miR-375-3p 靶向 Fam229a 調(diào)控豬前體脂肪細胞分化

摘 要： 旨在探究 miR-375-3p 對豬脂肪細胞生成的調(diào)控作用及靶向 Fam229a 的作用機制。本研究選取了飼養(yǎng)在相同條件下的10 頭 30 日齡的健康無病的公豬為研究對象，通過實時熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）檢測 miR-375-3p 在心臟、肝臟、脾臟等組織的表達分布及在脂肪細胞成脂誘導(dǎo)分化不同時期的表達水平；利用 miRNA mimic 和 miRNA inhibitor 過表達和干擾 miR-375-3p，qPCR 檢測miR-375-3p對成脂關(guān)鍵基因CEBPα、PPARγ、FABP4表達的影響，油紅O染色和統(tǒng)計分析檢測成脂能力；通過生物信息學分析和雙熒光素酶報告試驗預(yù)測并鑒定miR-375-3p的下游靶標 Fam229a，并對 Fam229a 進行功能驗證；最后利用 PSIPRED 軟件、Phyre2.0 軟件和 STRING 網(wǎng)站預(yù)測 Fam229a 下游功能及 qPCR 檢測 Fam229a 對早期成脂關(guān)鍵基因 CEBPα、CEBPβ、ZFP423 和 ZFP521表達的影響；上述試驗方法均設(shè)立3個生物學重復(fù)。結(jié)果表明，miR-375-3p 在豬各組織中廣泛表達，在肺臟和腎周脂肪中相對表達量較高；時序表達譜顯示，在豬原代前體脂肪細胞的分化過程中miR-375-3p的表達量呈先下降后上升趨勢；過表達 miR-375-3p后，豬原代前體脂肪細胞的脂滴明顯增多，脂肪細胞分化標志基因CEBPα、PPARγ 和 FABP4的mRNA水平極顯著上升（Plt;0.01），干擾miR-375-3p后，結(jié)果相反。為了探究miR-375-3p的作用機制，通過qRT-RCR、結(jié)合位點預(yù)測以及雙熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)了 miR-375-3p 與 Fam229a 之間存在結(jié)合作用，過表達miR-375-3p能顯著抑制Fam229a的表達（P＜0.05），干擾后則表示相反結(jié)果。組織表達譜顯示Fam229a在肝臟和腎周脂肪中相對表達量較高；時序表達譜顯示，在豬原代前體脂肪細胞的分化過程中，F(xiàn)am229a的表達量呈先上升后下降再上升趨勢；過表達Fam229a后，脂滴明顯減少，脂肪細胞分化標志基因CEBPα、PPARγ的mRNA水平顯著降低（Plt;0.05），干擾Fam229a后，結(jié)果相反；通過qRT-RCR技術(shù)和生物信息學預(yù)測了Fam229a調(diào)控成脂分化的下游機制。本研究結(jié)果表明，miR-375-3p能夠促進豬原代前體脂肪細胞的成脂分化，其靶基因 Fam229a 抑制成脂分化，揭示了 miR-375-3p 靶向 Fam229a 調(diào)控成脂分化的機制，豐富了 miRNA 的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

關(guān)鍵詞： 豬；脂肪細胞分化；miR-375-3p；Fam229a

中圖分類號：

S828.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1120-14

收稿日期：2024-09-23

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32272846）；山西省重點研發(fā)計劃項目（202102140601005）；山西省基礎(chǔ)研究計劃（202403021211043）

作者簡介：楊宇婷（1998-），女，山西祁縣人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：16635048175@163.com

*通信作者：李步高，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：jinrenn@163.com；楊 陽，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究，E-mail：yangyangyh@163.com

miR-375-3p Targets Fam229a to Regulate Porcine Precursor Adipocyte Differentiation

YANG" Yuting， CHEN" Guoliang， CHANG" Qiaoning， BAO" Wu， LIU" Jingchao， JI" Mengting， RONG" Xiaoyin， GUO" Xiaohong， YANG" Yang^*， LI" Bugao^*

（College of Animal Science， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801，" China）

