• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光法檢測(cè)根際土壤胞外酶活性的優(yōu)化

    2022-12-22 05:55:18唐連發(fā)王琴唐兆鑫楊晴晴
    關(guān)鍵詞:胞外酶熒光法超純水

    唐連發(fā),王琴,唐兆鑫,楊晴晴

    (河北大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院(籌),河北 保定 071002)

    土壤酶由植物根系和土壤微生物分泌[1].在植物—土壤元素循環(huán)中,酶對(duì)有機(jī)分子的降解和礦化起著重要的作用,土壤中胞外酶揭示了土壤的C、N、P循環(huán)[2].土壤胞外酶穩(wěn)定性好,可長時(shí)間保持高的酶活性[3].它們?cè)诃h(huán)境受到脅迫后的響應(yīng)能力,使其成為評(píng)價(jià)土壤微生物質(zhì)量的潛在指示劑[4].在有關(guān)土壤生態(tài)學(xué)以及土壤微生物的測(cè)定中,關(guān)鍵土壤酶活性的測(cè)定成為必不可少的指標(biāo)[2].

    對(duì)采集的土壤立即進(jìn)行分析可能是最接近實(shí)際情況的,但由于各方面的限制較難實(shí)現(xiàn),因此就需要采用適宜的方法來保存土壤,這可能影響到土壤胞外酶的活性,但不同類型土壤酶活性的差異仍可得以保留[5].在特定的實(shí)驗(yàn)條件下使用人工底物測(cè)量土壤胞外酶活性,大多采用熒光法或吸光度法[6].熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性與吸光度法相比具有靈敏性高、所需樣本量少、高通量、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也存在著底物較貴、底物和標(biāo)準(zhǔn)品難溶解等缺點(diǎn)[7].在熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性的實(shí)驗(yàn)中,緩沖溶液與土壤混勻是土壤酶提取的重要一步,其作用在于破壞土壤團(tuán)聚體將土壤酶充分釋放出來,但不同類型的土壤使用相同的緩沖溶液可能對(duì)不同土壤酶的提取存在差異[1].大多采用漩渦震蕩將緩沖溶液與土壤混勻,使土壤中的酶與底物發(fā)生完全反應(yīng)[8].不同酶與底物充分反應(yīng)所需的培養(yǎng)時(shí)間不同,大多為4 h[9-12].酶與底物充分反應(yīng)還會(huì)受到培養(yǎng)溫度的影響,在合適的溫度下培養(yǎng)更能獲得實(shí)際的土壤中酶活性情況.因土壤類型不同、酶的種類不同等,可能在可控的實(shí)驗(yàn)步驟方面存在一定的差異,需要逐項(xiàng)優(yōu)化.

    本研究檢測(cè)了根際土壤中5種關(guān)鍵的胞外酶:纖維素降解的β-葡萄糖苷酶(βG)[13],從甲殼素中釋放出含氮小氨基糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)[14],將纖維素分解為纖維二糖、果糖和葡萄糖的纖維二糖水解酶(CBH)[15],水解蛋白質(zhì)和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP),礦化有機(jī)磷的堿性磷酸酶(AKP)[16].通過測(cè)定不同緩沖溶液提取、不同混勻方式、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)酶活性的影響,確定熒光法測(cè)定5種土壤胞外酶活性的最佳參數(shù),為其標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考.

    1 材料與方法

    1.1 土壤樣本的選擇

    選取來自不同類型宿主的根際土壤樣本.刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn)和一年生的歐美雜交楊‘546’(Populusdeltoidescv.′55/56′×P.deltoidescv. ′Imperial′,高敏感性,含有典型臭氧敏感性差異楊樹基因型),均來自北京延慶地區(qū)臭氧實(shí)驗(yàn)基地(40.47° N,116.34° E).樹木種植在20 L的塑料花盆中,盆內(nèi)裝有從附近農(nóng)田采集的0~10 cm深度的棕色砂壤土.生長5個(gè)月后取植物根際土,過2 mm篩用于測(cè)定土壤理化指標(biāo),再過1 mm篩用于測(cè)定土壤胞外酶活性,密封袋保存后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存.

