冬蟲夏草通過調控AMPK/mTOR通路保護高糖誘導的足細胞損傷

摘要：目的 探討冬蟲夏草通過調節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路對高糖誘導的足細胞損傷的影響。方法 體外培養(yǎng)小鼠足細胞，分為正常葡萄糖濃度（NG）組、高糖（HG）組、高糖+冬蟲夏草（HG+CS）組、高糖+冬蟲夏草+自噬抑制劑（HG+CS+3MA）組、高糖+冬蟲夏草+AMPK抑制劑（HG+CS+Compound C）組。CCK-8法檢測足細胞活力；蛋白免疫印跡法檢測足細胞標志蛋白podocin、nephrin，自噬相關蛋白Beclin-1、P62以及通路相關蛋白磷酸化AMPK（p-AMPK）、磷酸化mTOR（p-mTOR）的表達。結果 與NG組比較，HG組足細胞活力降低，podocin、nephrin、Beclin-1、p-AMPK蛋白表達水平降低，P62、p-mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與HG組相比，HG+CS組足細胞活力升高，podocin、nephrin、Beclin-1、p-AMPK蛋白表達水平升高，P62、p-mTOR蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組和HG+CS+Compound C組足細胞活力均降低，podocin、nephrin、Beclin-1蛋白表達水平均降低，P62蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；HG+CS+Compound C組p-AMPK蛋白表達水平降低，p-mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05）。結論 冬蟲夏草可能通過上調AMPK/mTOR信號傳導通路來激活自噬、改善高糖誘導的足細胞損傷，從而發(fā)揮糖尿病腎病足細胞保護作用。

關鍵詞：冬蟲夏草；糖尿病腎??；自噬；足細胞；AMPK/mTOR信號通路

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240816

Effect of Cordyceps sinensis on podocyte damage induced by high glucose by regulating the AMPK/mTOR pathway

LI Bingxin1， XU Junying1， ZHANG Yaru1， ZHOU Xiaobing2△

1 Department of Nephrology， 2 Department of Minimally Invasive Center for General Surgery， the Second People’s Hospital of Hunan Province （Brain Hospital of Hunan Province）， Changsha 410021， China

△Corresponding Author E-mail： 150634509@qq.com

Abstract： Objective To investigate effects of Cordyceps sinensis （CS） on high glucose （HG） induced podocyte injury by regulating the adenylate activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway. Methods Mouse podocytes were cultured in vitro and divided into the normal glucose （NG） group， the HG group， the HG+CS group， the HG+CS+autophagy inhibitor （HG+CS+3MA） group" and the HG+CS+AMPK inhibitor （HG+CS+Compound C） group. Podocyte viability was detected by CCK-8 method. Western blot assay was used to detect the expression levels of podocyte marker proteins podocin and nephrin， autophagy-related proteins Beclin-1 and P62， and pathway related proteins p-AMPK and p-mTOR. Results Compared with the NG group， the cell viability of podocytes decreased， the expression levels of podocin， nephrin，Beclin-1 and p-AMPK protein were decreased， and the expression levels of P62 and p-mTOR protein were increased in the HG group （P＜0.05）. Compared with the HG group， the cell viability of podocytes was increased， the expression levels of podocin， nephrin， Beclin-1 and p-AMPK protein were significantly increased （P＜0.05）， and the expression levels of P62 and p-mTOR protein were decreased in the HG+CS group （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the cell viability decreased in the HG+CS+3MA group and the HG+CS+Compound C group （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the HG+CS+3MA group and the HG+CS+Compound C group showed decreased expression levels of podocin， nephrin and Beclin-1 protein， and increased expression of P62 protein （P＜0.05）. Compared with the HG+CS group， the expression of p-AMPK protein decreased and the expression of p-mTOR protein increased in the HG+CS+Compound C group （P＜0.05）. Conclusion Cordyceps sinensis may play a protective role in diabetic nephropathy by up-regulating AMPK/mTOR signaling pathway to induce podocyte autophagy， alleviate high glucose induced podocyte injury and apoptosis.

Key words： cordyceps; diabetic nephropathies; autophagy; podocytes; AMPK/mTOR signaling pathway

