豬流行性腹瀉疫苗研究進(jìn)展

摘 要： 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種傳染性腸道疾病，可造成豬群暴發(fā)腹瀉和初生仔豬大量死亡。2010年，高致病性的PEDV變異毒株出現(xiàn)并在全球范圍內(nèi)傳播，已成為當(dāng)前豬腹瀉病的主要病原之一，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。疫苗免疫是防控PED的最主要措施?，F(xiàn)有PED商品化疫苗以傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗為主。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、重組活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和核酸疫苗等的研究也都取得了突破性進(jìn)展。由于PEDV變異頻繁，不斷給疫苗研發(fā)帶來新的挑戰(zhàn)，高效的疫苗研發(fā)平臺及基因工程疫苗對未來PED防控至關(guān)重要。本文對PEDV的病原學(xué)特征和最新的疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，并展望未來的疫苗發(fā)展方向，以期為有效防控PED提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉；豬流行性腹瀉病毒；滅活疫苗；弱毒疫苗；基因工程疫苗；核酸疫苗

中圖分類號：S8285.3;S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1042-17

收稿日期：2024-05-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金（32122086）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（32402921）

作者簡介：鄔沛伶（2001-），女，湖南衡陽人，博士生，主要從事動物新型疫苗的研究，E-mail：p_p@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：劉青蕓，主要從事動物重大疫病流行病學(xué)與病原學(xué)、致病機(jī)制、疫苗研制等研究，E-mail：LIUQY@mail.hzau.edu.cn；王湘如，主要從事動物源性人獸共患病和動物重大疫病的病原學(xué)、致病機(jī)制、診斷和防控研究，E-mail：wangxr228@mail.hzau.edu.cn

Research Progress of Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine for Pigs

WU" Peiling1， LI" Yixuan1， WANG" Haojie1， LI" Yafei1， LIU" Shaomeng1， LIU" Qingyun^1*， WANG

Xiangru^1，2*

（1.The Cooperative lmnovation Center for Sustainable Pig Production， College of Veterinary

Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China; 2.State Key

Laboratory of Agricultural Microbiology， College of Veterinary Medicine， Huazhong

Agricultural University， Wuhan 430070，" China）

Abstract：" The porcine epidemic diarrhea （PED） is an infectious intestinal disease caused by porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）， which results in an outbreak of diarrhea in pigs and high mortality in newborn piglet. In 2010， a highly pathogenic mutant strain of PEDV emerged and spread globally， which has presently been one of the main pathogens of porcine diarrhea and caused large losses for the global swine industry. Vaccination is the primary measure for preventing and controlling PED. Currently， available commercial PED vaccines mainly consist of traditional inactivated and attenuated vaccines. With the development of genetic engineering technologies in recent years， significant advancements have been made in the study of subunit vaccines， virus-like particle vaccines， recombinant vector vaccines， transgenic plant vaccines， and nucleic acid vaccines. The frequent variations of PEDV continues to bring new challenges to the vaccine development. Therefore， efficient vaccine development platforms and engineering vaccines are crucial for future prevention and control of PED. This article provides a systematic review of the pathogenic characteristics of PEDV and the latest advancements in vaccine research， as well as prospects for future vaccine development， aiming to provide a reference for effective prevention and control of PED.

Keywords： porcine epidemic diarrhea （PED）; porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）; inactivated vaccine; attenuated vaccine; engineering vaccine; nucleic acid vaccines

*Corresponding authors：" LIU Qingyun，E-mail： LIUQY@mail.hzau.edu.cn; WANG Xiangru， E-mail： wangxr228@mail.hzau.edu.cn

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性的傳染性腸道疾病。PEDV可感染各個(gè)年齡階段的豬，病豬臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水乃至死亡。其中，新生仔豬的感染情況最為嚴(yán)重，死亡率可達(dá)90%～100%^［1］。PEDV于1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)，1978年在比利時(shí)分離出PEDV毒株，并將其命名為“CV777”，隨后疫情席卷歐洲。20世紀(jì)80年代，PEDV傳入中國，特別是自2010年以來，高致病性PEDV變異毒株引起了國內(nèi)疫情大暴發(fā)，并表現(xiàn)出發(fā)病率高、死亡率高和大范圍傳播的新趨勢。2018—2021年，PEDV在我國規(guī)?；i場的陽性檢出率基本在50%以上，給生豬養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失^［2］。

目前尚無針對PEDV的有效藥物，生物安全措施結(jié)合疫苗接種是最主要的防控手段?，F(xiàn)有商品化PED疫苗以傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗為主，但由于PEDV基因型多且變異頻率高，疫苗對變異毒株的免疫保護(hù)效果有待加強(qiáng)。近年來，基因工程疫苗因其良好的安全性和免疫效果而備受關(guān)注，目前已開發(fā)出亞單位疫苗、重組活載體疫苗、病毒樣顆粒疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和核酸疫苗等。本文綜述了PEDV病原學(xué)特征和PED疫苗的最新研究進(jìn)展，并對未來疫苗的發(fā)展進(jìn)行展望，旨在為生產(chǎn)實(shí)踐中有效防控PED提供參考。

1 PEDV基因組與S蛋白特征

PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子近似球形，粒子直徑為130～170 nm，表面由棒狀突起覆蓋?；蚪M全長約為28 kb，包含5′帽子結(jié)構(gòu)、3′poly （A）尾和7個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）。其中ORF1a和ORF1b占據(jù)基因組的2/3，編碼非結(jié)構(gòu)多聚蛋白1a和1ab，這兩種多聚蛋白在3C樣蛋白酶和類木瓜蛋白酶的作用下裂解為16種非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，nsp）；另1/3基因組主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為棘突蛋白S、包膜蛋白E、囊膜蛋白M和核衣殼蛋白N^［3］。

S蛋白是一種位于病毒表面的糖蛋白，通過與宿主細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合介導(dǎo)病毒的入侵，并與病毒的組織或宿主嗜性相關(guān)^［4］。S蛋白由兩個(gè)亞基組成，分別是外部的S1亞基和內(nèi)部的S2亞基。S1亞基由N端信號肽、N末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域組成，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合。S2亞基由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合；其中，S2亞基的胞外域包括蛋白酶切割位點(diǎn)、融合肽和兩個(gè)七肽重復(fù)區(qū)。S蛋白是PEDV重要的免疫原性蛋白，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)六個(gè)中和表位S10（aa 19—220）、S1A（aa 435—485），COE（aa 499—638）、SS2（aa 748—755）、SS6（aa 764—771）和2C10（aa 1368—1374）^［5-9］。因此，S蛋白常被作為PEDV疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)對PEDV S基因的遺傳進(jìn)化研究，PEDV毒株可分為GⅠ型和GⅡ型，其中GⅠ型又分為GⅠa和GⅠb亞型，GⅡ型又分為GⅡa和GⅡb亞型。當(dāng)前我國優(yōu)勢流行毒株為GⅡ變異型^［10］。2014年，美國首次分離到一株低致病性PEDV-OH851株，與其它PEDV流行毒株的S基因相比，OH851株的S基因有3個(gè)缺失（167位1 nt缺失，176位11 nt缺失，416位3 nt缺失），1個(gè)插入位點(diǎn)（474—475位之間6 nt插入），S1區(qū)前1 170 nt有多個(gè)突變^［11］，這種新出現(xiàn)的毒株被命名為“S-INDEL”毒株。