    1.2 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定

    土壤pH采用國標(biāo)法,使用pH計(jì)(ST3100,奧豪斯)進(jìn)行測(cè)定[17].

    含水率:土壤過1 mm篩,110 ℃至恒質(zhì)量,計(jì)算含水率.

    含水率=(濕土質(zhì)量-烘干土質(zhì)量)/烘干土質(zhì)量×100%.

    有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和速效鉀的測(cè)定均采用鮑士旦[18]所記錄的方法.所測(cè)得楊樹土壤理化指標(biāo)見表1.

    表1 根際土壤的理化指標(biāo)

    1.3 相關(guān)溶液的配制

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為4-甲基傘形酮(MUB)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(麥克林試劑).LAP的參考標(biāo)準(zhǔn)是AMC,其余4種酶是MUB[19].本研究以MUB和AMC的偶聯(lián)物作為底物[19-20],其原理是:5種酶分解其特異性的底物,其底物中包含的熒光物質(zhì)MUB、AMC被釋放出來,通過測(cè)定熒光強(qiáng)度值,將酶活性轉(zhuǎn)化為所產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)物的量.在Merck網(wǎng)站上(https://www.sigmaaldrich.cn),MUB在甲醇中的溶解度為50 mg/mL;AMC在丙酮中的溶解度為10 mg/mL.另有文獻(xiàn)采用另一種極佳的有機(jī)溶劑DMSO(二甲基亞砜)作為溶劑[21].本研究中MUB和AMC標(biāo)準(zhǔn)物采用甲醇作為溶劑,超純水稀釋(AMC在超純水中溶解較好),配制濃度為40 mmol/L.

    1.3.2 底物溶液的配制

    底物濃度200 μmol/L,底物溶劑為超純水,其中βG底物需超聲使其徹底溶解.有文獻(xiàn)使用底物濃度4 μmol/L[22],但大多數(shù)文獻(xiàn)使用200 μmol/L[23-24],后者可使大多數(shù)土壤樣品分解[20, 24].所配溶液分裝且用錫紙包裹后,放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫玫孜镆姳?(羅恩試劑).

    表2 所測(cè)土壤胞外酶及相應(yīng)底物

    1.3.3 土壤胞外酶活性測(cè)定的操作步驟及計(jì)算方法

    稱取1 g土壤于50 mL離心管中,加入緩沖溶液,振蕩混勻,制備土壤均質(zhì)懸濁液.先將土壤懸濁液(在磁力攪拌器上取樣)、超純水加入黑色96孔酶標(biāo)板(上海WHB),然后在暗處加入底物溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液.加入完成后,在黑暗條件下使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng).培養(yǎng)完成后在每孔中加入10 μL、1 mol/L的NaOH(終止反應(yīng),增加熒光強(qiáng)度),反應(yīng)1 min后使用酶標(biāo)儀(美國/Biotek,Cytation5,激發(fā)365 nm,發(fā)射450 nm)測(cè)定熒光值.各孔加入物質(zhì)[25]見表3.

    表3 黑色96孔酶標(biāo)板各孔加入物質(zhì)

    計(jì)算方法:

    酶活=(凈熒光值×緩沖溶液體積)/(發(fā)射系數(shù)×懸濁液體積×培養(yǎng)時(shí)間×土壤干質(zhì)量).

    其中,

    凈熒光值=(樣品微孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/淬滅系數(shù)-基底控制孔的熒光值;淬滅系數(shù)=(淬火標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值;發(fā)射系數(shù)=參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值/(參考標(biāo)準(zhǔn)物濃度×參考標(biāo)準(zhǔn)物體積).