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）是指糖尿病所導致的腎臟損害，是糖尿病所致全身微血管病變的常見并發(fā)癥之一，是慢性腎功能不全的重要原因。足細胞損傷是DN發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，其中足細胞自噬活性降低是DN足細胞損傷的關鍵因素［1］。提高足細胞自噬活性可抑制細胞損傷，進而減少蛋白尿并延緩DN進展［2］。冬蟲夏草（cordyceps sinensis，CS）是一種名貴的蟲草屬植物類中草藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌，含有多種有效生物活性成分，可通過多種機制減少尿蛋白、改善腎臟功能及減輕腎臟病理改變。研究表明冬蟲夏草治療DN療效確切［3］，且其可通過調控自噬對急性腎損傷發(fā)揮治療作用［4］。自噬的活性受腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等多種信號通路的調控。然而，有關冬蟲夏草能否通過調節(jié)自噬及介導信號通路來改善DN的研究尚少見。本研究通過探討冬蟲夏草是否通過干預AMPK/mTOR信號通路來調控自噬，從而改善高糖誘導的足細胞損傷，為冬蟲夏草防治DN提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠永生足細胞系MPC-5購自上海雅吉生物科技有限公司；人工冬蟲夏草菌液購自杭州中美華東制藥有限責任公司，為冬蟲夏草原料經醇提、水提及酵解制備而成；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自美國HyClone公司；自噬抑制劑3-Methyladenine（3MA）、AMPK抑制劑Compound C均購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗小鼠podocin、nephrin、Beclin-1、P62、β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠AMPK單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體、兔抗小鼠mTOR多克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；酶標儀、SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉膜設備、GEL Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BioRad公司；BH-2光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將永生系小鼠足細胞MPC-5復蘇，置于含有10%胎牛血清、γ干擾素和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于33 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時，將足細胞傳代移入不含γ干擾素的培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達到80%左右時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組及處理 以RPMI1640培養(yǎng)基將冬蟲夏草充分溶解，0.45 μm濾膜過濾，用RPMI1640培養(yǎng)基將冬蟲夏草稀釋至30 mg/L。將處于對數生長期的MPC-5細胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板，設正常葡萄糖濃度（含5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，NG）組、高糖（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基，HG）組、高糖+冬蟲夏草（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基、30 mg/L冬蟲夏草菌液，HG+CS）組、高糖+冬蟲夏草+自噬抑制劑（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基+30 mg/L冬蟲夏草菌液+10 mmol/L 3-Methyladenine，HG+CS+3MA）組、高糖+冬蟲夏草+AMPK抑制劑（含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基+30 mg/L冬蟲夏草菌液+" "10 μmol/L Compound C，HG+CS+Compound C）組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組重復5次。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 取MPC-5細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各組設5個復孔，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h，采用酶標儀于波長450 nm處測定光密度（OD）值，計算細胞活力。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測細胞中podocin、nephrin、Beclin-1、P62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表達 細胞按1×106個/孔接種于6孔板，分組干預后收集細胞，RIPA細胞裂解液提取處理后的各組細胞總蛋白，經BCA法定量后，取50 μg蛋白樣品進行10%SDS-PAGE（100 V恒壓）分離，然后將凝膠上的蛋白樣本轉移至PVDF膜上。PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，與兔源一抗podocin（1∶1 000）、nephrin（1∶1 000）、Beclin-1（1∶500）、P62（1∶" " " " 1 000）、AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、mTOR（1∶500）、" " p-mTOR（1∶500）和β-actin（1∶3 000）在4 ℃下孵育過夜。TBST漂洗后，再將膜與山羊抗兔二抗（1∶2 000）在室溫條件下孵育2 h，漂洗后用ECL化學發(fā)光試劑盒發(fā)光，X線膠片顯影，以β-actin為蛋白內參，膠片掃描后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件分析數據。計量資料以[x]±s]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組足細胞活力的比較 與NG組相比，HG組足細胞活力降低（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組足細胞活力升高（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組和HG+CS+Compound C組足細胞活力降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 冬蟲夏草及自噬抑制劑對高糖干預下足細胞損傷和自噬的影響 與NG組相比，HG組podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達水平升高，P62蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+3MA組細胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖2、表1。

2.3 各組足細胞p-AMPK與p-mTOR蛋白表達水平比較 與NG組相比，HG組p-AMPK蛋白表達水平降低，p-mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組p-AMPK蛋白表達水平升高，p-mTOR蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+Compound C組細胞p-AMPK蛋白表達水平降低，p-mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖3、表2。

2.4 AMPK抑制劑阻斷冬蟲夏草對高糖干預下足細胞損傷及自噬的影響 與NG組相比，HG組podocin、nephrin和Beclin蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+CS組podocin、nephrin和Beclin蛋白表達水平升高，P62蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與HG+CS組相比，HG+CS+Compound C組細胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

DN是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，其病理變化包括腎小球足細胞減少、細胞外基質增多和腎小球硬化等，其中足細胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。Podocin和nephrin蛋白是足細胞特有的標志蛋白，同時也是重要的功能蛋白，是腎小球濾過屏障的重要組成部分，其丟失可導致腎小球濾過功能受損和蛋白尿［5］。本研究結果顯示，高糖干預小鼠足細胞后，足細胞活力明顯降低，細胞中podocin和nephrin蛋白表達水平顯著降低，提示高糖誘導了足細胞損傷，與以往研究報道［6］一致。冬蟲夏草干預后，足細胞活力增加，高糖誘導的足細胞podocin和nephrin蛋白表達水平升高，提示冬蟲夏草可改善高糖誘導的足細胞損傷。