2 PED商品疫苗概況

2.1 PED國內(nèi)商品疫苗概況

2015年3月24日，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）三聯(lián)活疫苗正式發(fā)布，這是中國大陸第一個(gè)豬腹瀉病毒三聯(lián)疫苗，能夠同時(shí)預(yù)防三種主要的豬病毒性腹瀉疾病。目前，國內(nèi)已有30余家生產(chǎn)企業(yè)獲得PED疫苗的生產(chǎn)批準(zhǔn)文號，其中以生產(chǎn)TGEV、PEDV二聯(lián)疫苗居多，毒株以經(jīng)典毒株CV777為主，但使用GⅠ群經(jīng)典毒株CV777研制的疫苗可能無法針對當(dāng)前流行的GⅡ群毒株提供很好的免疫保護(hù)力，因此，近幾年也陸續(xù)發(fā)布了針對AJ1102株（2017年首次批簽發(fā)）、SCSZ-1株（2018年首次批簽發(fā)）、LW/L株（2018年首次批簽發(fā)）、XJ-DB2株（2021年首次批簽發(fā)）和CHYJ株（2023年首次批簽發(fā)）等變異流行毒株的PED商品疫苗。PEDV主要感染腸道上皮細(xì)胞，通過胃腸道免疫激發(fā)乳腺分泌sIgA抗體，仔豬通過初乳攝取sIgA抗體后可以獲得針對PEDV的被動免疫保護(hù)，因此誘發(fā)有效的黏膜免疫是預(yù)防仔豬感染PEDV的關(guān)鍵。2023年，由海大集團(tuán)發(fā)布的海瀉康-豬流行性腹瀉滅活疫苗（CHYJ株）成為國內(nèi)首個(gè)獲批的腹瀉類黏膜免疫疫苗，其推薦免疫方式為滴鼻免疫，突破了以往的注射免疫方式，為未來的PEDV疫苗研究提供了新的方向。2024年國內(nèi)批簽發(fā)的PED商品疫苗種類包括豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯(lián)弱毒活疫苗和豬流行性腹瀉滅活疫苗，采用的毒株包括PEDV經(jīng)典毒株（CV777株、ZJ-08株）和變異毒株（AJ1102-R株、SCZ-1株、LW/L株、XJ-DB2株、CHYJ株）（表1）。

2018—2023年已獲臨床批件的疫苗數(shù)據(jù)表明（表2），相比過去主要圍繞豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)疫苗進(jìn)行研發(fā)與生產(chǎn)，目前關(guān)于PEDV商品疫苗則主要圍繞豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬丁型冠狀病毒三聯(lián)滅活疫苗和豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行研發(fā)，所采用毒株已全部為PEDV流行變異毒株，這與當(dāng)前臨床病毒性腹瀉的流行現(xiàn)狀高度契合。亞單位疫苗具有便于規(guī)?；a(chǎn)、安全性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，首個(gè)由CHO細(xì)胞表達(dá)的PEDV S蛋白亞單位疫苗CHO-3G12株也已進(jìn)入臨床審批階段。近幾年獲臨床批件的PEDV相關(guān)疫苗類型代表了未來商品化豬腹瀉疫苗的主要趨勢，相信在未來能夠?yàn)榉揽刎i病毒性腹瀉疾病提供更有力的保障。

2.2 國外商品疫苗概況

韓國于1992年首次報(bào)道PEDV^［12］，此后PED在其許多省份流行，成為韓國最重要的豬病毒性腹瀉疾病之一，并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了防控PED，韓國第一種基于GⅠa型PEDV毒株SM98-1的滅活疫苗在2004年上市。該毒株還通過在細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)致弱，用于制作弱毒疫苗。此外，韓國研究人員通過將分離得到的PEDV毒株在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代獲得GⅠa型PEDV減毒株KPEDV-9和DR-13并制成弱毒疫苗，兩種疫苗的免疫途徑分別為肌肉接種免疫和口服免疫^［13-14］。而在日本，研究人員將GⅠa型PEDV毒株83P-5在Vero細(xì)胞中傳代100次后制成弱毒疫苗（P-5 V）^［15］，該疫苗在日本和韓國被廣泛使用。2013年春季，美國確認(rèn)了一種PEDV GⅡb變異株，該毒株導(dǎo)致的疫情暴發(fā)在一年內(nèi)導(dǎo)致新生仔豬大量死亡^［16］。隨后，該毒株迅速傳播到美洲、歐洲和亞洲國家，在世界范圍內(nèi)引發(fā)了第二波PED流行^［17］。由于使用PEDV GⅠa型經(jīng)典毒株生產(chǎn)的疫苗無法對GⅡb型變異毒株感染提供良好的保護(hù)效果，因此，GⅡb型PEDV毒株被認(rèn)為是開發(fā)下一代疫苗的關(guān)鍵。2014年6月，美國批準(zhǔn)了一款用于緊急接種的PEDV mRNA疫苗（PED-RP）^［18］。同年9月，由碩騰公司開發(fā)的PEDV全病毒滅活疫苗上市。同時(shí)，韓國還開發(fā)了由韓國分離株KNU-141113 S-DEL5/ORF3生產(chǎn)的GⅡb口服活疫苗^［19］，并于2020年起投入豬場使用，該疫苗也是全球首個(gè)PEDV GⅡb口服弱毒疫苗。

3 PED傳統(tǒng)疫苗研究現(xiàn)狀

3.1 滅活疫苗

早期的PED滅活疫苗是將病豬的小腸組織處理并滅活后加入佐劑制成，也稱為組織滅活疫苗。中國最早報(bào)道的PED滅活疫苗就是1993年由王明等^［20］ 用PEDV滬毒株攻毒后取發(fā)病仔豬的腸組織懸液制成的氫氧化鋁組織滅活疫苗。PED組織滅活疫苗的制備方法較為簡易，且具有較強(qiáng)的病原針對性；但通常難以確定組織中的病原含量，并含有很多異源物質(zhì)和不確定因素，不易于大規(guī)模生產(chǎn)。相比之下，以病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物制成的細(xì)胞滅活疫苗質(zhì)量可控，還能基于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，發(fā)展前景更為廣闊^［21］。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉滅活疫苗研究如表3所示。常小云等^［22］利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)將PEDV GF10變異株制備成滅活苗，并免疫妊娠母豬，結(jié)果表明該疫苗對于仔豬的保護(hù)率高達(dá)90%，且仔豬獲得的母源抗體可持續(xù)至35日齡以上。郭振剛等^［23］用PEDV GS毒株細(xì)胞滅活苗免疫妊娠母豬，所產(chǎn)7日齡仔豬的母源抗體中和效價(jià)為（1∶128）～（1∶256），并且可持續(xù)至28日齡左右。為簡化疫苗開發(fā)工藝，Singh等^［24］將PEDV CO2013毒株在44℃熱處理10 min以展開結(jié)構(gòu)蛋白，隨后用RNAse使基因組片段化，最后在25℃下重新折疊衣殼蛋白以制備PED滅活苗，免疫3周齡仔豬可以提供針對PEDV強(qiáng)毒株的保護(hù)作用。使用胰蛋白酶依賴性的PEDV毒株作為疫苗毒株會使疫苗制備過程更復(fù)雜，并增加疫苗生產(chǎn)的成本。Li等^［25］利用相應(yīng)的PEDV JS2008毒株（非胰蛋白酶依賴型PEDV GⅠ毒株）序列替換PEDV AJ1102毒株（胰蛋白酶依賴型PEDV GⅡ毒株）的S2結(jié)構(gòu)域（aa 894—1386），生成重組毒株rAJ1102-S2′JS2008。rAJ1102-S2′JS2008可以獨(dú)立于胰蛋白酶進(jìn)行穩(wěn)定傳代，滅活后對4周齡仔豬進(jìn)行三次肌肉注射可以誘導(dǎo)仔豬同時(shí)產(chǎn)生針對AJ1102和JS2008毒株的中和抗體。

滅活疫苗具有安全性高、便于貯存和運(yùn)輸及生產(chǎn)工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，但其免疫效果較差，無法誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，需要多次接種才能達(dá)到持久的免疫效果。因此，滅活疫苗通常需要適當(dāng)?shù)拿庖咴鰪?qiáng)劑。Xu等^［26］將PEDV AH2012/12毒株滅活后添加Flic佐劑制成滅活疫苗，對妊娠母豬間隔14 d進(jìn)行兩次滴鼻免疫后，母豬血清和初乳中均產(chǎn)生了高水平的IgG、IgA和中和抗體，仔豬存活率提升了73.34%。Hsueh等^［27］使用PEDV PT-5毒株制成滅活疫苗后對5周齡仔豬進(jìn)行肌肉注射，與未添加佐劑的滅活疫苗相比，使用CCL蛋白作為佐劑的滅活疫苗可誘導(dǎo)更高水平的特異性IgG和sIgA抗體。Choe等^［28］用PEDV SGP-M1毒株混合Carbopol 940 NF聚合物制成滅活疫苗，在妊娠母豬分娩前5周和2周各皮下接種1次，可保護(hù)所產(chǎn)仔豬免受強(qiáng)毒株的攻擊，仔豬存活率為70%。建立腸黏膜免疫反應(yīng)包括病毒特異性IgA的分泌，是預(yù)防PEDV感染的關(guān)鍵。Zhang等^［29］研究發(fā)現(xiàn)，與口服免疫相比，滴鼻免疫PED滅活疫苗后仔豬腸道內(nèi)中和抗體水平更高，表明滴鼻免疫在誘導(dǎo)腸黏膜免疫反應(yīng)方面更有效，是一種很有潛力的滅活疫苗接種方式。