    1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.4.1 緩沖溶液的選擇

    分別選取乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)、檸檬酸-檸檬酸鈉(0.2 mol/L,pH 6.6)、PBS(0.2 mol/L,pH 7.5)、超純水4種溶液作為緩沖溶液.

    1.4.2 混勻方式的選擇

    選取幾種常用的混勻方式,混勻時(shí)間根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)置.本研究中所用的混勻方式見表4.

    表4 本研究所用的混勻方式

    1.4.3 培養(yǎng)溫度的選擇

    恒溫培養(yǎng)箱(SPX型智能生化培養(yǎng)箱)設(shè)置3個(gè)不同的溫度(20、25、30 ℃).

    1.4.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

    每種酶的培養(yǎng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h.

    2 結(jié)果

    2.1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹、刺槐根際土壤各1 g,分別加入1.4.1中不同的緩沖溶液30 mL,搖床搖勻1 h,25 ℃培養(yǎng)5 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖1.

    a.楊樹;b.刺槐圖1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of buffer solutions on the enzyme activities

    由圖1可知,不同樹種之間對(duì)緩沖溶液的反應(yīng)是一致的.AKP、βG、LAP在以超純水為緩沖溶液的情況下,酶活最高;CBH、NAG在乙酸鈉為緩沖溶液的情況下,酶活最高.

    本研究的土壤均呈弱堿性,而乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液屬于酸性.由乙酸鈉緩沖溶液測(cè)得的CBH、NAG酶活最高,但是測(cè)得的βG酶活很低.PBS作為緩沖溶液測(cè)得的AKP酶經(jīng)計(jì)算得出的酶活為負(fù)值(圖1中取0),PBS可能并不適合作為測(cè)定土壤胞外酶酶活的緩沖溶液,至少不適合本研究土壤中的AKP酶活的測(cè)定.

    2.2 混勻方式對(duì)酶活的影響

    稱取5份刺槐根際土壤各1 g,加入超純水30 mL,分別以1.4.2中5種方法混勻處理,25 ℃培養(yǎng)4 h.所用底物從4 ℃冰箱中取出,置于室溫避光處放置12 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖2.

    圖2 混勻方式對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of mixing methods on the enzyme activities

    由圖2可知,使用漩渦混合器提取出的AKP、βG、CBH酶活最高.搖床1 h,提取出的NAG、LAP酶活最高.使用超聲清洗器提取的酶活較小,可能由于超聲時(shí)間過長,破壞了酶的結(jié)構(gòu).超聲后又經(jīng)立式混勻器混勻提取的βG、CBH、NAG酶活非常低,AKP、LAP酶活也有所降低.使用立式混勻器可能由于轉(zhuǎn)速不夠的原因,所測(cè)得LAP酶活與搖床相比較低.雖然經(jīng)不同混勻方式提取的酶活不同,但每種方式下5種酶的酶活趨勢(shì)基本一致(AKP>LAP>CBH>βG/NAG).

    2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹根際土壤1 g,加入30 mL超純水,漩渦混勻5 min后,將土壤懸濁液稀釋10倍,25 ℃培養(yǎng)5 h.所用底物、標(biāo)準(zhǔn)品從4 ℃冰箱中取出,置于室溫避光處放置24 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖3.

    圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperatures on the enzyme activities

    由圖3可知,除LAP經(jīng)30 ℃和20 ℃培養(yǎng)相差不大以外,其余酶的趨勢(shì)基本為25 ℃培養(yǎng)的酶活>30 ℃培養(yǎng)的酶活>20 ℃培養(yǎng)的酶活.

    2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹根際土壤1 g,加入30 mL超純水,漩渦混勻5 min后,將土壤懸濁液稀釋10倍,25 ℃培養(yǎng).根據(jù)酶的培養(yǎng)時(shí)間曲線,判斷5種酶最佳的培養(yǎng)時(shí)間,結(jié)果見圖4.