自噬是一種細胞自我保護機制，通過溶酶體降解、清除和循環(huán)利用細胞內部受損的大分子物質和細胞器，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)和完整性［7］。自噬在維持足細胞自身的結構和功能完整性中發(fā)揮重要作用［8］。Yamahara等［9］研究發(fā)現，在糖尿病狀態(tài)下，腎小管上皮細胞自噬的缺乏可加重蛋白尿誘導的腎間質損傷。高糖及其所致炎癥反應可能抑制自噬，從而導致DN的發(fā)生發(fā)展［10］。Xu等［6］體外研究發(fā)現，高糖誘導的足細胞損傷與自噬水平下降有關，熊膽酸可通過抑制miR-21表達上調自噬水平，從而發(fā)揮足細胞保護作用。有研究發(fā)現，在2型糖尿病患者和小鼠動物模型中，足細胞自噬不足在DN進展至大量蛋白尿階段的過程中發(fā)揮重要作用［1］。Beclin-1是自噬的關鍵分子，其通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復合物來調節(jié)自噬相關基因蛋白的表達，從而參與自噬過程［11］。P62是反映自噬水平的標志物之一，其能夠與自噬相關蛋白LC3相互作用，隨后與其結合的泛素化蛋白或細胞器被包裹入自噬體后降解；當自噬受損時，P62降解被抑制，造成在細胞內積累，其表達水平與自噬活性呈負相關［12］。本研究結果顯示，冬蟲夏草干預高糖誘導的足細胞后，Beclin-1蛋白表達水平升高，而P62蛋白表達水平降低，提示冬蟲夏草可通過提高足細胞的自噬水平來減輕高糖誘導的足細胞損傷。另外，使用自噬抑制劑3MA進行干預后，冬蟲夏草對足細胞活力的保護作用被阻斷，足細胞podocin、nephrin和Beclin-1蛋白表達水平降低、P62蛋白表達水平升高，進一步證實冬蟲夏草通過上調足細胞自噬水平對高糖誘導的足細胞損傷發(fā)揮保護作用。

自噬的活性受多種細胞因子和信號通路的調控。有研究發(fā)現，自噬主要受AMPK/mTOR通路的調控［13-14］。AMPK被激活后，可抑制其下游mTOR蛋白的表達，而mTOR作為自噬的負調控因子，其活性降低則能促進細胞自噬的發(fā)生［15-16］。有研究顯示，在腎缺血再灌注損傷中，AMPK可通過抑制mTOR激酶活性正向調節(jié)自噬［17］。李燕等［18］研究發(fā)現，在DN小鼠中，高糖環(huán)境下細胞凋亡增加的同時，細胞內的自噬水平下降；通過調控AMPK/mTOR信號通路促進自噬，可改善DN小鼠的腎損傷。本研究結果顯示，在高糖環(huán)境下，足細胞p-AMPK蛋白表達水平降低、p-mTOR蛋白表達水平升高；給予冬蟲夏草干預后，可提高高糖誘導下p-AMPK蛋白表達水平、降低p-mTOR蛋白表達水平，提示高糖環(huán)境下AMPK/mTOR信號通路的下調介導了足細胞損傷，而冬蟲夏草可通過上調該信號通路減輕足細胞損傷，從而減緩DN的進展。另外，在冬蟲夏草干預的基礎上加用AMPK抑制劑Compound C后，足細胞活力降低，足細胞損傷標志物podocin和nephrin蛋白表達水平降低，足細胞自噬相關蛋白Beclin-1表達水平降低、P62蛋白表達水平升高，提示Compound C阻斷AMPK/mTOR信號通路可減弱冬蟲夏草在高糖環(huán)境下對足細胞的保護作用以及上調自噬的作用。

綜上所述，高糖可通過下調AMPK/mTOR信號通路來介導足細胞損傷，而冬蟲夏草可能通過上調AMPK/mTOR信號傳導通路來激活自噬、改善高糖誘導的足細胞損傷，從而發(fā)揮DN足細胞保護作用。但該作用機制較為復雜，其通過AMPK/mTOR信號通路下游的何種蛋白發(fā)揮作用還有待探討。

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（2024-06-24收稿 2024-08-22修回）

（本文編輯 陳麗潔）

基金項目：湖南省衛(wèi)生健康委科研計劃項目（D202303057259）；湖南省自然科學基金項目（2025JJ90079）

作者單位：1湖南省第二人民醫(yī)院（湖南省腦科醫(yī)院）腎內科（郵編410021），2微創(chuàng)外科

作者簡介：李冰心（1982），女，副主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病方面研究。E-mail：libignxin_9@163.com

△通信作者 E-mail：150634509@qq.com

引用本文：李冰心，許軍英，張雅茹，等. 冬蟲夏草通過調控AMPK/mTOR通路保護高糖誘導的足細胞損傷［J］. 天津醫(yī)藥，2025，53（3）：225-229. LI B X， XU J J， ZHANG Y R，et al. Effect of Cordyceps sinensis on podocyte damage induced by high glucose by regulating the AMPK/mTOR pathway［J］. Tianjin Med J，2025，53（3）：225-229. doi：10.11958/20240816.