隱孢子蟲基因組學(xué)研究進展

摘 要： 隱孢子蟲病是一種由隱孢子蟲引起的人獸共患疾病。基因組學(xué)研究在解析隱孢子蟲復(fù)雜生活史過程等分子生物學(xué)方面起到重要作用。隱孢子蟲基因組重測序以及不同隱孢子蟲蟲種的基因組學(xué)比較可以揭示蟲種間的遺傳進化規(guī)律及多樣性的形成機制。本文綜述了隱孢子蟲基因組學(xué)方面的研究進展，這對隱孢子蟲的防控有著重要意義。

關(guān)鍵詞： 隱孢子蟲；基因組學(xué)；人獸共患；研究進展

中圖分類號：

S852.723"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1059-06

收稿日期：2024-04-15

基金項目：NSFC-河南聯(lián)合基金重點項目（U1904203）；中原千人計劃領(lǐng)軍人才（19CZ0122）

作者簡介：陳遠才（1993-），男，河南光山人，博士生，主要從事人獸共患寄生蟲病防控研究，E-mail： 2546070427@qq.com

*通信作者：張龍現(xiàn)，主要從事人獸共患病預(yù)防研究，E-mail： zhanglx8999@henau.edu.cn

Advances in Genomics of Cryptosporidium

CHEN" Yuancai， HUANG" Jianying， QIN" Huikai， ZHANG" Longxian^*

（College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，" China）

Abstract：" Cryptosporidiosis is a zoonotic disease caused by Cryptosporidium. Genomics plays an important role in the molecular biology of Cryptosporidium such as the complex life cycle process. Genome resequencing of Cryptosporidium and genome comparison of different Cryptosporidium species can reveal the genetic evolution of Cryptosporidium species and the formation mechanism of diversity. This paper reviews the progress of Cryptosporidium genomics， which is of great significance for the prevention and control of Cryptosporidium.

Keywords： Cryptosporidium; genomics; zoonotic; research progress

*Corresponding author：" ZHANG Longxian， E-mail： zhanglx8999@henau.edu.cn

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是引發(fā)人類和動物腸胃炎常見的病原體之一，也是導(dǎo)致發(fā)展中國家2歲以下兒童中重度腹瀉的第二大致病病原體（僅次于輪狀病毒）^［1-2］。隱孢子蟲主要通過糞口途徑傳播，食用受污染的食物或水以及接觸受感染的動物都會引起隱孢子蟲感染^［3］。在1993年，美國威斯康星州密爾奧基市暴發(fā)隱孢子蟲病，導(dǎo)致大約40萬人感染，近百人死亡，經(jīng)濟損失達9 620萬美元^［4］。

目前，至少有44種隱孢子蟲和120多個基因型被鑒定^［5］。通常使用巢式PCR檢測隱孢子蟲卵囊，根據(jù)SSU rRNA基因位點鑒定隱孢子蟲種^［6-7］。隱孢子蟲亞型分型通過遺傳標記分子檢測，常見的亞型分型基因有微衛(wèi)星60 ku糖蛋白、小衛(wèi)星熱休克蛋白70等^［8］。然而，當不同蟲種或基因型混合感染時，僅依靠少數(shù)遺傳標記進行的診斷可能是不準確的^［9］。因此，隱孢子蟲的全基因組測序備受關(guān)注，目前隱孢子蟲基因研究發(fā)展的重要節(jié)點如圖1所示。利用基因組可以開展遺傳變異鑒定、抗性基因鑒定、藥物靶標篩選、流行病學(xué)等方面的研究。它還通過分析種群內(nèi)部和種群之間的遺傳變異和多樣性，提供了對種群遺傳學(xué)和進化的見解，揭示物種多樣性的形成機制。

1 隱孢子蟲基因組測序

1.1 隱孢子蟲基因組第一代測序研究

2004年，研究者們利用桑格測序法進行了微小隱孢子蟲Iowa株和人隱孢子蟲TU502株的基因組測序分析^［10-11］。這2個基因組均利用先前開發(fā)的“HAPPY”圖譜技術(shù)，即一種快速的基于PCR的體外方法，能夠識別8條染色體。微小隱孢子蟲的基因組大小約為9.11 Mb，人隱孢子蟲的基因組大小約為9.16 Mb。值得注意的是，隱孢子蟲的GC含量約為31%，而瘧原蟲和弓形蟲的GC含量分別為19%和52%。該研究還發(fā)現(xiàn)了具有潛在致病作用的新型細胞表面和分泌蛋白，以及參與抗生素運輸?shù)呐韵档鞍鬃鳛闈撛诘乃幬锇悬c。微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲缺乏頂復(fù)門原蟲保守的藥物治療靶點，如頂質(zhì)體，三羧酸循環(huán)及產(chǎn)生ATP的經(jīng)典呼吸途徑，因此針對其他各種頂復(fù)門寄生蟲開發(fā)的藥物對隱孢子蟲病無效。

