬肉的風味、營養(yǎng)成分、顏色等感官品質和食用品質密切相關^［1］。肌肉組織中的汁液滲出后，細胞中一些可溶性色素和蛋白質也會隨之流出，進而影響肉質的感官品質，降低消費者的購買欲望^［2］。同時，豬肉滲出汁液中也包含了糖、游離氨基酸、小分子肽、肌苷酸和硫胺素等肉質風味相關物質^［3］，影響了肉品的風味和口感。另外，較高的DL也降低了肉品加工品質，不僅直接影響生豬屠宰和銷售企業(yè)的經濟效益，也給肉類加工業(yè)造成損失。我國主要養(yǎng)殖的瘦肉型豬種中，杜洛克、長白和大約克的DL分別為2.01%、2.87%和2.62%，占據我國豬肉市場90%以上的杜長大三元雜交商品豬的DL在1.7%～3.35%左右^［4-8］。中國作為豬肉生產和消費大國，2023年我國累計生產豬肉5 794萬噸^［9］，按照2.59%的DL進行估算，也意味著將近有150萬噸的豬肉損耗。因此，降低DL無疑成為了豬肉產業(yè)中一個值得重視并需要著手解決的問題。

DL受多方面因素影響，如品種、營養(yǎng)、屠宰方式和應激等。在遺傳方面，DL作為數量性狀，受到多個數量性狀位點（quantitative trait locus， QTL）的控制。根據pigQTLdb的數據顯示，現已定位了1 091個顯著影響豬DL的QTL。Liu等^［10］通過全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）在豬4號染色體上發(fā)現與二花臉豬DL最強關聯的SNP為ss131261254。通過QTL定位研究，目前發(fā)現了通過影響糖酵解和pH而影響DL的關鍵基因PHKG1和PRKAG3及其調控突變^［11-12］。隨著測序技術的發(fā)展，RNA測序（RNA sequencing， RNA-seq）作為一種基于二代測序技術（next-generation sequencing， NGS）的高通量分析方法，可用于研究生物體在特定狀態(tài)下的所有轉錄本的集合，是研究復雜性狀基因表達與互作的有效方法。在對豬DL性狀的研究中，通過RNA-seq已取得重要進展。Li等^［13］通過皮特蘭×杜洛克×長白×大約克雜交商品豬群體中的DL高、低組RNA-seq分析，鑒定出150個差異表達基因，并結合QTL數據庫比對分析，將TRDN和MSTN基因作為影響DL的關鍵候選基因。

萊蕪豬是我國地方品種之一，有“中國華北第一豬”稱號，其肉質品質優(yōu)良，是優(yōu)質豬肉生產的首選品種。本團隊以及其他研究團隊均發(fā)現萊蕪豬DL存在較大變異，變異系數高達74.92%^［8］。而目前發(fā)現的影響萊蕪豬DL的關鍵基因仍十分有限，尚未見利用RNA-seq技術開展萊蕪豬DL研究的報道。因此，本研究選取萊蕪豬作為試驗對象，探討DL與其它肉質性狀的相關性；并利用RNA-seq技術篩選DL表型極端個體的差異表達基因；結合基因表達量與表型的相關性分析、蛋白互作分析等，進一步鑒別影響DL的關鍵候選基因，為降低豬肉DL、提高豬肉品質奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中28頭萊蕪豬試驗豬來源于濟南市萊蕪豬種豬繁育有限公司，其中閹割公豬19頭，母豬9頭。豬只在相同環(huán)境、飲水和日糧等飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，當體重約100 kg左右，送往濟南市東晟肉食品加工廠進行屠宰。屠宰后于左側胴體胸腰椎結合處取背最長肌樣本0.2 g放于液氮中保存，用于RNA測序；按照《NY/T 821—2019豬肉品質測定技術規(guī)程》^［14］，取腰薦結合處背最長肌，完成1 h肉色和pH等肉質指標的現場檢測后，低溫（0～4 ℃）條件下將肉樣帶回山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室進行后續(xù)48 h滴水損失、24 h肉色和pH等肉質性狀的測定。