Abstract：" The study aimed to explore the regulatory effect of miR-375-3p on porcine adipocyte generation and its action mechanism targeting Fam229a. In this study， 10 healthy and disease-free boars of 30 days old were selected to be reared under the same conditions. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to detect the expression distribution of miR-375-3p in the heart， liver， spleen and other tissues and the expression levels at different stages of adipogenic differentiation of adipocytes. Using miRNA mimics and miRNA inhibitors to overexpress and interfere with miR-375-3p， qPCR was employed to detect the effect of miR-375-3p on the expression of key adipogenic genes CEBPα， PPARγ， and FABP4. Oil red O staining and statistical analysis were used to assess the adipogenic capacity. Bioinformatics analysis and dual luciferase reporter assays were used to predict and identify Fam229a as a downstream target of miR-375-3p， and the function of Fam229a was subsequently validated. Finally， the downstream functions of Fam229a were predicted using PSIPRED software， Phyre2.0 software， and the STRING database， and qPCR was employed to detect the expression of early adipogenic key genes CEBPα， CEBPβ， ZFP423， and ZFP521 regulated by Fam229a. All of the above experimental methods were performed in triplicate to ensure biological reproducibility. The results showed that miR-375-3p was widely expressed in various tissues of pigs， with relatively high expression levels in lung and perirenal lipids. The temporal expression profile showed that the expression of miR-375-3p decreased first and then increased during the differentiation of porcine primary precursor adipocytes. After overexpression of miR-375-3p， the lipid droplets of porcine primary precursor adipocytes increased significantly， and the mRNA levels of adipocyte differentiation marker genes CEBPα， PPARγ and FABP4 increased significantly （Plt;0.01）. However， the results were reversed after interfering with miR-375-3p. In order to explore the action mechanism of miR-375-3p， a binding effect between miR-375-3p and Fam229a was found through qRT-RCR， binding site prediction and dual luciferase assay. Overexpression of miR-375-3p could significantly inhibit the expression of Fam229a （Plt;0.05）. After interference， the opposite result is indicated. Tissue expression profile showed that Fam229a was relatively high in liver and perirenal lipids. The temporal expression profile showed that the expression of Fam229a increased first， then decreased and then increased during the differentiation of porcine primary precursor adipocytes. After overexpression of Fam229a， the lipid drops were significantly decreased， and the mRNA levels of adipocyte differentiation marker genes CEBPα and PPARγ were significantly decreased （Plt;0.05）， while the results were opposite after interfering with Fam229a. The downstream mechanism of Fam229a regulating adipogenic differentiation was predicted by qRT-RCR technique and bioinformatics. This study results show that miR-375-3p can promote the adipogenic differentiation of porcine primary precursor adipocytes， and its target gene Fam229a inhibits adipogenic differentiation， revealing the regulation mechanism of adipogenic differentiation by miR-375-3p targeting Fam229a， and enriching the molecular regulatory network of miRNA.

Keywords： pigs; adipocyte differentiation; miR-375-3p; Fam229a

*Corresponding authors：LI Bugao， E-mail：jinrenn@163.com; YANG Yang， E-mail：yangyangyh@163.com

豬脂肪組織的主要功能是保護器官、維持體溫、儲存能量以及參與代謝調(diào)節(jié)^［1］。脂肪組織的發(fā)育會影響成年動物的胴體品質(zhì)和代謝健康，并且對機體脂質(zhì)代謝和葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。脂肪細胞的生成是由多能間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細胞，是決定脂肪組織發(fā)育的關(guān)鍵^［2］。在脂肪細胞生成的調(diào)控中，目前已經(jīng)建立了以轉(zhuǎn)錄因子 PPARγ 為核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)^［3-4］，非編碼RNA通過表觀遺傳調(diào)控影響著關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達^［5-6］，在脂肪細胞生成的分子機制中扮演著重要的角色。