1.2 隱孢子蟲基因組第二代測序研究

有研究利用基因組測序草圖來提高我們對隱孢子蟲的了解。Ifeonu等^［12］研究了不同隱孢子蟲分離株，包括人隱孢子蟲TU502_2012、火雞隱孢子蟲UKMEL1和貝氏隱孢子蟲TAMU-09Q1。研究者改進了TU502_2012的基因組組裝，與2004年的組裝結(jié)果相比，減少到了119個contigs，而基因組大小沒有變化，仍是9.1 Mb?；蜷L度比之前的注釋增加了500 bp。然而，TU502_2012中的基因集存在偏差，在所有其他注釋的隱孢子蟲基因組中，僅有3 745個預(yù)測蛋白的63%存在。此外，110個預(yù)測的蛋白質(zhì)編碼基因是新測序的基因組所特有的。在TU502_2012中還發(fā)現(xiàn)了10 526個SNP，在人隱孢子蟲UKH1中發(fā)現(xiàn)了4 394個SNP。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了進一步優(yōu)化隱孢子蟲基因組組裝和進一步分析的必要性，以了解導(dǎo)致這些寄生蟲表型間的差異。

Guo等^［13］進行了一項研究，使用454和Illumina技術(shù)對這些亞型的兩個野外標本進行了基因組測序并進行了比較，用于分析的參考基因組為微小隱孢子蟲Iowa株基因組。結(jié)果顯示，4個DNA分離株產(chǎn)生了8.59 Mb至9.05 Mb的隱孢子蟲基因序列，覆蓋率為94.36%至99.47%。該基因組與微小隱孢子蟲基因組的核苷酸序列一致性接近97%。人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲基因組之間的主要插入和缺失存在于端粒區(qū)。對人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲的4個基因組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)6號染色體5′端、3′端和gp60基因區(qū)存在差異。這種差異在很大程度上是基因重組所導(dǎo)致。

2018年，Nash等 ^［14］對一名隱孢子蟲病患者分離的微小隱孢子蟲UKP1全基因組進行了測序。該研究旨在確定傳播途徑和潛在毒力特征的標記。研究者采用454和Illumina技術(shù)，生成了160萬個reads，并將其與參考微小隱孢子蟲Iowa II分離株進行比對。將微小隱孢子蟲的8條染色體組裝成14個contigs，基因組大小為8.9 Mb，N50值為1.1 Mb，最大contigs長度為1.3 Mb，G+C含量為30.2%。

1.3 隱孢子蟲基因組第三代測序研究

2022年，Baptista等^［15］完成了微小隱孢子蟲IOWA-ATCC株全基因組測序。他們生成了一種新的PacBio+Illumina+Nanopore雜交基因組組裝，完善了不完整的微小隱孢子蟲IOWA參考基因組序列。與2004年的參考基因組相比，該染色體組裝找到所有16個染色體端粒，其中13個是連續(xù)組裝的，沒有g(shù)aps及模糊不清的堿基。他們根據(jù)試驗證據(jù)對已有微小隱孢子蟲的注釋進行了更新，包括新的轉(zhuǎn)運蛋白、非編碼RNA、內(nèi)含子以及改變的基因結(jié)構(gòu)。

2022年，Menon等 ^［16］完成了微小隱孢子蟲IIaA17G2R1亞型基因組組裝。該組裝基于Nanopore測序數(shù)據(jù)，并使用Illumina測序數(shù)據(jù)進行了糾錯。他們提供了一個高度精確和完整的微小隱孢子蟲參考基因組。他們還概述了如何基于兩種主要的方法來評估和選擇不同的組裝方法，這些方法可以應(yīng)用于其他隱孢子蟲蟲種。該組裝結(jié)果包括8條染色體和13個端粒?？傮w而言，該組裝具有較高的完成率，單拷貝BUSCO基因的完成率為98.4%。