    由圖4可知,在培養(yǎng)4 h的情況下,AKP、βG的酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間延長呈上升趨勢(shì),在4 h時(shí)達(dá)到最高值.隨后繼續(xù)分別培養(yǎng)5、6 h,AKP的酶活在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為303.63、253.25 nmol/(g·h)),βG的酶活也在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為12.25、8.76 nmol/(g·h)).LAP酶活最高點(diǎn)在1 h,然后隨著時(shí)間呈波浪變化,但始終沒有超過1 h時(shí)的酶活.CBH、NAG的酶活隨時(shí)間不斷變化,CBH酶活在2 h時(shí)達(dá)到最高值,NAG的酶活在3 h時(shí)達(dá)到最高值.

    2.5 優(yōu)化后參數(shù)的應(yīng)用

    根據(jù)1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的條件,選取楊樹根際土壤進(jìn)行5種酶酶活的測(cè)定,結(jié)果見圖5.

    圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of culture times on the enzyme activities

    圖5 楊樹根際土壤胞外酶的酶活Fig.5 Activities of extracellular enzymes in the rhizosphere soil of poplar

    由圖5可知,楊樹根際土壤中AKP、LAP的酶活遠(yuǎn)高于其他3種酶,βG、CBH、NAG的酶活均小于40 nmol/(g·h).上述實(shí)驗(yàn)中5種土壤胞外酶AKP、βG、CBH、NAG、LAP的活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為(237.70±74.72)、(24.68±6.20)、(17.05±2.76)、(26.38±3.03)、(289.70±130.60)nmol/(g·h).

    3 討論

    采用熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性,是一種高通量且簡(jiǎn)便的方法.標(biāo)準(zhǔn)品 MUB 和AMC較難溶解,本研究中用甲醇作溶劑,再用超純水稀釋到相應(yīng)濃度.研究過程中發(fā)現(xiàn)SynergyHTX酶標(biāo)儀(使用鎢絲燈,用濾光片作為光源)的檢測(cè)范圍較低(100~6 000),測(cè)得的熒光值較??;Cytation5酶標(biāo)儀(使用氙閃燈,單色器作為光源)的檢測(cè)范圍較高(10 000~3 000 000)、靈敏度高,故本研究采用Cytation5酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定.研究還發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中使用的水土比30∶1(mL∶g)較低[26],實(shí)驗(yàn)過程中用此水土比測(cè)得的熒光值較大,所以本研究加大了水土比,圖3為在水土比30∶1(mL∶g)再稀釋10倍的條件下計(jì)算出的土壤胞外酶酶活,此時(shí)實(shí)際水土比為300∶1(mL∶g).

    測(cè)試土壤樣本均來自相同類型的土壤,因其宿主植物差異,根際土壤的理化性質(zhì)并不完全一致,其有機(jī)質(zhì)是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因子[2, 27].本研究中不同樣本之間的pH、有機(jī)質(zhì)的含量相似.乙酸鈉是測(cè)定這5種土壤胞外酶酶活常用的緩沖溶液,其所測(cè)定的土壤多呈酸性[9, 28-29].本研究發(fā)現(xiàn)CBH、NAG在用乙酸鈉緩沖液提取時(shí)測(cè)得的酶活最高,AKP、βG、LAP在用超純水提取時(shí)測(cè)得的酶活最高.

    對(duì)于混勻方式來說,使用XH-C漩渦混合器混勻5 min,測(cè)得AKP、βG、CBH酶活性最高,搖床混勻60 min所得NAG、LAP酶活最高.可能XH-C漩渦混合器的功率及時(shí)間、搖床的轉(zhuǎn)速及時(shí)間都對(duì)酶活有影響,這就需要根據(jù)不同樣本性質(zhì)多次測(cè)定所得的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇.有研究發(fā)現(xiàn),不同酶之間有著不同的最佳攪拌時(shí)間[8].梅孔燦等[28]在測(cè)定βG、CBH中,使用磁力攪拌器攪拌5 min.當(dāng)樣本較少時(shí),選擇漩渦混合器省時(shí)省力;當(dāng)樣本數(shù)較多時(shí),選擇搖床可一次混勻所有的樣本.