miRNA （microRNA）是一類約 22 個核苷酸長的非編碼 RNA 分子，可以通過與靶基因的 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合，導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄延遲、翻譯抑制或降解，從而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控^［7-8］。有研究顯示，miRNA 參與調(diào)節(jié)各種生物學過程，如細胞增殖、細胞凋亡、脂肪代謝、胰島素分泌、胚胎發(fā)育以及神經(jīng)遞質(zhì)合成等^［9-12］。在豬脂肪細胞的生成中也有 miRNA 調(diào)控豬成脂分化的相關(guān)報道，miR-146a-5p 通過 TGF-β 和 AKT/mTORC1 信號通路抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細胞分化^［13］；miR-451 靶向 ACACA 調(diào)節(jié)豬原代脂肪細胞的分化^［14］；miR-127 靶向豬脂肪細胞中的 MAPK4 和 HOXC6 來減弱脂肪生成^［15］。中國地方豬種具有肉質(zhì)優(yōu)良、瘦肉率低、適應(yīng)性強、耐粗飼、抗逆性好、遺傳多樣性等特征，其中脂質(zhì)沉積能力強最具典型，本研究通過品種之間的差異鑒定出了差異表達的 miRNA-375-3p。有研究報道 miR-375-3p 在多種生物學過程中發(fā)揮作用，例如炎癥、癌癥、細胞凋亡^［16-18］等。miR-375-3p可以通過靶向低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（LRP5）和β-catenin來負向調(diào)節(jié)成骨過程，與成骨細胞的凋亡相關(guān)，可能在診斷和治療骨質(zhì)疏松癥中作為生物標志物^［19］；還能通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）介導(dǎo)的鐵死亡促進心臟纖維化^［20］；也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-375 在產(chǎn)熱相關(guān)功能中有報道，miR-375對冷暴露敏感，可以促進內(nèi)臟脂肪組織衍生干細胞的產(chǎn)熱，這項研究暗示了miR-375在脂肪組織中的特定功能，表明miR-375可能是一種潛在的脂肪生成和產(chǎn)熱相關(guān)的miRNA^［21］。但是 miRNA 特異性調(diào)控脂肪細胞生成的分子機制還有待進一步研究。

本研究分析了馬身豬和杜長大豬品種之間的成脂能力差異，發(fā)現(xiàn)馬身豬的成脂能力顯著高于杜長大，同時鑒定出 miR-375-3p 具有顯著變化，因此本研究以豬原代前體脂肪細胞為模型，通過過表達和干擾等技術(shù)，揭示 miR-375-3p 靶向 Fam229a 對脂肪細胞生成的調(diào)控機制，探討 Fam229a 參與調(diào)控脂肪細胞的生成。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究選取30日齡健康無病的馬身豬和杜長大豬各5頭，屠宰后，取豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌、腰肌、皮下脂肪和背部脂肪等樣品。

1.2 主要試劑

胎牛血清和 Opti-MEM 購自美國 Gibco 公司；胰酶、高糖 DMEM 和胰島素購自美國Sigma公司；Dex、IBMX、4%多聚甲醛和飽和油紅 O染液購自北京 Solarbio公司；吲哚美辛購自上海阿拉丁公司；Trizol Reagen 購自美國 Life Technologies 公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 購自 TaKaRa 公司；高成功率 PCR 酶 KOD FX 購自日本 TOYOBO 公司；Lipofectamine 3000 購自 Invitrogen 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol試劑盒提取豬各個組織和皮下脂肪SV細胞的總RNA。將提取的RNA用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 實時熒光定量 PCR

以 cDNA為模板，通過 qRT-PCR 檢測關(guān)鍵基因的表達，基因表達量以β-actin為內(nèi)參，基因相對表達量根據(jù) 2^-ΔΔCt 法計算。引物序列見表1。

1.3.3 豬原代前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)

將剛出生仔豬放血處死后用蒸餾水清洗全身，用75%的酒精清洗，取頸部的皮下脂肪組織，放入75%的酒精中浸泡1～2 min，再用生理鹽水清洗，最后放入預(yù)冷的含有2%雙抗的PBS中備用；盡量去除脂肪組織中的血管及結(jié)締組織，用含雙抗的 PBS 緩沖液沖洗脂肪組織，把脂肪組織放入裝有少量 PBS 的小燒杯中盡量剪碎；將組織糜與I型膠原酶按1∶1混合后密封，置于37 ℃，120 r·min^-1 恒溫振蕩儀中振蕩消化60 min 左右，當組織塊消化到看不出明顯形狀時取出，加完全培養(yǎng)基終止消化，振蕩以搖出細胞;依次用70 μm和40 μm的濾篩過濾，濾液收集到50 mL離心管中，然后1 500 r·min^-1 離心10 min，棄上清液及漂浮的成熟脂肪細胞；用完全培養(yǎng)基把消化下來的細胞混合物進行清洗一次，最后用培養(yǎng)基吹打混勻成單細胞懸濁液；置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h換液，24 h后換液觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 Fam229a過表達載體的構(gòu)建