2024年，Huang等 ^［17］發(fā)現(xiàn)作為微小隱孢子蟲原始亞型（IIaA15G2R1）的唯一參考，IOWA-II表現(xiàn)出明顯的組裝錯誤。他們使用PacBio和Illumina技術(shù)生成了該亞型的IOWA-CDC的完全組裝基因組。在對不同實驗室保存的7個IOWA株系和56個現(xiàn)場分離株的比較分析中，毒力較小的IOWA株（IIaA17G2R1）的混合基因組與IOWA-CDC密切相關(guān)，但有來自IOWA-II和未知血統(tǒng)的多序列滲入。此外，IOWA-IIaA17G2R1株系顯示了獨特的核苷酸替換和與宿主感染性相關(guān)的基因缺失，而其他的分離株中沒有觀察到這個現(xiàn)象。IOWA株系之間的這些基因組差異可能是微小隱孢子蟲中表型性狀的遺傳決定因素。這些數(shù)據(jù)為隱孢子蟲比較基因組分析提供了一個新的參考，并為開發(fā)先進的源追蹤工具提供了豐富的靶點。

1.4 隱孢子蟲單細胞基因組測序研究

針對隱孢子蟲這種難以培養(yǎng)的單細胞生物，單細胞基因組學(xué)是一種重要的基因組測序方法，而且它還可以檢查出多個蟲種混合感染的情況。Troell等 ^［18］進行了一項研究，他們從分選的隱孢子蟲單細胞中選擇10個擴增基因組進行基因組測序，并與原始群體和參考基因組進行比較，以評估該方法的準確性和性能。即使在適度的測序努力下，單細胞基因組覆蓋率平均為81%，并且通過將10個單細胞基因組組合在一起，整個基因組被計算在內(nèi)。單細胞基因組平均每個樣本含有1.3 Gbp，與宏基因組的差異很小，表明該方法對未來研究的準確性。

近期，本課題組在隱孢子蟲單細胞基因組測序方面也取得了重要進展。我們采用了10個微小隱孢子蟲卵囊全基因組擴增和長讀長測序的策略，并獲得了從斷奶前腹瀉犢牛分離的微小隱孢子蟲IIdA19G1亞型的高質(zhì)量基因組組裝。組裝的基因組長9.13 Mb，包含8條染色體，其中6條染色體在一端或兩端被端粒序列所覆蓋。共預(yù)測了3 915個蛋白編碼基因，其中單拷貝BUSCO基因的完整性為98.2%。據(jù)我們所知，這是通過單卵囊全基因組擴增和長讀長測序的結(jié)合首次在染色體水平上組裝出微小隱孢子蟲基因組。該組裝的全基因組及基因組注釋文件（登錄號GWHEQBI00000000）已上傳國家生物信息中心。

2 隱孢子蟲比較基因組學(xué)分析

Widmer等 ^［19］采用全基因組測序方法，利用單核苷酸多態(tài)性研究人源性微小隱孢子蟲分離株IIcA5G3b亞型，并與參考的微小隱孢子蟲IOWA株IIaA15G2R1亞型和人隱孢子蟲 IaA25R3亞型進行了詳細比較。IIcA5G3b亞型分析鑒定出12 000個SNP，這與IaA25R3亞型的相似性明顯高于IIaA15G2R1亞型的相似性。盡管兩個微小隱孢子蟲的基因組序列彼此之間的相似性是人隱孢子蟲總體相似性的10倍。這表明宿主偏好可能與一些不同的遺傳位點有關(guān)。研究者鑒定出的三個基因（cgd1_650、cgd3_3370和cgd6_5260）在IIcA5G3b亞型和IaA25R3亞型之間表現(xiàn)出顯著的等位基因相似性，表明它們的進化可能歸因于寄生蟲對不同宿主物種的適應(yīng)。

Guo等^［20］研究了花栗鼠隱孢子蟲基因型I，它是在一些工業(yè)化國家新出現(xiàn)的一種人獸共患病原體。研究者利用全基因組測序研究了寄生蟲從嚙齒動物到人類的傳播，鑒定出gp60基因和編碼另一種黏蛋白的核苷酸序列，并通過回帖到微小隱孢子蟲的參考基因組，該蛋白與微小隱孢子蟲的cgd1_470同源。研究者鑒定的花栗鼠基因型I分別來自25個人類樣本，1個東部灰松鼠樣本，1個花栗鼠樣本，1個鹿鼠樣本以及4個水樣本。根據(jù)全基因組測序的結(jié)果，基因分型成功地從人類、野生動物和水中產(chǎn)生出了15個亞型。在黏蛋白位點，可獲得2種亞型：MCI和MCII，它們在30 bp的小衛(wèi)星重復(fù)數(shù)上存在差異。這些發(fā)現(xiàn)為了解花栗鼠隱孢子蟲基因型I的傳播動力學(xué)提供了有價值的信息。