    在水解酶的培育時(shí)間上各學(xué)者都有不同選擇,李歡等[30]在對(duì)這5種酶的測(cè)定中,采用黑暗下培育2 h;杜璨[26]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中采用黑暗下培育4 h;Brockett等[24]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中分別培育3、7、3 h;賈淑嫻等[8]在對(duì)CBH、βG、NAG測(cè)定方法探究上,證明這3種酶培養(yǎng)4 h是最佳的.培養(yǎng)時(shí)間在4 h內(nèi)是多數(shù)研究者所采用的時(shí)間.本研究設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間為1~6 h,發(fā)現(xiàn)AKP、βG的最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間是4 h,LAP是1 h,CBH是2 h,NAG是3 h.溫度對(duì)土壤胞外酶活性有著重要的影響[27].通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在25 ℃下5種土壤胞外酶的酶活均為最高,在20 ℃下培養(yǎng)的5種酶的酶活均為最低,這5種酶的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃左右(較20 ℃和30 ℃來說),培養(yǎng)溫度可能需要根據(jù)實(shí)際采樣時(shí)的溫度來設(shè)置,比如:福建省4月份采樣,實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為20 ℃[28];云南元謀縣采樣土壤年均溫度23.4 ℃,實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為25 ℃[29].25 ℃幾乎是本研究中土壤樣本采集時(shí)的溫度,也比較符合實(shí)際的情況.徐國慶[31]用熒光法測(cè)定施加污泥生物碳的楊樹土壤酶的酶活,βG、LAP、NAG酶活依次是140~240、10~20、50~80 nmol/(g·h).本研究結(jié)果與之相比較,βG活性較小,LAP活性較大.βG是有關(guān)C分解的酶,LAP是有關(guān)N分解的酶,根據(jù)土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)[26],本研究樣本可能受到了微生物的N限制.

    4 結(jié)論

    本研究依據(jù)熒光法優(yōu)化了土壤中常見的5種胞外酶酶活的測(cè)定方法,考察了不同的混勻方式、不同緩沖溶液提取、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)酶活的影響.結(jié)果得出:在使用Cytation5等高靈敏度的酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)所采用水土比值應(yīng)高于300∶1(mL∶g).轉(zhuǎn)速會(huì)影響土壤胞外酶提取,若選擇較高轉(zhuǎn)速則應(yīng)相對(duì)減少混勻時(shí)間.基于以下土壤胞外酶測(cè)試的關(guān)鍵參數(shù)可獲得最大酶活:測(cè)定AKP、βG時(shí)用超純水作為緩沖溶液,用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min,在25 ℃培養(yǎng)4 h;測(cè)定CBH時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)作為緩沖溶液,用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min,在25 ℃培養(yǎng)2 h;測(cè)定NAG時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)作為緩沖溶液,搖床(150 r/min)混勻60 min,在25 ℃培養(yǎng)3 h;測(cè)定LAP時(shí)用超純水作為緩沖溶液,搖床(150 r/min)混勻60 min,在25 ℃培養(yǎng)1 h.本研究結(jié)果可為提高熒光法準(zhǔn)確測(cè)定土壤胞外酶活性提供依據(jù).