以小鼠脂肪組織 cDNA 為模板，擴增小鼠 Fam229a 基因的 CDS 區(qū)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠并進行膠回收；將膠回收產(chǎn)物與 pEASY-BluntZero Vector 載體在 25 ℃ 過夜連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化涂板，挑選單個陽性菌落搖菌，將新鮮菌液經(jīng)PCR鑒定后送至華大基因公司測序。

將CDS區(qū)克隆成功的菌液搖菌后提取質(zhì)粒，提取步驟按照 EZNA Plasmid Mini Kit 試劑盒；將質(zhì)粒作為模板，使用高保真酶進行質(zhì)粒 PCR 擴增，之后進行瓊脂糖凝膠電泳并使用DNA純化試劑盒進行純化回收；利用限制性內(nèi)切酶 Nhe l 和 EcoR I 對 pCMV-N-fag 載體進行雙酶切反應(yīng)，然后進行瓊脂糖凝膠電泳后回收；按說明書進行同源重組，隨后立即置于冰上冷卻，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5a 感受態(tài)細胞，37 ℃搖菌1 h后，涂至含有Kana的LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12～16 h。隨后，挑取單個菌落進行 PCR 鑒定，鑒定為陽性菌落的菌液接種至含有Kana的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后使用。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染

將豬原代前體脂肪細胞和 C3H10T1/2細胞接種于6孔板中，密度達到70%左右進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換新鮮培養(yǎng)基，按照 Lipofectamine 3000 說明書步驟轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染 48 h后 Trizol 收集細胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.6 脂肪細胞的成脂誘導(dǎo)分化

轉(zhuǎn)染后待細胞完全匯合，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+10 μg·mL^-1胰島素（Ins）+0.5 mmoL·L^-1 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）+1 μmoL·L^-1 地塞米松（DEX）+100 μmoL·L^-1 吲哚美辛（IND），2 d后換為維持培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+10 μg·mL^-1 Ins），2 d后換為完全培養(yǎng)基，直至脂滴融合成為大脂滴。

1.3.7 脂肪細胞的油紅 O染色和定量分析

脂肪細胞誘導(dǎo)分化 8 d后，移除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加油紅O固定液固定20～30 min；棄去固定液，用蒸餾水洗2次，加入60% 異丙醇浸洗20～30 s；棄去60% 異丙醇后加入新配置好的油紅O染色液，浸染10～20 min；棄去染色液，60% 異丙醇漂洗20～30 s至間質(zhì)清晰，水洗2～5次，直到無多余染液；加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染核1～2 min；棄去染液后水洗2～5次，加入油紅O緩沖液孵育1 min，棄去；加入蒸餾水覆蓋細胞并在顯微鏡下觀察拍照。

每組選取3張，利用Image J進行統(tǒng)計分析，將圖像轉(zhuǎn)換為8-bit模式，以便進行閾值分割；根據(jù)染色特征調(diào)整閾值，設(shè)置適當?shù)拈撝祦矸指顓^(qū)域（Image-Adjust-Threshold）；設(shè)置測量參數(shù)，包括Area、Integrated Mean、Mean gray value、Limit to threshold；點擊 Analyze-Measure進行測量，統(tǒng)計結(jié)果利用 T 檢驗進行差異分析。

1.3.8 雙熒光素酶報告試驗

按照說明書準備好 Duo-Lite Luciferase 檢測試劑和 Duo-Lite Stop amp; Lite 檢測試劑。轉(zhuǎn)染1～2 d 后于培養(yǎng)箱中取出待測細胞培養(yǎng)板，室溫放置 30 min，以使培養(yǎng)板溫度平衡至室溫，PBS 輕柔清洗 1～2 次后，每孔加入 120 μL 裂解液，在搖床上孵育 25 min，充分裂解細胞；每個樣品分別吸取 20 μL 到避光的 96 孔板中，加入 75 μL 的 Duo-Lite Luciferase 檢測試劑，并混合均勻，注意不要有氣泡，室溫避光靜置 10 min，上機檢測螢火蟲熒光素酶發(fā)光數(shù)值，檢測完后立即加入 75 μL 的Duo-Lite Stop amp; Lite 檢測試劑，并混合均勻，室溫避光靜置 5 min 后上機檢測海腎熒光素酶發(fā)光數(shù)值，前后兩次檢測的數(shù)值根據(jù)公式螢火蟲熒光素酶發(fā)光數(shù)值/海腎熒光素酶發(fā)光數(shù)值計算并分析。