1.2 表型測定

豬只屠宰放血后，經煺毛，去除頭、蹄、尾和內臟，劈半后，根據《NY/T 825—2004 瘦肉型豬胴體性狀測定技術規(guī)范》^［15］進行豬胴體重的測定。DL、肉色、pH等肉質性狀的測定參照《NY/T 821—2019豬肉品質測定技術規(guī)程》^［14］進行操作。具體步驟如下：豬只屠宰后，根據背最長肌的肌纖維方向，切取4個2 cm×2 cm×2 cm的組織塊，記錄初始重量m1；順肌纖維直徑方向將組織塊放于DL測定管中，于4 ℃靜置48 h；用濾紙吸干組織表面殘留水分，測量組織塊重量m2；利用公式［（m1－m2）/m2］×100%計算DL，取4個組織塊的平均值作為最終DL48 h值。針對肉色性狀，在屠宰后45～60 min內，取厚度為2～3 cm的背最長肌樣本，用Minolta CR-300色差儀（Konica Minolta）檢測樣品3個不同部位的紅度（redness， a*）、黃度（yellowness， b*）和亮度（lightness， L*），求取平均值作為該個體肉色指標a*1、b*1和L*1；將樣品放置于0～4 ℃保存，屠宰后24 h±15 min采用同樣的方法測定肉色，記為a*24、b*24和L*24。在肉色測定的相同時間點，利用BPH-7100 pH計（貝爾分析儀器）測量背最長肌肉糜樣品的pH，取3次測量平均值作為該樣本后1 h和24 h的pH，記為pH1 h和pH24 h。

肌內脂肪（intramuscular fat， IMF）含量的測定根據《GB 5009.6—2016食品安全國家標準食品中脂肪的測定》^［16］的要求，利用索氏抽提法測定IMF含量。首先利用去除筋膜的背最長肌肉糜樣品，置于瓷盤內攤平，于65 ℃烘干至恒重，烘干前后差值占烘干前重的百分比作為樣品的風干水分含量（W0）；烘干后肉樣研碎至粉末，取約0.5 g包于濾紙中（W1），102 ℃烘干至恒重（W2）；而后將濾紙包放入索氏抽提器中，加入無水乙醚抽提6～7 h（6～8次·h^-1）；抽提結束后，102 ℃烘干至恒重（W3）；利用公式［（W2－W3）/W2］×（1－W0）×100%計算IMF含量。

1.3 背最長肌組織RNA提取及文庫構建測序

采用Trizol法提取背最長肌組織中的總RNA，使用NanoDrop2000和Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA總量和完整性。通過Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，使用NEBNext Ultra^TM II RNA 非鏈特異性文庫制備試劑盒（NEB）進行文庫構建。建庫后，先使用Qubit2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）進行初步定量，利用Agilent2100 bioanalyzer對文庫的insertsize進行檢測，并通過qPCR進行準確定量；最終于Illumina測序平臺開展150 bp雙端測序。建庫及測序工作均由北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.4 轉錄組數據質控、比對和組裝

為了保證數據分析的質量及可靠性，需要對測序后原始數據進行過濾。去除含有接頭、堿基信息不明及低質量reads，得到clean reads。通過錯誤率e計算堿基質量值QPhred（QPhred=－10log10（e）），檢查clean reads中Phred數值大于20（Q20）和30（Q30）的堿基占總堿基的百分比，以及GC含量，保證clean reads數據的可靠性。使用HISAT2 v2.0.5構建Sscrofa11.1參考基因組的索引，將clean reads與參照基因組比對；使用StringTie進行新基因預測和轉錄本組裝。利用Feature Counts計算映射到每個基因的讀數，并根據基因長度計算每個基因的FPKM值（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments， FPKM）。

1.5 差異基因篩選及功能富集分析

篩選DL表型極端的個體，然后利用DESeq2^［17］，以校正后P≤0.01且log2差異倍數（Fold change， FC）≥1為篩選標準篩選滴水損失DL高、低組間差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）。利用Cluster Profiler（3.4.4）^［18］安裝包對差異表達基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，以Plt;0.05篩選顯著富集的GO條目和通路。

1.6 蛋白互作分析

利用在線軟件STRING 12.0（https：//cn.string-db.org/）構建DL差異表達基因的蛋白互作網絡，分析參數選用軟件默認值。利用Cytoscape （V3.9.1）軟件（https：//cytoscape.org/）對蛋白互作網絡進行可視化。

1.7 數據統計分析

使用R語言的cor（）函數和cor.Test（）函數，對DL與肉色、pH和IMF含量等肉質指標進行Pearson相關性分析和相關顯著性檢驗；并利用28頭萊蕪豬的轉錄組數據進行差異表達基因的表達量與DL的相關性分析，在相關性Plt;0.05的閾值下篩選差異表達基因中與DL顯著相關的基因。