Nader等 ^［21］在一項研究中，分析了21個全基因組序列來闡明人類傳染性疾病的進化。他們發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲分裂為兩個亞支，而專門的人源性亞型IIc-a與正在經(jīng)歷正選擇驅(qū)動的快速趨同進化的人隱孢子蟲共享一個基因座子集。微小隱孢子蟲亞型IIc-a在端粒周圍基因的插入和缺失突變水平較高，這也是其他專門亞型的特征。隱孢子蟲亞型之間的遺傳交換在整個隱孢子蟲屬的進化中起著突出的作用。研究者還發(fā)現(xiàn)重組區(qū)富集了正選擇基因和潛在毒力因子，這表明了適應(yīng)性漸滲。研究還表明，4種人源性隱孢子蟲亞型和其研究中包括的蟲種之間的滲入是最近發(fā)生的，可能在過去的1 000年內(nèi)。

為了深入了解牛源牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲之間生物學(xué)差異的遺傳決定因素。Xu等^［22］對它們進行了基因組測序，并將其映射到參考基因組微小隱孢子蟲IOWA株。他們證明了牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲具有與微小隱孢子蟲相似的基因結(jié)構(gòu)和代謝途徑。然而，它們的基因組缺乏與入侵相關(guān)的黏液糖蛋白、類胰島素蛋白酶、MEDLE分泌蛋白和其他SPDs，這表明這兩個蟲種的宿主范圍較窄。此外，F(xiàn)LGN、SKSR和NFDQ等其他SPDs蛋白的缺失可能與牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲致病性降低有關(guān)，這還需要進一步研究。

在已知的物種中，引起綿羊和山羊隱孢子蟲病的肖氏隱孢子蟲先前被認為是牛隱孢子蟲的一種基因型。Li等^［23］對這兩個隱孢子蟲分離株進行了基因組測序，并進行了比較基因組分析，以確定這種適應(yīng)綿羊的隱孢子蟲與其他隱孢子蟲相比序列的獨特性。結(jié)果表明，肖氏隱孢子蟲與牛隱孢子蟲具有95.8%的基因組相似性和相似的基因含量。與此一致的是，肖氏隱孢子蟲和牛隱孢子蟲似乎都具有較少的編碼線粒體代謝酶和入侵相關(guān)蛋白家族的基因。然而，它們似乎擁有幾種物種特有的基因。進一步分析表明，這兩種隱孢子蟲的序列差異主要在24個高度多態(tài)性基因上，其中一半位于亞端粒區(qū)。這些亞端?；蛑械囊恍┚幋a分泌蛋白經(jīng)歷了正選擇。此外，鑒定為XXIIIf和XXIIIh亞型的兩個肖氏隱孢子蟲分離株的基因組具有99.9%的核苷酸序列相似性，具有6個高度分化的編碼推定分泌蛋白的基因。因此，這些物種特異性基因和亞端粒基因的序列多態(tài)性可能是造成肖氏隱孢子蟲與牛隱孢子蟲不同寄主偏好的原因。

3 隱孢子蟲遺傳進化分析

2022年，Tichkule等 ^［24］提出了一項全面的全基因組研究，包括來自五大洲16個國家的114個分離株。研究者發(fā)現(xiàn)了兩種具有不同生物學(xué)和人口學(xué)特征的譜系，它們大約在500年前分化。他們認為這些譜系是兩個亞種，并建議命名為人隱孢子蟲hominis和人隱孢子蟲 aquapotentis（IbA10G2亞型）。這項研究中，人隱孢子蟲hominis幾乎完全由來自非洲和亞洲中低收入國家的分離株所代表，并且似乎經(jīng)歷了最近的群體收縮。相比之下，人隱孢子蟲 aquapotentis主要在高收入國家發(fā)現(xiàn)，主要在歐洲、北美和大洋洲，而且似乎正在擴大。人隱孢子蟲aquapotentis與高傳播率（在人之間）有關(guān)，這可以解釋其在衛(wèi)生基礎(chǔ)設(shè)施發(fā)達的國家流行的原因。研究還發(fā)現(xiàn)，在亞種之間的二次接觸后發(fā)生了基因滲入。最近的基因流從人隱孢子蟲aquapotentis到人隱孢子蟲hominis，可能與人類遷移的增加有關(guān)，這可能會推動更具毒性的人隱孢子蟲變種的進化。