1.3.9 生物信息學分析

通過 PSIPRED 軟件和 Phyre2.0 軟件預(yù)測 Fam229a 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)，STRING 網(wǎng)站預(yù)測 Fam229a 互作蛋白。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

試驗所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示，結(jié)果使用 SPSS Statistics 22.0 軟件進行顯著性分析。其中，處理組和對照組之間的比較采用獨立樣本 T 檢驗；miR-375-3p 和 Fam229a 基因的組織表達差異使用單因素方差分析，采用 Duncan’s 法進行多重比較；Plt;0.05 表示差異顯著，Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬miR-375-3p組織表達差異分析

在馬身豬（MS）和杜長大豬（DLY）的脂肪組織和肌肉組織中，miR-375-3p 的表達存在差異（圖1A），馬身豬成脂關(guān)鍵因子在腹脂（FZ）中的表達量極顯著高于杜長大（Plt;0.01，圖1B）。qRT-PCR 結(jié)果顯示miR-375-3p 在肺臟組織中表達量最高，其次是腎周脂肪（圖1C）。miR-375-3p 表達量隨著日齡增加呈下降趨勢（圖1D）；相對于正常（NC）日糧組，高脂（HFD）日糧誘導(dǎo)的肥胖模型中 miR-375-3p 的表達量在棕脂中極顯著降低（Plt;0.01，圖1E）；在豬前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化不同時期呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其表達量在誘導(dǎo)分化第 1 天時最低（圖1F）。

2.2 miR-375-3p促進豬脂肪細胞的成脂分化

將試驗組 miR-375-3p mimics（miR-375-3p）、miR-NC （過表達對照組）、inhibitor-375-3p 和inhibitor-NC （干擾對照組）分別轉(zhuǎn)染至豬原代前體脂肪細胞中，48 h 后收集細胞，qRT-PCR 檢測其轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與 miR-NC組相比，miR-375-3p 組極顯著促進了 miR-375-3p的表達（Plt;0.01，圖 2A）；與 inhibitor-NC組相比，inhibitor-375-3p組極顯著抑制了 miR-375-3p的表達（Plt;0.01，圖2D）；可用于后續(xù)試驗。

在豬原代前體脂肪細胞中轉(zhuǎn)染miR-375-3p mimics并成脂誘導(dǎo)8 d后，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-375-3p mimics的豬脂肪SV細胞脂滴增加，成脂關(guān)鍵基因 CEBPα、PPARγ 和 FABP4的表達水平均極顯著升高（Plt;0.01，圖2B-2C）；抑制 miR-375-3p 后表現(xiàn)相反的結(jié)果（圖2E-2F）。綜上結(jié)果表明miR-375-3p能促進成脂分化。

2.3 miR-375-3p促進C3H10T1/2 細胞的成脂分化

通過序列分析發(fā)現(xiàn)豬和鼠的miR-375-3p的序列一致，為進一步驗證 miR-375-3p是否在調(diào)控脂肪生成中具有物種間的保守性，在C3H10T1/2細胞上對 miR-375-3p進行了功能獲得和缺失試驗，發(fā)現(xiàn)與豬的結(jié)果一致。過表達 miR-375-3p 后，成熟的脂肪細胞增多，成脂分化關(guān)鍵基因的表達顯著升高（Plt;0.05），促進成脂分化（圖3A-3C）；干擾 miR-375-3p后結(jié)果相反，抑制成脂分化（圖3D-3F）。