3.2 弱毒疫苗

PED弱毒疫苗是指將PEDV強(qiáng)毒株的毒力和致病性降低后制備而成的疫苗，如何將強(qiáng)毒株在致弱的同時(shí)保留其免疫原性是弱毒疫苗研究的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的致弱手段是通過在細(xì)胞中連續(xù)傳代而獲得PEDV弱毒株。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉弱毒疫苗研究如表4所示。Jang等^［30］將強(qiáng)毒株KNU-141112在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代，獲得了弱毒株S DEL5/ORF3作為疫苗候選毒株。妊娠母豬口服弱毒活苗并在分娩前加強(qiáng)免疫兩次市售滅活疫苗后，所產(chǎn)仔豬的存活率從0%提高到100%，腹瀉程度顯著減輕。Schumacher等^［31］將PEDV IL20697毒株在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代并純化后得到減毒株，母豬妊娠79 d時(shí)口服免疫，100 d時(shí)加強(qiáng)免疫，結(jié)果母豬與新生仔豬均產(chǎn)生了高水平的特異性IgG和sIgA抗體；與對照組相比，仔豬存活率顯著提高，但在仔豬糞便排毒方面沒有明顯差異。為了降低細(xì)胞連續(xù)傳代而帶來的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，Won等^［32］通過降低Vero細(xì)胞的生長溫度，對PEDV Aram-P5強(qiáng)毒株進(jìn)行短期傳代，從而獲得了一種冷適應(yīng)的低傳代弱毒株Aram-P29-CA。臨床試驗(yàn)表明，給仔豬接種該毒株后并沒有出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀，表明該毒株在正常體溫下不會返強(qiáng)；將Aram-P29-CA免疫妊娠母豬后，在母豬的初乳中檢測到較高的抗體水平，并顯著提高了仔豬存活率。Kim等^［33］將分離的GⅡb型PEDV毒株在各種培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代，包括在培養(yǎng)基中補(bǔ)充L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮（TPCK）處理的胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）和糖去氧膽酸（GCDCA），最終產(chǎn)生了六種弱毒株：CKT-7 T15（含TPCK處理的胰蛋白酶）、CKT-7 T15N（含TPCK處理的胰蛋白酶和GCDCA）、CKT-7 N（含GCDCA）、CKT-7 NF（含GCDCA和FBS）、CKT-7 F（含F(xiàn)BS）和 CKT-7 X（無補(bǔ)充劑），并基于此來制備弱毒疫苗。動物試驗(yàn)結(jié)果顯示CKT-7 N毒株的病毒滴度最高，峰值約為（8.67±0.29）lg TCID50·mL^-1，且在5日齡仔豬中未觀察到死亡或腹瀉癥狀，表明CKT-7 N株為最適合的候選疫苗毒株。

隨著PEDV基因組信息增多，利用基因工程技術(shù)敲減或敲除毒力基因獲得弱毒株正成為PEDV弱毒疫苗的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)的安全性更高、研發(fā)過程更高效、生產(chǎn)工藝更簡便。Hou等^［34］通過抑制nsp16的2′-O甲基轉(zhuǎn)移酶的活性并同時(shí)敲除S蛋白胞內(nèi)域的內(nèi)吞信號序列，設(shè)計(jì)了PEDV KDKE4A-SYA重組弱毒株，該毒株感染細(xì)胞可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的I型和III型干擾素反應(yīng)，免疫妊娠母豬后對新生仔豬的保護(hù)率可達(dá)100%，表明nsp16蛋白可以作為開發(fā)PED弱毒疫苗的通用靶標(biāo)。Deng等^［35］通過使PEDV中的干擾素拮抗蛋白nsp1、nsp15和nsp16失活得到了弱毒株icPEDV-mute4，仔豬感染該毒株后未表現(xiàn)相關(guān)癥狀，并且誘發(fā)了針對PEDV的IgG中和抗體反應(yīng)，為研制PED弱毒疫苗提供了新的方向。冠狀病毒S蛋白的N-糖基化位點(diǎn)突變是影響哺乳動物冠狀病毒感染，傳播，致病性和免疫原性的關(guān)鍵因素。Zhang等^［36］通過用天冬酰胺氨基酸替換aa 514和aa 556位點(diǎn)的絲氨酸，生成了三種重組PEDV，分別命名為r12-N514G、r12-N556G和r12-N514+556G。與親本病毒相比，重組病毒可以誘導(dǎo)5日齡仔豬產(chǎn)生高水平的sIgA和IgG抗體，抗體滴度在12 dpi時(shí)達(dá)到峰值水平，其原因可能是去除糖基化位點(diǎn)會暴露S蛋白的抗原表位，以削弱病毒對宿主免疫反應(yīng)的逃逸能力，但重組PEDV仍會引起組織病變，其安全性還有待考量。

與PED滅活疫苗相比，弱毒活疫苗具有更好的免疫原性，能夠有效刺激腸道黏膜而產(chǎn)生黏膜免疫，并可以長期保持免疫效果，減少多次接種帶來的豬群應(yīng)激。但弱毒活疫苗的保存和運(yùn)輸條件較為嚴(yán)格，并具有返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。針對2010年后出現(xiàn)的PEDV變異毒株，基于經(jīng)典毒株制備的商品化疫苗可能無法提供理想的保護(hù)效果。因此，基于基因工程的PED新型疫苗研究正成為熱點(diǎn)。

4 PED基因工程疫苗研究現(xiàn)狀

4.1 亞單位疫苗

PED亞單位疫苗是指將PEDV的結(jié)構(gòu)/非結(jié)構(gòu)蛋白克隆于特定的表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)體外高效表達(dá)和純化，以獲得的重組蛋白作為免疫原制備的疫苗。S蛋白在PEDV入侵宿主和病毒-宿主膜融合中發(fā)揮重要作用，并且具有多個(gè)B淋巴細(xì)胞抗原表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此S蛋白被認(rèn)為是開發(fā)PED亞單位疫苗的重要靶標(biāo)。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉亞單位疫苗研究如表5所示。

原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVs）是制備亞單位疫苗常用的表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)可在短時(shí)間獲得大量目標(biāo)蛋白，具有大規(guī)模生產(chǎn)的能力，但不能對病毒蛋白進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾，不利于保持蛋白的抗原活性。郭濤^［37］使用大腸桿菌pET-32a原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組PEDV CH/PDS/2015株COE蛋白并制備亞單位疫苗，通過肌肉注射和口服免疫后，3月齡仔豬血清特異性IgG和唾液中的sIgA均有所升高。Choe等^［38］使用大腸桿菌pG5-S1D原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PEDV S1亞基的可溶性aP2蛋白，并用HPMCP微球包裹蛋白，配合使用口服疫苗佐劑LLRANKL。妊娠母豬在分娩前4周和前2周進(jìn)行兩次口服免疫后，初乳中sIgA抗體、中和抗體均顯著增加，所產(chǎn)仔豬的存活率與商品滅活疫苗免疫組相似。真核表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的目標(biāo)蛋白，維持蛋白的天然空間構(gòu)像，有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，但存在成本較高、培養(yǎng)效率較低等問題。武旺盛等^［39］用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功制備穩(wěn)定表達(dá)PEDV KM242131株S1蛋白的重組HEK-293T細(xì)胞，與佐劑結(jié)合后制備亞單位疫苗，肌肉注射斷奶仔豬，兩次加強(qiáng)免疫后能刺激仔豬機(jī)體產(chǎn)生特異性sIgA抗體，唾液sIgA的S/P值最高可達(dá)0.59。Guo等^［40］成功制備穩(wěn)定表達(dá)PEDV AH2012/12株全長S蛋白、S1亞基和S蛋白多表位串聯(lián)的三聚體蛋白的重組HEK-293T細(xì)胞，并使用氫氧化鋁佐劑M401和水基佐劑M103分別制成亞單位疫苗S/M401、S1/M401、COEs/M401和S/M103、S1/M103、COEs/M103。小鼠試驗(yàn)表明S/M103免疫組小鼠的中和抗體滴度最高，為1∶96，故選擇S/M103亞單位疫苗在仔豬中進(jìn)一步評估。3日齡仔豬肌肉接種免疫后，S/M103誘導(dǎo)的IgG、IgA、IFN-γ和中和抗體水平相對較高，保護(hù)效果優(yōu)于商品滅活疫苗，并對GⅡa型毒株具有一定的交叉保護(hù)作用，表明S/M103 具有作為臨床候選亞單位疫苗的潛力。