    猜你喜歡
    胞外酶熒光法超純水
    根系分泌物對(duì)根際激發(fā)效應(yīng)影響的生物機(jī)制研究進(jìn)展
    Synthesis of new non-fluorous 2,2'-bipyridine-4,4'-dicarboxylic acid esters and their applications for metal ions extraction in supercritical carbon dioxide
    小水量超純水制備系統(tǒng)的最佳工藝選擇
    ATP生物熒光法在餐具消毒質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用
    黑木耳栽培過程中抗霉能力及胞外酶活性變化
    固相萃取/高效液相色譜熒光法測(cè)定草珊瑚中苯并[α]芘殘留
    醋糟栽培對(duì)杏鮑菇胞外酶活性的影響
    兩種方式提取杏鮑菇菌絲胞外酶的比較分析
    流動(dòng)注射-光纖化學(xué)傳感熒光法測(cè)定維生素B2的含量
    雜銅冶煉廠超純水管路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
    亚洲中文日韩欧美视频| 日本成人三级电影网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费看a级黄色片| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品午夜福利在线看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜精品久久久久久毛片777| 能在线免费观看的黄片| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看免费视频日本深夜| 国产真实乱freesex| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一进一出好大好爽视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 九色国产91popny在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 又紧又爽又黄一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 久久久久久久久大av| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美一区二区亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av| 女人被狂操c到高潮| 午夜久久久久精精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 99热精品在线国产| 国产成人a区在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美日韩东京热| 国产午夜福利久久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av中文av极速乱 | 久久99热这里只有精品18| 色在线成人网| 国产精品一区二区性色av| 国内精品一区二区在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 此物有八面人人有两片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产亚洲精品av在线| 女人被狂操c到高潮| 一进一出抽搐动态| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久九九精品影院| 男插女下体视频免费在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 嫩草影院新地址| 一夜夜www| 91在线精品国自产拍蜜月| 一a级毛片在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美又色又爽又黄视频| 12—13女人毛片做爰片一| 久久精品91蜜桃| 免费看光身美女| 在线观看av片永久免费下载| 在线观看66精品国产| 亚洲最大成人手机在线| 在线观看一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产黄a三级三级三级人| 亚洲内射少妇av| 69人妻影院| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久99热6这里只有精品| 国产精品三级大全| 毛片一级片免费看久久久久 | 精品欧美国产一区二区三| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 色5月婷婷丁香| 国产老妇女一区| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲五月天丁香| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 色综合婷婷激情| 精品不卡国产一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人福利小说| 国内精品宾馆在线| av黄色大香蕉| 91久久精品电影网| 久久久久久国产a免费观看| 性色avwww在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 禁无遮挡网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女大奶头视频| 亚洲黑人精品在线| 成人综合一区亚洲| 村上凉子中文字幕在线| 舔av片在线| 99热这里只有是精品在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 在线a可以看的网站| 亚洲自拍偷在线| 欧美性感艳星| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美不卡视频在线免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美一区二区亚洲| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美潮喷喷水| 一区二区三区高清视频在线| 99热只有精品国产| 国产成人影院久久av| 如何舔出高潮| 日本熟妇午夜| 亚洲国产高清在线一区二区三| 我的女老师完整版在线观看| 无人区码免费观看不卡| 真人做人爱边吃奶动态| 久久久午夜欧美精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩高清综合在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲,欧美,日韩| 永久网站在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 精品久久久久久成人av| 九九热线精品视视频播放| 日韩精品有码人妻一区| 少妇丰满av| 一级a爱片免费观看的视频| 日本色播在线视频| 亚洲真实伦在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| av福利片在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 国内精品美女久久久久久| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品国产高清国产av| 午夜影院日韩av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在现免费观看毛片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产av在哪里看| 久久国产乱子免费精品| 两个人视频免费观看高清| 成年免费大片在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产av不卡久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 麻豆国产av国片精品| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 