2.4 miR-375-3p下游靶基因的預(yù)測

通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出miR-375-3p的靶基因Fam229a（圖4A），通過在線網(wǎng)站 RNAhybrid 預(yù)測miR-375-3p與Fam229a的結(jié)合位點。結(jié)果顯示，miR-375-3p種子序列可與Fam229a 3′UTR結(jié)合，并通過堿基互補配對形成二級結(jié)構(gòu)，其預(yù)測出的最小結(jié)合能為-30.2 kcal·mol^-1，結(jié)合能力較強（圖4B）。根據(jù)miR-375-3p種子區(qū)域與其靶基因Fam229a的結(jié)合位點，對Fam229a基因 3′UTR 與miR-375-3p種子序列結(jié)合的區(qū)域定點突變，使miR-375-3p的種子區(qū)域與Fam22a基因 3′UTR 端無法結(jié)合，具體結(jié)合位點與突變位點序列見圖4C。

在 C3H10T1/2 細胞中轉(zhuǎn)染miR-375-3p mimics和inhibitor，發(fā)現(xiàn)過表達miR-375-3p后，F(xiàn)am229a的表達量顯著降低（P＜0.05，圖4D），而抑制miR-375-3p，F(xiàn)am229a的表達量極顯著增加（P＜0.01，圖4E），為進一步驗證miR-375-3p與Fam229a的靶向關(guān)系，進行了雙熒光素酶報告試驗。檢測結(jié)果顯示（圖4F），共轉(zhuǎn)染 psiCHECK2- Fam229a 質(zhì)粒和 miR-375-3p mimics 時，螢火蟲熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而將結(jié)合位點突變或不轉(zhuǎn)染 miR-375-3p 時，降低的熒光素酶活性可得到恢復(fù)，證明 miR-375-3p 與 Fam229a 之間確實存在結(jié)合作用。

2.5 豬Fam229a基因組織表達差異分析

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am229a在豬的肝臟組織中表達量最高，其次是腎周脂肪（圖5A）。馬身豬（MS）背脂和腰肌中Fam229a的表達量極顯著高于杜長大豬（DLY），而在背肌中的表達量顯著低于杜長大豬（Plt;0.05，圖5B）。此外，F(xiàn)am229a在不同發(fā)育階段的表達量隨著日齡增加呈顯著下降的趨勢（圖5C）。建立小鼠肥胖模型后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高脂模型中Fam229a的表達量在棕脂中極顯著降低（Plt;0.01，圖5D）。在豬前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化不同時期，F(xiàn)am229a的表達量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，并且在分化第1天 時達到最高水平（圖5E）。根據(jù) NCBI 的序列設(shè)計引物并進行PCR驗證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物條帶與目的條帶大小一致（圖5F）。

2.6 Fam229a抑制脂肪細胞的成脂分化

本研究又探究了Fam229對成脂分化的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，過表達Fam229a（OE-Fam229a）后，抑制成脂分化（圖6A-6C）；干擾Fam229a（si-Fam229a）后表現(xiàn)相反的結(jié)果（圖6D-6F）。綜上結(jié)果表明Fam229a抑制成脂分化。隨后又通過挽救試驗驗證了miR-375-3p靶向Fam229a調(diào)控成脂分化（圖6G-6H）。

2.7 預(yù)測Fam229a的下游功能

最后，對Fam229a下游進行了功能預(yù)測。通過 PSIPRED 軟件和 Phyre2.0 軟件預(yù)測 Fam229a 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)（圖7A、7B），STRING 網(wǎng)站預(yù)測 Fam229a 互作蛋白（圖7C）。

此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達 Fam229a 后早期成脂基因 CEBPα、CEBPβ和ZFP423的表達量極顯著降低（Plt;0.01，圖7D），ZFP521 的表達量極顯著升高（Plt;0.01，圖7D）；干擾 Fam229a 后表現(xiàn)相反的結(jié)果（圖7E）。