BEVs可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行恰當(dāng)?shù)恼郫B和翻譯后修飾，從而使表達(dá)的蛋白接近天然蛋白，并且昆蟲細(xì)胞可大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。吳松^［41］利用BEVs表達(dá)了的PEDV CT株的S1蛋白并制備亞單位疫苗，免疫妊娠75 d的母豬后，在母豬的血清和乳汁中分別能檢測到高水平的IgG和sIgA抗體，對仔豬的保護(hù)率為75.32%。Chang等^［42］用家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）表達(dá)PEDV PT株的S蛋白后制成亞單位疫苗，對4周齡仔豬間隔2周口服免疫3次后，不能檢測到針對PEDV的特異性體液免疫反應(yīng)和黏膜免疫反應(yīng)，研究人員認(rèn)為這可能是由于豬胃腸道的低pH環(huán)境和消化酶酶解能力導(dǎo)致疫苗失活，以及疫苗未添加佐劑來克服口服耐受性，需要探究更好的策略來使口服疫苗在胃腸道遞送并保留其免疫原性。Yu等^［43］用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PEDV CO株的S蛋白后制成亞單位疫苗，新生仔豬每兩周肌肉注射兩劑疫苗后可在血清檢測到高滴度的中和抗體，但仔豬在5周齡受到PEDV強(qiáng)毒株攻擊后表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉癥狀。結(jié)果表明該亞單位疫苗可能會誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對融合后PEDV S蛋白的非中和抗體，并產(chǎn)生抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)。

基因工程亞單位疫苗可利用體外表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白大量表達(dá)，便于規(guī)?；a(chǎn)，具有安全性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)還可配套病原體其他蛋白作為抗原建立診斷方法，以區(qū)分亞單位疫苗免疫和野毒感染。然而，與含有完整病原體成分的疫苗相比，亞單位疫苗的免疫原性較低，通常需要佐劑輔助來增強(qiáng)免疫效果。Wang等^［44］在PEDV亞單位疫苗中添加復(fù)合佐劑CpG5和MF59，對30日齡的仔豬肌肉免疫后，復(fù)合佐劑組仔豬的IgG抗體滴度明顯高于單獨(dú)使用兩種佐劑的組別，表明MF59和CpG5的佐劑組合具有協(xié)同效應(yīng)，可在PEDV亞單位疫苗中產(chǎn)生更強(qiáng)烈和更持久的免疫增強(qiáng)反應(yīng)。

4.2 病毒樣顆粒疫苗

PEDV病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是一種和病毒結(jié)構(gòu)相似的空心顆粒，基于PEDV的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白（不含核酸）組裝而成。與亞單位疫苗相比，VLPs可以模擬病毒自然感染的過程，誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用。同時(shí)，由于VLPs缺乏遺傳物質(zhì)，因此不存在自主復(fù)制的能力和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，安全性更高。

近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉VLPs疫苗研究如表6所示。Lu等^［45］將PEDV S蛋白的B細(xì)胞表位⁷⁴⁸YSNIGVCK⁷⁵⁵重組到乙肝病毒核心衣殼蛋白（HBcAg）中制備VLPs，在妊娠母豬分娩前6周進(jìn)行3次肌肉注射，每次間隔2周；與對照組相比，所產(chǎn)仔豬的攻毒后存活率提升30%，發(fā)病癥狀減輕。Hsu等^［46］以PEDV VLPs（包含S、M和E蛋白）為抗原，輔以CCL25和CCL28作為佐劑，免疫4周齡仔豬后能夠檢測到高水平的特異性IgG和sIgA抗體，并誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫。ADDomer是一種基于腺病毒多聚蛋白的納米顆粒骨架，其與BEVs聯(lián)合產(chǎn)生的VLPs疫苗表現(xiàn)出優(yōu)異的免疫原性，具有巨大的開發(fā)前景^［47］。Du等^［48］同時(shí)將PEDV S蛋白的SS2和2C10結(jié)構(gòu)域以及TGEV S蛋白的A和D位點(diǎn)插入到ADDomer框架中，并通過BEVS表達(dá)重組蛋白AD、AD-P、AD-T和AD-PT，隨后將自組裝的重組ADDomer-VLPs制備成疫苗。臨床結(jié)果表明，該重組ADDomer-VLPs疫苗能夠有效刺激仔豬產(chǎn)生針對PEDV和TGEV的中和抗體以及Th1型和Th2型免疫反應(yīng)。Trimer-Tag（蛋白質(zhì)三聚體化）技術(shù)平臺可以使任意一個(gè)目的蛋白三聚體化，獲得穩(wěn)定的類天然三聚體結(jié)構(gòu)的病毒抗原，為開發(fā)VLPs提供了新的思路。該技術(shù)平臺已通過新冠肺炎疫苗（SCB-2019）全面驗(yàn)證，SCB-2019已在中國獲得緊急使用授權(quán)。Li等^［49］使用Trimer-Tag平臺生產(chǎn)了PEDV GS2022毒株的S1-Trimer、COE-Trime和RBD-Trimer作為候選亞單位疫苗。妊娠母豬于產(chǎn)前35 d和20 d進(jìn)行兩次肌肉接種免疫，結(jié)果表明，與RBD-Trimer和COE-Trimer相比，S1-Trimer表現(xiàn)出優(yōu)勢。S1-Trimer在妊娠母豬的血清、初乳和唾液中誘導(dǎo)高水平的PEDV特異性IgG和sIgA抗體，同時(shí)還誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫，母豬PBMC中的IFN-γ和IL-4的表達(dá)量顯著升高，所產(chǎn)仔豬的血清和腸道樣本中均檢測到高水平的IgG、IgA和中和抗體。

4.3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是基于同源重組原理研發(fā)的疫苗，將PEDV編碼有效抗原蛋白的基因重組到活載體的基因組中并使之表達(dá)?；钶d體疫苗的安全性高，生產(chǎn)成本低，能夠激發(fā)體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫?；钶d體的基因組能容納足夠的外源基因，可用于多聯(lián)或多價(jià)疫苗的研制。研發(fā)重組活載體疫苗時(shí)，應(yīng)注意載體安全性、外源基因表達(dá)量、重組菌/毒株遺傳穩(wěn)定性等問題。目前主要包括細(xì)菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗。

4.3.1 細(xì)菌活載體疫苗

細(xì)菌活載體疫苗通常通過口服免疫，重組菌在體內(nèi)可與病原體競爭腸道黏膜結(jié)合位點(diǎn)，起到免疫保護(hù)作用。目前常用的細(xì)菌活載體包括腸道乳酸菌和枯草芽胞桿菌。乳酸菌可以在膽汁和低pH值條件下存活，因此可以保證重組菌在通過胃腸道過程中的免疫原性^［50］。此外，乳酸菌易于通過腸道吸收，有利于產(chǎn)生黏膜免疫^［51］。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉細(xì)菌活載體疫苗研究如表7所示。Zang等^［52］用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）表達(dá)PEDV CH-SDBZ-1-2015毒株的S1蛋白，構(gòu)建了重組菌L. acidophilus-S1，妊娠母豬口服免疫后，初乳中特異性sIgA抗體水平顯著升高，可為新生仔豬提供良好的被動免疫。Zheng等^［53］用約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）表達(dá)PEDV HLJ-2012株S蛋白的中和表位COE區(qū)，從而構(gòu)建了重組菌株pPG-T7g10-COE/L. johnsonii，母豬口服免疫后在母乳中檢測到高水平的PEDV特異性IgG和sIgA抗體，為仔豬預(yù)防PEDV感染提供了有效保護(hù)。馬茹夢^［54-55］以工程菌干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus casei 393）、豬源副干酪乳酪桿菌（L. paracasei 27-2）、豬源羅伊氏黏液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri J31）和豬源約氏乳桿菌（L. johnsonii 6332）為宿主菌，構(gòu)建表達(dá)PEDV CH/HLJ/2019 毒株S1蛋白的四株重組菌株并將其口服免疫新生仔豬，結(jié)果表明重組豬源L. paracasei 27-2的益生性、抗逆性、遺傳穩(wěn)定性和免疫應(yīng)答效果均優(yōu)于其他三種重組菌，為構(gòu)建更為有效的乳酸菌口服疫苗提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。Guo等^［56］用干酪乳桿菌（L. casei ATCC 393）表達(dá)PoRV 6Ds蛋白、PEDV COE蛋白和TGEV VP4蛋白，構(gòu)建了重組乳酸菌pPG-T7g10-6Ds-COE-VP4/LC393，新生仔豬口服免疫后誘導(dǎo)了針對三種病毒的特異性黏膜免疫和體液免疫。此外，枯草芽胞桿菌作為活載體制備PEDV載體疫苗具有安全性高、免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)。Wang等^［57］將PEDV ZJ08毒株的抗原表位COE重組至枯草芽胞桿菌（B. subtilis WB800）中獲得重組菌B. subtilis RC，口服免疫仔豬后顯著提高了仔豬CD3＋T細(xì)胞的數(shù)量和CD4＋/CD8＋T細(xì)胞的比率，并檢測到高滴度的特異性IgG和sIgA抗體水平。