2 結 果

2.1 萊蕪豬表型統計分析

本研究測定了28頭萊蕪豬樣本（閹割公豬19頭，母豬9頭）的肉質指標。結果發(fā)現，DL48 h平均值為（1.44±0.14）%，最小值為0.49%，最大值為3.97%，變異系數為52.17%，表明不同個體間DL48 h存在較大差異。除DL48 h外，IMF含量也表現出較大的表型變異，變異系數為48.20%；肉色、pH等其他肉質性狀表型變異較小，具體數據詳見表1。

為探討DL與其它肉質性狀的相關性，對28頭萊蕪豬的肉質性狀數據進行了相關性分析，結果發(fā)現DL48 h與a*1和IMF含量呈極顯著負相關（r=－0.570，P=0.001 6；r=－0.503，P=0.006 4），與a*24呈顯著負相關（r=－0.451，P=0.016 0），與其它肉質性狀未呈現顯著相關性（圖1）。

2.2 轉錄組數據質控及基因組比對分析

對28頭萊蕪豬個體進行RNA-seq分析（表2），每個個體平均得到45 781 549.43個raw reads，經質控后得到44 329 938.71個clean reads，比對到參考基因組上的比對率在92.63%～96.65%之間，其中比對到唯一位置的reads數百分比在89.71%～93.04%之間；測序數據Q20值在97.14%～98.47%之間，Q30值在92.50%～95.74%之間，測序結果準確可靠，可用于后續(xù)分析。

2.3 滴水損失高、低組間差異表達基因篩選

考慮胴體重、性別等因素，從28頭測定豬中篩選出DL高（DL-H）、低（DL-L）兩組個體各4頭進行背最長肌差異表達基因篩選（表3）。每組包含3頭公豬，1頭母豬，其胴體重分別為（65.68±2.02）kg和（73.34±3.10）kg，組間差異不顯著（Pgt;0.05）。DL-L組DL平均為（0.61±0.07）%，DL-H平均為（2.88±0.37）%，兩組間差異極顯著（P=0.007 6）。因在本研究群體中DL48 h與a*1、a*24和IMF含量存在顯著相關性（Plt;0.05），故除了DL48 h性狀外，DL-H和DL-L兩組的a*1、a*24和IMF含量也存在顯著差異。

在log2 FC≥1且校正后P≤0.01的閾值下，對DL-H和DL-L兩組進行差異表達基因篩選，共篩選到166個差異基因，相對DL-L，DL-H有104個基因表達上調，62個基因表達下調（圖2A）。聚類分析發(fā)現，這些差異表達基因在組內呈現相同的表達趨勢，在組間表達趨勢相反（圖2B）。表4顯示了表達差異最顯著的前10位基因，其中包含與肌肉發(fā)育密切相關的MTPN和KANK3^［19-20］，以及與脂質沉積相關的APOA1^［21］。研究發(fā)現，DL來源于肌纖維束和肌纖維之間的間隙，與肌纖維結構變化密切相關，受到肌肉特性的影響^［22］。同時，肌肉中IMF含量與DL密切相關。提示篩選到的差異表達基因中包含了影響DL的關鍵基因。

2.4 差異表達基因功能富集分析

對篩選的差異基因進行GO功能富集，共顯著富集到238個GO條目（Plt;0.05），其中包含203個生物學過程（biological process， BP）、11個細胞成分（cellular component， CC）和24個分子功能（molecular function， MF）。篩選的差異基因顯著富集到34個KEGG通路。最顯著富集的前3項GO條目和通路見表5。分析顯著富集的GO條目和通路發(fā)現，與DL密切相關的GO條目和通路主要涉及心血管系統發(fā)育與功能（如GO：0001944、GO：0072358、ssc05418、ssc04151）、細胞骨架與運動（如GO：0001725、GO：0097517）、蛋白質調控與功能（如GO：0015026、GO：0031072、GO：0044183、GO：0051145）等。

2.5 差異表達基因與滴水損失的相關性分析

為進一步篩選影響DL的關鍵候選基因，在28頭萊蕪豬群體中對166個差異表達基因與DL48 h表型進行相關分析，共發(fā)現110個差異表達基因與DL48 h顯著相關（Plt;0.05），其中53個基因與DL48 h呈顯著正相關，57個基因與DL48 h呈顯著負相關。在相關性最高的10個基因中（表6），多樣剪接的RNA結合蛋白2（RNA binding protein with multiple splicing 2，RBPMS2）、Krüppel樣轉錄因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）和胰島素樣生長因子2（insulin like growth factor 2，IGF2）等7個基因與DL48 h呈負相關；紅細胞分化調節(jié)因子1（erythroid differentiation regulatory factor 1，EDRF1）、含Rho相關BTB結構域2（rho related BTB domain containing 2，RHOBTB2）和t復合體11樣1（t-complex 11 like 1，TCP11L1）3個基因與DL48 h呈正相關。

2.6 差異表達基因蛋白互作分析

對差異表達基因編碼蛋白進行蛋白互作分析，共發(fā)現57個基因編碼的蛋白存在互作（圖3）。在這些互作的蛋白中，13個蛋白與其他至少2個蛋白間存在互作，其中泛素蛋白連接酶E3組分N-識別蛋白1（ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 1，UBR1）和Tau微管蛋白激酶2（tau tubulin kinase 2，TTBK2）與其他蛋白的互作程度最高，均與3個蛋白存在互作，且UBR1和TTBK2的mRNA表達量與DL48 h顯著相關（Plt;0.05），因此將UBR1和TTBK2作為影響DL的重要候選基因。另外，GATA2、PDLIM4和SPG11等11個蛋白與其他2個蛋白存在互作，其中GATA2、PDLIM4和SPG11等7個基因mRNA表達量與DL48 h顯著相關（Plt;0.05）。表7顯示了與DL48 h顯著相關且與至少2個蛋白存在互作的蛋白信息。

3 討 論

3.1 滴水損失與肉色、肌內脂肪含量等肉質指標密切相關

DL是影響肉質的重要因素之一。本研究在萊蕪豬群體中發(fā)現DL48 h與a*1、a*24和IMF含量呈顯著負相關。a*值代表肉色的紅度，a*值越高肉色越偏紅色。肉色的形成主要與肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素C三種物質有關。其中肌紅蛋白最為重要，對鮮肉顏色的貢獻約80%～90%，決定了屠宰后肌肉所呈現顏色。Savage等^［23］對豬肉DL析出液進行了蛋白組成分析發(fā)現，其中含有一定含量的肌紅蛋白。說明在滴水過程中與肉色相關的肌紅蛋白會隨析出液而流失，這可能造成肉色a*值的降低。這一結果與本次試驗結果相符，我們發(fā)現DL48 h與a*1呈極顯著負相關（r=－0.570，P=0.001 6），與a*24呈顯著負相關（r=－0.451，P=0.016 0）。另外，任一帆等^［24］在萊蕪豬群體中也發(fā)現相似的結果，DL與a*1和a*24的肉色指標均呈極顯著負相關。

另外，本研究也發(fā)現DL48 h與IMF含量呈顯著負相關。這可能是由于IMF增加導致肌肉中的水分被置換，可析出的自由水的比例相對減少；同時，IMF的組成成分磷脂和甘油三酯可在肌纖維表面形成一層類似保護膜的結構，有效減緩水分的流失速度，從而間接降低DL。這一結果與楊杰等^［8］的研究結果一致，在萊蕪豬IMF與DL呈極顯著負相關。但馮崗等^［25］在北京黑豬中發(fā)現IMF含量與DL呈顯著正相關（r=0.446），這可能與品種間的差異有關。另外，屠宰后肌肉pH的改變是造成DL的重要原因之一，但在本研究中未發(fā)現DL48 h與pH1 h和pH24 h存在顯著相關性，這也可能是由于品種的影響。

3.2 影響滴水損失的關鍵GO條目和通路

本研究從28頭萊蕪豬群體中選擇了DL-H和DL-L兩組各4頭進行了差異表達基因篩選，篩選到166個差異表達基因。對差異表達基因功能富集分析，共顯著富集到238個GO條目和34條通路（Plt;0.05）。與DL相關的GO條目和通路涉及血管與心血管系統發(fā)育、細胞骨架與運動、蛋白質調控與功能等。不同的肌纖維類型毛細血管含量存在明顯差異，快肌纖維直徑大，毛細血管密度小；慢肌纖維直徑小，但毛細血管密度大。而具有更大肌纖維直徑的肌肉其DL越小^［26］，這可能是DL差異表達基因富集在血管發(fā)育相關GO條目和通路的原因。另外，越來越多的研究推測屠宰后肌肉骨架蛋白的損失形成了滴流通道（drip channels），從而造成了DL^［27］，這些細胞骨架蛋白由于其在肌肉細胞中的不同位置和功能，對肌肉的持水性產生不同的影響。例如，Zhang和Zuo等^［28-29］的研究團隊均發(fā)現在高DL組的肌肉骨架蛋白desmin均高于低DL。因此，細胞骨架與運動、蛋白質調控與功能等GO條目和通路與DL密切相關。

3.3 影響滴水損失的關鍵基因

本研究對28頭萊蕪豬進行了轉錄組測序，并挑選其中8頭表型極端個體展開差異基因篩選和功能富集。隨后將差異基因與DL48 h性狀在28個個體中進行相關分析，進一步篩選與DL48 h顯著相關的差異表達基因，并結合差異基因的蛋白互作來綜合鑒定影響DL的潛在基因。Yang等^［30］也利用類似的方法開展DL的研究，利用12頭表型極端的杜長大商品豬的背最長肌轉錄組數據，并結合蛋白質互作以及機器學習等多種方法，篩選出影響豬肉DL的關鍵基因IRS1、ESR1、HSPA6等，并構建了基因調控網絡。

在差異表達基因篩選的基礎上，本研究進一步篩選出110個與DL48 h顯著相關的差異表達基因，在前10位顯著相關的差異基因中包含了IGF2、KLF2等基因。Heidt等^［31］以杜洛克和皮特蘭雜交豬為研究對象，發(fā)現IGF2的表達與DL48 h呈顯著負相關（r=－0.194）。Ponsuksili等^［32］也發(fā)現在杜洛克和皮特蘭雜交群體中，IGF2在高、低DL組間存在1.4倍的表達差異。以上結果提示，IGF2可能是影響DL的重要候選基因。另外，KLF2作為轉錄因子，在肺和血管的發(fā)育、脂肪生成、T細胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用^［33］。在農業(yè)動物中的研究發(fā)現，KLF2在脂肪組織的發(fā)育中起著重要作用^［34-36］。Cui等^［37］的研究揭示了KLF2可以通過直接抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的特定轉錄變體1的表達，從而抑制前脂肪細胞的分化，提示了KLF2在IMF沉積中的關鍵作用。本研究也發(fā)現，IMF含量與DL48 h呈極顯著負相關（Plt;0.01），同時前人的研究也推測IMF通過填充肌肉組織中多余的“空隙”，縮小了水分從肌肉組織析出的通道，減緩水分流失的速度，進而減少了肌肉的DL^［38］。因此，也將KLF2作為影響DL的重要候選基因。

另外，本研究對差異基因進行了蛋白互作分析，發(fā)現了兩個高互作蛋白編碼基因泛素蛋白連接酶E3組分N-識別蛋白1（ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 1，UBR1）和Tau微管蛋白激酶2（Tau tubulin kinase 2，TTBK2）。這兩個基因的表達量均與DL48 h表型顯著相關（Plt;0.05）。UBR1作為一種E3泛素蛋白連接酶在處理未折疊細胞質蛋白和降解錯誤折疊蛋白過程中起著重要作用^［39-40］。而屠宰后肌肉細胞蛋白質的降解會促進DL的加劇^［41］，因此將調控蛋白降解的基因UBR1作為影響DL的候選基因。TTBK2基因編碼一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，能夠磷酸化Tau蛋白、微管蛋白等多種底物^［42］。研究發(fā)現，蛋白磷酸化與肌肉的持水力和DL密切相關，高DL組的肌漿和肌原纖維磷酸化水平均高于低DL組，其中磷酸化水平較高蛋白為肌漿中影響pH的糖酵解酶，以及肌纖維蛋白中的細胞骨架蛋白和收縮蛋白^［43］。因此，也將TTBK2基因作為影響DL的關鍵基因。但KLF2、IGF2、UBR1和TTBK2影響DL的機制仍需后續(xù)進一步分析。

4 結 論

本研究發(fā)現，萊蕪豬的DL48 h與IMF含量、a*1和a*24呈顯著負相關，在DL極端個體中鑒定出166個差異表達基因，這些基因顯著富集在與血管系統發(fā)育與功能、細胞骨架與運動、蛋白質調控與功能等相關的GO條目和通路中。在差異基因分析的基礎上，結合表達量與表型的相關性分析、蛋白互作分析以及已報道的基因功能等，篩選到KLF2、IGF2、TTBK2和UBR1等影響DL的候選基因。本研究為DL性狀的遺傳改良提供了重要的候選基因，為肉質性狀的遺傳解析提供了新的視角。

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（編輯 郭云雁）