3 討 論

miR-375 在多種生物學過程中扮演著重要的角色，如抑制腫瘤生長^［22］、藥物誘導(dǎo)皮膚反應(yīng)過程，形成細胞凋亡^［23］以及抑制癌細胞增殖和侵襲^［24］等過程。miR-375 還可以通過靶向BMPR2負調(diào)控豬前脂肪細胞分化^［25］；促進間充質(zhì)干細胞成骨分化^［26］；還在棕櫚酸鈉作用下通過靶向胰管細胞中的Erk1誘導(dǎo)脂肪生成^［27］。此外，miR-375能通過靶向非酒精性脂肪肝疾病中的AdipoR2，調(diào)節(jié)脂肪因子并抑制炎癥細胞因子^［28］。這些研究都暗示了miR-375的表達在脂肪細胞生成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-375-3p作為miR-375的成熟miRNA中的一條鏈（3′端鏈），在豬脂肪細胞生成的機制中報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-375-3p 在肺臟組織中表達量最高，其次是腎周脂肪。為了探究 miR-375-3p 在脂肪細胞生成中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)在豬原代前體脂肪細胞和C3H10T1/2 細胞中 miR-375-3p 都表現(xiàn)出了促進脂肪細胞成脂分化的能力，說明 miR-375-3p 在調(diào)控成脂分化中具有物種間保守性。于是進一步研究了 miR-375-3p 的作用機制，篩選到了 miR-375-3p 的下游靶基因 Fam229a，發(fā)現(xiàn)Fam229a表現(xiàn)出了抑制成脂分化的能力，并證明了 miR-375-3p 靶向 Fam229a 調(diào)控成脂分化。這些發(fā)現(xiàn)為豬脂肪細胞生成的分子機制提供了新的視角，也為miR-375-3p作為潛在的靶點在肥胖和代謝相關(guān)疾病中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

miR-375-3p 的下游靶基因 Fam229a尚未見有相關(guān)報道，因此，本研究還預(yù)測了Fam229a蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)以及Fam229a的下游靶蛋白Ly6g5c、Polr3g、Slitrk6、Cdc42ep5。這些靶蛋白在成脂分化過程中并未相關(guān)研究，也為后續(xù)研究提供了方向。Ly6g5c（Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G5c）蛋白是一種與細胞黏附和信號傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白，可能參與調(diào)節(jié)細胞間相互作用^［29］；Polr3g（RNA polymerase III subunit G）蛋白是RNA聚合酶III的一個亞基，參與RNA的合成過程^［30］，能促進乳腺癌和肺癌的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移^［31-32］；Slitrk6（SLIT and NTRK-like protein 6）蛋白屬于SLITRK家族，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可能參與神經(jīng)元間的信號傳導(dǎo)^［33-34］；Cdc42ep5（Cdc42 effector protein 5）蛋白是Cdc42的效應(yīng)蛋白，可能調(diào)節(jié)細胞極性、細胞運動和細胞分裂等生物學過程^［35］。綜上，F(xiàn)am229a可能是通過其下游靶蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。CEBPα 是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的轉(zhuǎn)變，并調(diào)控脂肪細胞特異性基因的表達^［36］。CEBPα 主要通過激活脂肪合成相關(guān)基因如脂肪酸合成酶和甘油三酯合成酶來促進脂肪的積累，在脂肪細胞的分化過程中起著核心作用；CEBPβ 主要通過調(diào)節(jié)成脂分化的起始階段^［37］，促進前脂肪細胞的增殖并在一定程度上調(diào)控CEBPα的表達。而 ZFP423 也在脂肪細胞的早期分化階段發(fā)揮重要作用，通過促進成脂轉(zhuǎn)錄因子（PPARγ）的表達，促進脂肪細胞的分化過程^［38］。ZFP521 是一個抑制型的轉(zhuǎn)錄因子，對脂肪細胞的成脂分化有抑制作用^［39］，可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來抑制脂肪細胞的成熟，還可以干擾與脂肪生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而抑制脂肪細胞的分化^［40］。誘導(dǎo)成脂分化2 d后，發(fā)現(xiàn)過表達 Fam229a 后，促進脂肪細胞分化相關(guān)基因 CEBPα、CEBPβ 和 ZFP423 的表達量顯著降低，而抑制脂肪細胞分化的 ZFP521 的表達量顯著升高；干擾 Fam229a 則表現(xiàn)相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了成脂早期與成脂分化結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在豬原代前體脂肪細胞中，miR-375-3p 能促進成脂分化，其下游靶基因 Fam229a能抑制成脂分化，揭示了 miR-375-3p 靶向 Fam229a 調(diào)控成脂分化的機制，豐富了 miRNA 的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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（編輯 郭云雁）