黄片wwwwww| 听说在线观看完整版免费高清| 熟女人妻精品中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 免费高清视频大片| 最后的刺客免费高清国语| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产乱人伦免费视频| 无遮挡黄片免费观看| 嫩草影院精品99| 国产麻豆成人av免费视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久香蕉精品热| 久久这里只有精品中国| 禁无遮挡网站| 久久久精品大字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 少妇人妻精品综合一区二区 | av专区在线播放| 永久网站在线| 精品人妻熟女av久视频| 欧美区成人在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久热精品热| 色在线成人网| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品不卡国产一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 国产三级中文精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 搡老岳熟女国产| 国产男人的电影天堂91| 九色成人免费人妻av| av在线天堂中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 成人综合一区亚洲| 男女那种视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 久9热在线精品视频| 一个人看视频在线观看www免费| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲最大成人手机在线| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 在线播放国产精品三级| 日韩中字成人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美极品一区二区三区四区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 又爽又黄a免费视频| 色综合婷婷激情| 看十八女毛片水多多多| 日韩欧美 国产精品| av在线观看视频网站免费| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩强制内射视频| 久久久久国内视频| 91精品国产九色| 别揉我奶头 嗯啊视频| 在线国产一区二区在线| 国产爱豆传媒在线观看| 日本免费a在线| 91精品国产九色| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲自拍偷在线| 天美传媒精品一区二区| 欧美高清性xxxxhd video| av福利片在线观看| 草草在线视频免费看| 精品久久久久久久久av| 我要搜黄色片| 一区二区三区免费毛片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产精品久久男人天堂| 波野结衣二区三区在线| 哪里可以看免费的av片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲午夜理论影院| 国产一区二区三区av在线 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲无线观看免费| avwww免费| 日韩欧美精品免费久久| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜福利高清视频| 婷婷六月久久综合丁香| videossex国产| 亚洲久久久久久中文字幕| 91麻豆av在线| 他把我摸到了高潮在线观看| avwww免费| 亚洲国产欧美人成| 男女下面进入的视频免费午夜| 无遮挡黄片免费观看| www日本黄色视频网| 日韩强制内射视频| 如何舔出高潮| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲无线观看免费| 97超视频在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久热精品热| 欧美日韩乱码在线| 男女那种视频在线观看| 午夜影院日韩av| 一个人免费在线观看电影| 午夜免费激情av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人特级av手机在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| bbb黄色大片| 简卡轻食公司| 亚洲欧美激情综合另类| 精品久久久久久成人av| 中国美白少妇内射xxxbb| 九九在线视频观看精品| 午夜福利18| 国产精品,欧美在线| 观看美女的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 国产成人a区在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 啪啪无遮挡十八禁网站| 可以在线观看的亚洲视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 男女视频在线观看网站免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品免费一区二区三区在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲av五月六月丁香网| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人av教育| 免费看光身美女| 亚州av有码| bbb黄色大片| 亚洲最大成人中文| 深夜精品福利| x7x7x7水蜜桃| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 欧美3d第一页| 成人特级黄色片久久久久久久| a级毛片免费高清观看在线播放| 91麻豆av在线| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲无线观看免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产综合懂色| 在线观看av片永久免费下载| 岛国在线免费视频观看| 国产高清三级在线| 国产av在哪里看| 一区二区三区免费毛片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲精华国产精华精| 免费观看精品视频网站| 国产一区二区在线观看日韩| 真人一进一出gif抽搐免费| 韩国av一区二区三区四区| 久久中文看片网| 亚洲久久久久久中文字幕| 日本色播在线视频| 国产精品久久久久久久久免| 少妇丰满av| 成年女人毛片免费观看观看9| 97碰自拍视频| 乱系列少妇在线播放| 亚洲电影在线观看av| www.www免费av| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲av二区三区四区| 欧美zozozo另类| 日本熟妇午夜| 天天躁日日操中文字幕| 熟女电影av网| 精品一区二区三区视频在线| 国产高清视频在线播放一区| 国产美女午夜福利| 国产乱人视频| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久久九九精品二区国产| 久久国内精品自在自线图片| 久久精品91蜜桃| 日本一二三区视频观看| 欧美日韩黄片免| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av中文av极速乱 | 一区二区三区激情视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 男人的好看免费观看在线视频| 小说图片视频综合网站| 在现免费观看毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 热99在线观看视频| 又爽又黄a免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲性久久影院| 