2022年，Wang等 ^［25］對不同國家的101個微小隱孢子蟲分離株進行全基因組測序，該研究揭示了微小隱孢子蟲的宿主適應(yīng)性、遺傳特征及重組機制等。研究發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲IIa和IId亞型家族共7個亞群體，它們具有宿主范圍多樣性以及地理相關(guān)性，其中IId亞型家族主要來自亞洲，IIa亞型家族主要來自歐洲。研究還發(fā)現(xiàn)不同宿主源的微小隱孢子蟲分離株亞端粒區(qū)域與入侵相關(guān)的基因拷貝數(shù)不同，這可能與宿主適應(yīng)性的改變有關(guān)，并提出微小隱孢子蟲宿主適應(yīng)性演化的觀點。該研究也證實了動物貿(mào)易導(dǎo)致微小隱孢子蟲的傳播，并能夠改變其宿主范圍和群體結(jié)構(gòu)，這也為防止集約化發(fā)達國家微小隱孢子蟲IIa亞型家族流入我國做了預(yù)警。

2023年，Huang等 ^［26］對127個人隱孢子蟲進行全基因組測序，并聯(lián)合已發(fā)表的95個人隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在美國出現(xiàn)一種超傳播的人隱孢子蟲IfA12G1R5亞型。研究發(fā)現(xiàn)美國的IfA12G1R5亞型存在多個祖先起源，其中Pop6簇起源于東非地區(qū)，傳播美國后與當?shù)氐膩喰桶l(fā)生重組；Pop13簇從歐洲引進，與當?shù)亓餍邢x株發(fā)生重組；Pop14簇這是前兩者二次重組的后代。研究發(fā)現(xiàn)人隱孢子蟲全基因組中與入侵相關(guān)位點適應(yīng)性選擇導(dǎo)致了Pop14簇在美國成為主導(dǎo)亞型。研究表明，人隱孢子蟲多次引入和蟲種間的遺傳重組，以及適應(yīng)性選擇造成了美國超傳播IfA12G1R5亞型的出現(xiàn)，這也提醒人們監(jiān)測IfA12G1R5亞型的重要性，防止其全球傳播擴散。

2023年，Carey等 ^［27］報道了從孟加拉國嬰兒身上分離出來的微小隱孢子蟲的基因組分析以及對英國序列的重新分析。來自這兩個地點的人源分離株共享154個變異，這些變異不存在于牛源的參考基因組中，這表明宿主對寄生蟲的特定適應(yīng)。值得注意的是，34.6%的人源分離株特有的單核苷酸多態(tài)性是非同義的，其中8.2%是在分泌的蛋白中。研究中，連鎖不平衡的衰減表明了微小隱孢子蟲發(fā)生頻繁重組。微小隱孢子蟲的遺傳多樣性對疫苗和治療設(shè)計有潛在影響。

4 展 望

目前，利用基因組學(xué)技術(shù)在隱孢子蟲的研究上取得了重要進展，然而還有許多領(lǐng)域尚未探索，一些問題仍然存在。比如：（1）如何建立有效的隱孢子蟲體外培養(yǎng)體系，來推進隱孢子蟲基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)；（2）如何完善隱孢子蟲常規(guī)轉(zhuǎn)染方法；（3）如何整合隱孢子蟲多組學(xué)技術(shù)，來揭示隱孢子蟲生命周期變化。這些問題對開展隱孢子蟲基因組學(xué)進一步研究工作至關(guān)重要，利用基因組學(xué)確定關(guān)鍵的功能基因，以此來挖掘潛在的治療和疫苗靶點。隱孢子蟲多組學(xué)可用于研究宿主和隱孢子蟲之間的互作，促進對宿主和隱孢子蟲之間關(guān)系的全面分析。這種全面的分析方法將為隱孢子蟲入侵機制和逃避宿主免疫防御的機制提供更深入的理解。

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（編輯 白永平）