4.3.2 病毒活載體疫苗

由于病毒活載體本身有助于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并且可以攜帶多種外源基因片段，因此被認(rèn)為是一種理想的疫苗研發(fā)載體。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉病毒活載體疫苗研究如表8所示。腺病毒（adenovirus，AdV）是最常用的病毒活載體。AdV具有非整合性的表達(dá)基因和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，因此被廣泛用于表達(dá)外源抗原的疫苗開發(fā)^［58］。Do等^［59］構(gòu)建了編碼LTB和PEDV COE的重組腺病毒rAd-LTB-COE，對3周齡仔豬進(jìn)行肌肉注射或口服免疫后均可誘導(dǎo)高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫。Wang等^［60］構(gòu)建了表達(dá)特異性靶向PEDV SH2012-5株N蛋白的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scvFs）的重組腺病毒rAdV-ZW1-16、rAdV-ZW3-21、rAdV-ZW1-41和rAdV-ZW4-16，3日齡仔豬口服免疫后顯著抑制了PEDV誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，恢復(fù)了IFN-λ的表達(dá)水平，在仔豬受到PEDV強(qiáng)毒株的攻擊后可以起到保護(hù)作用，為后續(xù)開發(fā)基于單鏈抗體的疫苗提供了基礎(chǔ)。Liu等^［61］用AdV表達(dá)PEDV CH/HBXT/2018株的S蛋白，構(gòu)建了重組病毒rAd-PEDV-S，對4周齡豬進(jìn)行兩次肌肉注射后誘發(fā)了特異性體液免疫反應(yīng)，可以在仔豬受到PEDV強(qiáng)毒株的攻擊時(shí)起到保護(hù)作用，保護(hù)率為40%（2/5）。Song等^［62］構(gòu)建了表達(dá)PEDV/CH/TP-4-4/2018株S蛋白的重組腺病毒rAd5-PEDV-S，設(shè)計(jì)了在妊娠母豬分娩前5周和2周進(jìn)行兩次肌肉接種以及在分娩前5周進(jìn)行單次肌肉接種的兩種免疫程序。結(jié)果顯示，通過這兩種免疫程序引起的IgA、IgG和NAb滴度的差異并不顯著，這可能是因?yàn)閞Ad5-PEDV-S免疫的豬體內(nèi)已經(jīng)存在抗腺病毒的抗體，表明在分娩前5周給母豬進(jìn)行單次rAd5-PEDV-S疫苗接種也可能是一種可行的免疫方案。目前，大多數(shù)PEDV商業(yè)疫苗都推薦在母豬分娩前5周和2周進(jìn)行兩次免疫接種，Song等^［62］的這一發(fā)現(xiàn)對減少母豬免疫應(yīng)激具有重要意義。

水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是一種有潛力的外源表達(dá)病毒載體，已被用作構(gòu)建人用疫苗的平臺。Ke等^［63］以VSV為載體表達(dá)PEDV/CHN/SHANGHAI/2012 株的S蛋白，獲得了重組病毒VSVMT-SΔ19，對妊娠母豬進(jìn)行2次肌肉注射后，妊娠母豬和所產(chǎn)仔豬（5日齡）血清中均含有針對PEDV G2b型的中和抗體；但作為活疫苗對母豬進(jìn)行滴鼻免疫后在血清中沒有檢測到中和抗體，推測原因可能是S蛋白未在宿主細(xì)胞中表達(dá)或抗原表位未被抗原呈遞細(xì)胞獲取。Wang等^［64］以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）C株表達(dá)了PEDV GX750A毒株的S1N和COE結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了重組病毒vC/SM3’UTRN-CARD/tPAsS1NCOE，對5周齡仔豬肌肉接種后可誘導(dǎo)產(chǎn)生同時(shí)針對CSFV和PEDV的高免疫應(yīng)答，并具有對抗CSFV和PEDV強(qiáng)毒株感染的保護(hù)作用，有望在臨床上達(dá)到一針兩防的免疫效果，從而減少豬群免疫次數(shù)。

TGEV、PoRV和PEDV都是引起仔豬腹瀉疾病的冠狀病毒。Li等^［65］構(gòu)建了表達(dá)PoRV VP7蛋白的重組PEDV病毒rPEDV-PoRV-VP7，接種10日齡仔豬后，在其唾液中檢測到針對PoRV VP7蛋白和PEDV S蛋白特異性sIgA抗體，表明該疫苗可以有效誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，為開發(fā)PEDV和PoRV的二聯(lián)疫苗提供了思路。Pascual-Iglesias等^［66］構(gòu)建了表達(dá)PEDV-NVSL株S蛋白的重組TGEV病毒rTGEV-RS-SPEDV，三周齡仔豬口服接種后誘導(dǎo)了針對PEDV的特異性體液免疫反應(yīng)，可以保護(hù)仔豬免受PEDV強(qiáng)毒株的攻擊，但TGEV抗體檢測為陰性。

4.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是將PEDV主要保護(hù)性抗原基因整合到植物細(xì)胞基因組中形成轉(zhuǎn)基因植物，利用植物作為生物反應(yīng)器大量表達(dá)外源蛋白，將外源蛋白作為疫苗或?qū)⑥D(zhuǎn)基因植物直接加工飼喂動物使其獲得免疫。近五年在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究如表9所示。Ho等^［67］用本氏煙草表達(dá)PEDV PS6株的COE/G2a-p2蛋白，肌肉注射妊娠母豬后，可在所產(chǎn)仔豬5日齡時(shí)檢測到高水平IgG、COE-IgA、中和抗體和IFN-λ，并可以保護(hù)仔豬免受PEDV強(qiáng)毒株的攻擊。Sohn等^［68］用本氏煙草表達(dá)融合了豬Fc結(jié)構(gòu)域（pFc2）的PEDV S1蛋白，妊娠母豬在產(chǎn)前6周和2周進(jìn)行兩次肌肉注射免疫，可在母豬的初乳和血清中檢測到高水平的中和抗體，對哺乳仔豬的保護(hù)率達(dá)80%。尹國友^［69］將PEDV HeNPEDV-01株的S1基因?qū)氲椒阎校o仔豬口服轉(zhuǎn)基因番茄后可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而有效保護(hù)仔豬。Egelkrout等^［70］將PEDV Colorado/2013毒株的S蛋白與不耐熱腸毒素B亞基和樹突狀細(xì)胞肽融合后轉(zhuǎn)化至玉米中，檢測到目的抗原蛋白表達(dá)量可以達(dá)到20 mg·kg^-1，仔豬口服轉(zhuǎn)基因玉米后可產(chǎn)生高水平的血清中和抗體。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有成本低廉、穩(wěn)定性好和便于貯存等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物疫苗的抗原蛋白可作為口服疫苗或飼料添加劑，便于大規(guī)模免疫應(yīng)用，具有廣闊的發(fā)展前景。但是目前抗原蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量通常較低，且由于動物個(gè)體攝入量不一，免疫效果不易保障，因此未來還有待繼續(xù)發(fā)展。

5 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼PEDV特異性抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對該抗原蛋白的特異性免疫應(yīng)答。核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。現(xiàn)有在豬體內(nèi)進(jìn)行過動物試驗(yàn)的豬流行性腹瀉核酸疫苗研究如表10所示。DNA疫苗以質(zhì)粒為載體表達(dá)抗原基因，免疫時(shí)以重組質(zhì)粒的形式直接注射到宿主體內(nèi)，或先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至載體菌內(nèi)，依靠載體菌將疫苗質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。Yin等^［71］用pPI-2.EGFP載體構(gòu)建了共表達(dá)PoRV VP7基因和PEDV S基因的DNA疫苗pPI-7.EGFP.VP7.S，經(jīng)肌肉注射免疫小鼠后誘導(dǎo)了抗S蛋白和VP7蛋白的特異性免疫應(yīng)答。Zhang等^［72］用鼠傷寒沙門菌（S. Typhimurium aroA）SL7207構(gòu)建了共表達(dá)TGEV SC-H毒株和PEDV SC-L毒株S基因的DNA疫苗pVAXD-PS1-TS，20日齡仔豬口服免疫后可有效刺激針對TGEV和PEDV的體液免疫、黏膜免疫和細(xì)胞免疫。相比mRNA疫苗，DNA疫苗更加穩(wěn)定，制備方法也更加簡單，但重組質(zhì)粒具有整合到宿主細(xì)胞基因組中的風(fēng)險(xiǎn)。其次，DNA疫苗目標(biāo)蛋白的表達(dá)需要經(jīng)過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個(gè)步驟才能產(chǎn)生免疫原，這導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的表達(dá)效率相對較低，限制了DNA疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。

相對于DNA疫苗，mRNA疫苗只能實(shí)現(xiàn)一輪感染，不具備連續(xù)感染能力，從而減少了與宿主細(xì)胞基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)。但mRNA疫苗通常需要借助額外的載體進(jìn)行遞送，如脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）和復(fù)制缺陷型病毒顆粒。2014年6月，美國批準(zhǔn)了一款用于緊急接種的PEDV mRNA疫苗（PED-RP），PED-RP是將 PEDV S基因連接到pVEK載體中制備而成，pVEK是基于復(fù)制缺陷型的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒開發(fā)的一種載體^［18］。此外，PED-RP也是美國第一個(gè)用于預(yù)防PEDV的mRNA疫苗。2020年，在菲律賓某豬場開展了針對該疫苗的免疫效力試驗(yàn)，結(jié)果表明該疫苗能夠促進(jìn)母豬初乳和常乳中中和抗體、IgG和sIgA的產(chǎn)生，從而給仔豬提供有效的保護(hù)^［73］。楊利敏等^［74］選擇PEDV NB-F71毒株的RBD結(jié)構(gòu)域作為疫苗靶抗原，制備了基于RBD單體和二聚體的mRNA疫苗，妊娠母豬產(chǎn)前7周先免疫弱毒疫苗，4周后分別免疫RBD-D mRNA候選疫苗或滅活疫苗，結(jié)果表明mRNA和滅活疫苗誘導(dǎo)的中和抗體平均滴度分別達(dá)到531.8和464.8，無顯著性差異，提示mRNA疫苗可誘導(dǎo)與滅活疫苗相近的抗體水平。Zhao等^［75］設(shè)計(jì)了用LNPs封裝的mRNA（mRNA-LNP）疫苗，編碼PEDV AH2012/12株的S蛋白。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，3日齡仔豬肌肉接種疫苗后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG和sIgA抗體，且免疫后3個(gè)月內(nèi)IgG抗體仍保持相對較高的水平，同時(shí)還能夠激活細(xì)胞免疫應(yīng)答；妊娠母豬免疫后，母豬血清和初乳中的特異性IgG和sIgA抗體滴度顯著增加，并能在仔豬血清中檢測到IgG與sIgA抗體，為仔豬提供了良好的被動免疫。

核酸疫苗屬于第三代疫苗，同時(shí)具備亞單位疫苗的安全性和弱毒疫苗的時(shí)效性，能夠更好地刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答。同時(shí)，核酸疫苗的研發(fā)生產(chǎn)周期相對較短，當(dāng)病原體發(fā)生變異時(shí)只需要替換相關(guān)的基因序列就能夠快速地制備新疫苗。這些特點(diǎn)在新冠mRNA疫苗的成功應(yīng)用中得到了體現(xiàn)，隨著mRNA技術(shù)的不斷發(fā)展和產(chǎn)業(yè)鏈的完善，核酸疫苗有望在未來成為獸用疫苗領(lǐng)域的主力軍。

6 展 望

傳統(tǒng)的滅活疫苗具有安全性好、無毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)、制品穩(wěn)定、便于保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)；弱毒疫苗具有免疫作用快、免疫期長、適用于多種免疫途徑等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于臨床預(yù)防PED。隨著高致病性PEDV變異株的出現(xiàn)，傳統(tǒng)疫苗的效果逐漸受到挑戰(zhàn)。因此，提高滅活疫苗的有效抗原含量以及平衡弱毒疫苗的有效性和安全性成為加強(qiáng)傳統(tǒng)疫苗免疫保護(hù)效力的關(guān)鍵。雖然基因工程技術(shù)的發(fā)展為新型PED疫苗的研發(fā)提供了新的思路和平臺，但由于安全性、生產(chǎn)成本、免疫保護(hù)效果和研發(fā)周期等限制因素，基因工程疫苗在實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用還需要時(shí)間。在新冠疫情暴發(fā)后，mRNA疫苗作為備受關(guān)注的疫苗類型，為未來研發(fā)PED疫苗提供了新的途徑和思路。

PEDV是一種腸道感染的病毒。相比于刺激機(jī)體產(chǎn)生血清IgG抗體，刺激腸道免疫產(chǎn)生的sIgA抗體更能有效保護(hù)仔豬。因此，未來PED疫苗的研究重點(diǎn)應(yīng)放在如何刺激腸道免疫以誘導(dǎo)sIgA抗體的產(chǎn)生以及對sIgA抗體水平的快捷評估。PEDV的蛋白結(jié)構(gòu)與功能挖掘、致病與免疫機(jī)制解析有助于為PED疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)，并為通用性冠狀病毒疫苗的研發(fā)提供新的策略。此外，優(yōu)化不同類型疫苗的組合使用、創(chuàng)新免疫接種方式和建立現(xiàn)代化疫苗技術(shù)平臺都有助于提高現(xiàn)有疫苗的免疫效果。隨著不斷的科學(xué)推進(jìn)和技術(shù)發(fā)展，人們有望看到更多PED疫苗研究技術(shù)的突破，從而保障養(yǎng)豬行業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ SUN R Q， CAI R J， CHEN Y Q， et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets， China［J］. Emerg Infect Dis， 2012， 18（1）：161-163.

［2］ LI C， LU H Y， GENG C， et al. Epidemic and evolutionary characteristics of swine enteric viruses in South-Central China from 2018 to 2021［J］. Viruses， 2022， 14（7）：1420.

［3］ BRIAN D A， BARIC R S. Coronavirus genome structure and replication［J］. Curr Top Microbiol Immunol， 2005， 287：1-30.

［4］ LI W T， VAN KUPPEVELD F J M， HE Q G， et al. Cellular entry of the porcine epidemic diarrhea virus［J］. Virus Res， 2016， 226：117-127.

［5］ LI C H， LI W T， DE ESESARTE E L， et al. Cell attachment domains of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein are key targets of neutralizing antibodies［J］. J Virol， 2017， 91（12）：e00273-17.

［6］ CHANG C Y， CHENG I C， CHANG Y C， et al. Identification of neutralizing monoclonal antibodies targeting novel conformational epitopes of the porcine epidemic diarrhoea virus spike protein［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）：2529.

［7］ CHANG S H， BAE J L， KANG T J， et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］. Mol Cells， 2002， 14（2）：295-299.

［8］ SUN D B， FENG L， SHI H Y， et al. Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein［J］. Vet Microbiol， 2008， 131（1-2）：73-81.

［9］ CRUZ D J M， KIM C J， SHIN H J. Phage-displayed peptides having antigenic similarities with porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） neutralizing epitopes［J］. Virology， 2006， 354（1）：28-34.

［10］ 左媛媛， 徐天剛， 戈勝強(qiáng)， 等. 我國豬流行性腹瀉病毒流行現(xiàn)狀及分子遺傳演化特征［J］. 中國動物檢疫， 2022， 39（9）：9-17.

ZUO Y Y， XU T G， GAO S Q， et al. Prevalence and molecular genetic evolution of porcine epidemic diarrhea virus in China［J］. China Animal Health Inspection， 2022， 39（9）：9-17. （in Chinese）

［11］ WANG L Y， BYRUM B， ZHANG Y. New variant of porcine epidemic diarrhea virus， United States， 2014［J］. Emerg Infect Dis， 2014， 20（5）：917-919.

［12］ KWEON C H， KWON B J， JUNG T S， et al. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Korea［J］. Korean J Vet Res， 1993， 33（2）：249-254.

［13］ SONG D S， OH J S， KANG B K， et al. Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain［J］. Res Vet Sci， 2007， 82（1）：134-140.

［14］ KWEON C H， KWON B J， LEE J G， et al. Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） as vaccine candidate［J］. Vaccine， 1999， 17（20-21）：2546-2553.

［15］ SATO T， TAKEYAMA N， KATSUMATA A， et al. Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of virulence in vivo［J］. Virus Genes， 2011， 43（1）：72-78.

［16］ STEVENSON G W， HOANG H， SCHWARTZ K J， et al. Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States： clinical signs， lesions， and viral genomic sequences［J］. J Vet Diagn Invest， 2013， 25（5）：649-654.

［17］ LIN C M， SAIF L J， MARTHALER D， et al. Evolution， antigenicity and pathogenicity of global porcine epidemic diarrhea virus strains［J］. Virus Res， 2016， 226：20-39.

［18］ GERDTS V， ZAKHARTCHOUK A. Vaccines for porcine epidemic diarrhea virus and other swine coronaviruses［J］. Vet Microbiol， 2017， 206：45-51.

［19］ BAEK P S， CHOI H W， LEE S， et al. Efficacy of an inactivated genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus vaccine in neonatal piglets［J］. Vet Immunol Immunopathol， 2016， 174：45-49.

［20］ 王 明， 馬思奇， 周金法， 等. 豬流行性腹瀉滅活疫苗的研究［J］. 中國畜禽傳染病， 1993（5）：17-19.

WANG M， MA S Q， ZHOU J F， et al. Research on inactivated vaccine against epidemic diarrhea in pigs［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 1993（5）：17-19. （in Chinese）

［21］ 董世娟， 謝春芳， 司伏生， 等. 豬流行性腹瀉病毒免疫及疫苗研制［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2021， 37（8）：2603-2613.

DONG S J， XIE C F， SI F S， et al. Immunization against porcine epidemic diarrhea virus and vaccine development［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2021， 37（8）：2603-2613. （in Chinese）

［22］ 常小云， 趙潤澤， 同 珂， 等. 一株變異型豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其滅活疫苗的免疫效力試驗(yàn)［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2020， 47（11）：3651-3658.

CHANG X Y， ZHAO R Z， TONG K， et al. Isolation and identification of a variant porcine epidemic diarrhea virus and the immune efficacy of its inactivated vaccine［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2020， 47（11）：3651-3658. （in Chinese）

［23］ 郭振剛， 胡江鋒， 王 婷， 等. 豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗的研制［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2021， 42（2）：26-33.

GUO Z G， HU J F， WANG T， et al. Isolation and identification of porcine epidemic diarrhea virus and development of inactivated vaccine［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2021， 42（2）：26-33. （in Chinese）

［24］ SINGH G， SINGH P， PILLATZKI A， et al. A minimally replicative vaccine protects vaccinated piglets against challenge with the porcine epidemic diarrhea virus［J］. Front Vet Sci， 2019， 6：347.

［25］ LI M X， ZHANG Y Y， FANG Y X， et al. Construction and immunogenicity of a trypsin-independent porcine epidemic diarrhea virus variant［J］. Front Immunol， 2023， 14：1165606.

［26］ XU X W， DU L P， FAN B C， et al. A flagellin-adjuvanted inactivated porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） vaccine provides enhanced immune protection against PEDV challenge in piglets［J］. Arch Virol， 2020， 165（6）：1299-1309.

［27］ HSUEH F C， CHANG Y C， KAO C F， et al. Intramuscular immunization with chemokine-adjuvanted inactive porcine epidemic diarrhea virus induces substantial protection in pigs［J］. Vaccines （Basel）， 2020， 8（1）：102.

［28］ CHOE S， PARK G N， SONG S， et al. Efficacy of needle-less intradermal vaccination against porcine epidemic diarrhea virus［J］. Pathogens， 2021， 10（9）：1115.

［29］ ZHANG E， WANG J L， LI Y C， et al. Comparison of oral and nasal immunization with inactivated porcine epidemic diarrhea virus on intestinal immunity in piglets［J］. Exp Ther Med， 2020， 20（2）：1596-1606.

［30］ JANG G， WON H， LEE D U， et al. Assessment of the safety and efficacy of an attenuated live vaccine based on highly virulent genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus in nursing piglets［J］. Vet Microbiol， 2019， 231：120-128.

［31］ SCHUMACHER L， CHEN Q， FREDERICKS L， et al. Evaluation of the efficacy of an S-INDEL PEDV strain administered to pregnant gilts against a virulent Non-S-INDEL PEDV challenge in newborn piglets［J］. Viruses， 2022， 14（8）：1801.

［32］ WON H， LEE D U， JANG G， et al. Generation and protective efficacy of a cold-adapted attenuated genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus［J］. J Vet Sci， 2019， 20（4）：e32.

［33］ KIM D M， MOON S H， KIM S C， et al. Development of effective PEDV vaccine candidates based on viral culture and protease activity［J］. Vaccines （Basel）， 2023， 11（5）：923.

［34］ HOU Y X， KE H Z， KIM J， et al. Engineering a live attenuated porcine epidemic diarrhea virus vaccine candidate via inactivation of the viral 2′-O-methyltransferase and the endocytosis signal of the spike protein［J］. J Virol， 2019， 93（15）：e00406-19.

［35］ DENG X F， BUCKLEY A C， PILLATZKI A， et al. Inactivating three interferon antagonists attenuates pathogenesis of an enteric coronavirus［J］. J Virol， 2020， 94（17）：e00565-20.

［36］ ZHANG G G， PENG Q， LIU S Y， et al. The glycosylation sites in RBD of spike protein attenuate the immunogenicity of PEDV AH2012/12［J］. Virus Res， 2024， 345：199381.

［37］ 郭 濤. 豬流行性腹瀉病毒COE亞單位疫苗制備及免疫原性分析［D］. 石河子： 石河子大學(xué)， 2021.

GUO T. Preparation and immunogenicity analysis of porcine epidemic diarrhea virus COE subunit vaccine［D］. Shihezi： Shihezi University， 2021. （in Chinese）

［38］ CHOE S， SONG S， PIAO D C， et al. Efficacy of orally administered porcine epidemic diarrhea vaccine-loaded hydroxypropyl methylcellulose phthalate microspheres and RANKL-secreting L. lactis［J］. Vet Microbiol， 2020， 242：108604.

［39］ 武旺盛， 顏仁和， 仇珍珍， 等. 豬流行性腹瀉病毒重組S1蛋白的免疫原性評價(jià)［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2021， 51（3）：305-313.

WU W S， YAN R H， QIU Z Z， et al. Immunogenicity of recombinant S1 of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Chinese Veterinary Science， 2021， 51（3）：305-313. （in Chinese）

［40］ GUO W L， WANG C H， SONG X， et al. Immunogenicity and protective efficacy of a trimeric full-length S protein subunit vaccine for porcine epidemic diarrhea virus［J］. Vaccine， 2024， 42（4）：828-839.

［41］ 吳 松. 豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的桿狀病毒表達(dá)及其免疫原性的研究［D］. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

WU S. The study on the baculovirus expression and immunogenicity of PEDV S1 protein［D］. Guangzhou： South China Agricultural University， 2018. （in Chinese）

［42］ CHANG C Y， HSU W T， TSAI P S， et al. Oral administration of porcine epidemic diarrhea virus spike protein expressing in silkworm pupae failed to elicit immune responses in pigs［J］. AMB Express， 2020， 10（1）：20.

［43］ YU J S， SREENIVASAN C， UPRETY T， et al. Piglet immunization with a spike subunit vaccine enhances disease by porcine epidemic diarrhea virus［J］. NPJ Vaccines， 2021， 6（1）：22.

［44］ WANG Y T， LIU S J， LI B S， et al. A novel CpG ODN compound adjuvant enhances immune response to spike subunit vaccines of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Front Immunol， 2024， 15：1336239.

［45］ LU Y， CLARK-DEENER S， GILLAM F， et al. Virus-like particle vaccine with B-cell epitope from porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） incorporated into hepatitis B virus core capsid provides clinical alleviation against PEDV in neonatal piglets through lactogenic immunity［J］. Vaccine， 2020， 38（33）：5212-5218.

［46］ HSU C W， CHANG M H， CHANG H W， et al. Parenterally administered porcine epidemic diarrhea virus-like particle-based vaccine formulated with CCL25/28 chemokines induces systemic and mucosal immune protectivity in pigs［J］. Viruses， 2020， 12（10）：1122.

［47］ LUO C W， YAN Q H， HUANG J C， et al. Using self-assembling ADDomer platform to display B and T epitopes of type O foot-and-mouth disease virus［J］. Viruses， 2022， 14（8）：1810.

［48］ DU P F， YAN Q H， ZHANG X A， et al. Virus-like particle vaccines with epitopes from porcine epidemic virus and transmissible gastroenteritis virus incorporated into self-assembling ADDomer platform provide clinical immune responses in piglets［J］. Front Immunol， 2023， 14：1251001.

［49］ LI L J， YIN S H， ZHOU J J， et al. Spike 1 trimer， a nanoparticle vaccine against porcine epidemic diarrhea virus induces protective immunity challenge in piglets［J］. Front Microbiol， 2024， 15：1386136.

［50］ PFEILER E A， AZCARATE-PERIL M A， KLAENHAMMER T R. Characterization of a novel bile-inducible operon encoding a two-component regulatory system in Lactobacillus acidophilus［J］. J Bacteriol， 2007， 189（13）：4624-4634.

［51］ BERMDEZ-HUMARN L G， KHARRAT P， CHATEL J M， et al. Lactococci and lactobacilli as mucosal delivery vectors for therapeutic proteins and DNA vaccines［J］. Microb Cell Fact， 2011， 10（S1）：S4.

［52］ ZANG Y， TIAN Y， LI Y G， et al. Recombinant Lactobacillus acidophilus expressing S1 and S2 domains of porcine epidemic diarrhea virus could improve the humoral and mucosal immune levels in mice and sows inoculated orally［J］. Vet Microbiol， 2020， 248：108827.

［53］ ZHENG D Z， WANG X N， JU N， et al. Immune responses in pregnant sows induced by recombinant lactobacillus johnsonii expressing the COE protein of porcine epidemic diarrhea virus provide protection for piglets against PEDV infection［J］. Viruses， 2021， 14（1）：7.

［54］ 馬茹夢. 不同乳桿菌受體菌表達(dá)豬流行性腹瀉病毒保護(hù)性抗原S1誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的比較研究［D］. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2023.

MA R M. Comparative study on the immune response induced by the different Lactobacillus receptor bacteria with expressing the protective antigen S1 of porcine epidemic diarrhea virus［D］. Harbin： Northeast Agricultural University， 2023. （in Chinese）

［55］ 馬茹夢， 趙玉梁， 馬明爽， 等. 不同豬源受體菌表達(dá)豬流行性腹瀉病毒保護(hù)性抗原S1誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的比較研究［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2024， 55（5）： 2090-2099.

MA R M， ZHAO Y L， MA M S， et al. Comparative Study on the immune response induced by the different porcine receptor bacteria with expressing the protective antigen S1 of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2024， 55（5）： 2090-2099. （in Chinese）

［56］ GUO T T， GAO C， HAO J H， et al. Strategy of developing oral vaccine candidates against co-infection of porcine diarrhea viruses based on a Lactobacillus delivery system［J］. Front Microbiol， 2022， 13：872550.

［57］ WANG J L， HUANG L L， MOU C X， et al. Mucosal immune responses induced by oral administration recombinant Bacillus subtilis expressing the COE antigen of PEDV in newborn piglets［J］. Biosci Rep， 2019， 39（3）：BSR20182028.

［58］ YU D， JIN C， RAMACHANDRAN M， et al. Adenovirus serotype 5 vectors with Tat-PTD modified Hexon and serotype 35 Fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures［J］. PLoS One， 2013， 8（1）：e54952.

［59］ DO V T， JANG J， PARK J， et al. Recombinant adenovirus carrying a core neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and heat-labile enterotoxin B of Escherichia coli as a mucosal vaccine［J］. Arch Virol， 2020， 165（3）：609-618.

［60］ WANG F Q， ZHANG Q， ZHANG F Q， et al. Adenovirus vector-mediated single chain variable fragments target the nucleocapsid protein of porcine epidemic diarrhea virus and protect against viral infection in piglets［J］. Front Immunol， 2023， 14：1058327.

［61］ LIU X S， ZHAO D H， ZHOU P， et al. Evaluation of the efficacy of a recombinant adenovirus expressing the spike protein of porcine epidemic diarrhea virus in pigs［J］. Biomed Res Int， 2019， 2019：8530273.

［62］ SONG X， ZHOU Q， ZHANG J Q， et al. Immunogenicity and protective efficacy of recombinant adenovirus expressing a novel genotype G2b PEDV spike protein in protecting newborn piglets against PEDV［J］. Microbiol Spectr， 2024， 12（1）：e0240323.

［63］ KE Y， YU D Y， ZHANG F Q， et al. Recombinant vesicular stomatitis virus expressing the spike protein of genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus：a platform for vaccine development against emerging epidemic isolates［J］. Virology， 2019， 533：77-85.

［64］ WANG H， YI W C， QIN H， et al. A Genetically engineered bivalent vaccine coexpressing a molecular adjuvant against classical swine fever and porcine epidemic diarrhea［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（15）：11954.

［65］ LI W， LEI M K， LI Z F， et al. Development of a genetically engineered bivalent vaccine against porcine epidemic diarrhea virus and porcine rotavirus［J］. Viruses， 2022， 14（8）：1746.

［66］ PASCUAL-IGLESIAS A， SANCHEZ C M， PENZES Z， et al. Recombinant chimeric transmissible gastroenteritis virus （TGEV）—porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） virus provides protection against virulent PEDV［J］. Viruses， 2019， 11（8）：682.

［67］ HO T T， TRINH V T， TRAN H X， et al. The immunogenicity of plant-based COE-GCN4pII protein in pigs against the highly virulent porcine epidemic diarrhea virus strain from genotype 2［J］. Front Vet Sci， 2022， 9：940395.

［68］ SOHN E J， KANG H， MIN K， et al. A plant-derived maternal vaccine against porcine epidemic diarrhea protects piglets through maternally derived immunity［J］. Vaccines （Basel）， 2023， 11（5）：965.

［69］ 尹國友. 豬流行性腹瀉病毒抗原基因在番茄中的表達(dá)及動物免疫試驗(yàn)［D］. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)， 2020.

YIN G Y. Expression of porcine epidemic diarrhea virus antigen gene in tomato and animal immunoassay［D］. Xinxiang： Henan Normal University， 2020. （in Chinese）

［70］ EGELKROUT E， HAYDEN C， FAKE G， et al. Oral delivery of maize-produced porcine epidemic diarrhea virus spike protein elicits neutralizing antibodies in pigs［J］. Plant Cell Tissue Organ Cult， 2020， 142（1）：79-86.

［71］ YIN Y， ZHU L， LIU P J， et al. Evaluation on the efficacy and immunogenicity of recombinant DNA plasmids expressing S gene from porcine epidemic diarrhea virus and VP7 gene from porcine rotavirus［J］. Braz J Microbiol， 2019， 50（1）：279-286.

［72］ ZHANG Y D， ZHANG X H， LIAO X D， et al. Construction of a bivalent DNA vaccine co-expressing S genes of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus delivered by attenuated Salmonella typhimurium［J］. Virus Genes， 2016， 52（3）：354-364.

［73］ SAWATTRAKOOL K， STOTT C J， BANDALARIA-MARCA R D， et al. Field trials evaluating the efficacy of porcine epidemic diarrhea vaccine， RNA （Harrisvaccine） in the Philippines［J］. Trop Anim Health Prod， 2020， 52（5）：2743-2747.

［74］ 楊利敏， 王俊虹， 徐明國， 等. 豬流行性腹瀉mRNA疫苗的制備與免疫原性評價(jià)［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2023， 39（7）：2624-2633.

YANG L M， WANG J H， XU M G， et al. Preparation and immunogenicity evaluation of mRNA vaccine against porcine epidemic diarrhea［J］. Chinese Journal of Biotechnology， 2023， 39（7）：2624-2633. （in Chinese）

［75］ ZHAO Y X， FAN B C， SONG X， et al. PEDV-spike-protein-expressing mRNA vaccine protects piglets against PEDV challenge［J］. mBio， 2024， 15（2）：e0295823.

（編輯 白永平）