超碰av人人做人人爽久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产高清有码在线观看视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 色播亚洲综合网| 麻豆成人av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 我的老师免费观看完整版| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产成年人精品一区二区| 又爽又黄a免费视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 中文字幕久久专区| 久久久精品欧美日韩精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品久久久久久久末码| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲自拍偷在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久久精品大字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品女同一区二区软件 | 好男人在线观看高清免费视频| 中文字幕av成人在线电影| 久久99热6这里只有精品| 婷婷色综合大香蕉| 日本a在线网址| 亚洲av美国av| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲国产欧美人成| av黄色大香蕉| 日韩欧美 国产精品| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久久久成人| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚州av有码| 成人欧美大片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲三级黄色毛片| 久久中文看片网| 国产精品野战在线观看| 嫩草影院新地址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| www.www免费av| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线免费十八禁| 久久久午夜欧美精品| 一级av片app| 欧美bdsm另类| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品久久久久久久久av| 老司机深夜福利视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 成人av一区二区三区在线看| 最新在线观看一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕熟女人妻在线| 国产毛片a区久久久久| 春色校园在线视频观看| 亚洲 国产 在线| 国产v大片淫在线免费观看| 99久久精品热视频| 99久久精品一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 一级黄色大片毛片| 亚洲人与动物交配视频| 少妇丰满av| 国产成人a区在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久成人av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人综合一区亚洲| 国产精品女同一区二区软件 | 可以在线观看的亚洲视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 三级毛片av免费| 久久热精品热| 国产精品一区www在线观看 | 国模一区二区三区四区视频| 成人精品一区二区免费| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲四区av| 伊人久久精品亚洲午夜| 极品教师在线免费播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 免费在线观看日本一区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲五月天丁香| 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区激情短视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 午夜福利成人在线免费观看| 精品久久久久久,| 99精品久久久久人妻精品| 免费在线观看影片大全网站| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久九九精品影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 一个人免费在线观看电影| 欧美人与善性xxx| 观看美女的网站| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲成人免费电影在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美日韩黄片免| 99九九线精品视频在线观看视频| 男女之事视频高清在线观看| 伦理电影大哥的女人| 一区二区三区免费毛片| 亚洲色图av天堂| 丝袜美腿在线中文| 婷婷亚洲欧美| 午夜老司机福利剧场| 日本黄大片高清| 51国产日韩欧美| 九九在线视频观看精品| 夜夜爽天天搞| 亚洲中文字幕日韩| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩黄片免| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利在线观看吧| 亚洲av二区三区四区| 国产欧美日韩一区二区精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级黄片播放器| 午夜免费成人在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲美女黄片视频| 99热这里只有是精品在线观看| 97碰自拍视频| 99热6这里只有精品| 国产不卡一卡二| 午夜激情福利司机影院| 亚洲 国产 在线| 日本黄色片子视频| 成人三级黄色视频| 国产精品久久久久久久久免| 婷婷六月久久综合丁香| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久中文看片网| 久久久精品大字幕| 久久久久久国产a免费观看| 日韩欧美在线乱码| 嫩草影院精品99| 白带黄色成豆腐渣| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产日本99.免费观看| 国产一区二区三区av在线 | 身体一侧抽搐| 一级黄片播放器| 男人舔奶头视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 日本一本二区三区精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品三级大全| 欧美最黄视频在线播放免费| 69人妻影院| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精华国产精华精| 国产一区二区三区视频了| 成人性生交大片免费视频hd| 午夜福利在线在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费av毛片视频| 男女那种视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 嫩草影院新地址| 在线a可以看的网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产 一区精品| videossex国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 中文资源天堂在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 香蕉av资源在线| 欧美潮喷喷水| 观看美女的网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb|