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    熒光法檢測(cè)根際土壤胞外酶活性的優(yōu)化

    2022-12-22 05:55:18唐連發(fā)王琴唐兆鑫楊晴晴
    關(guān)鍵詞:胞外酶熒光法超純水

    唐連發(fā),王琴,唐兆鑫,楊晴晴

    (河北大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院(籌),河北 保定 071002)

    土壤酶由植物根系和土壤微生物分泌[1].在植物—土壤元素循環(huán)中,酶對(duì)有機(jī)分子的降解和礦化起著重要的作用,土壤中胞外酶揭示了土壤的C、N、P循環(huán)[2].土壤胞外酶穩(wěn)定性好,可長時(shí)間保持高的酶活性[3].它們?cè)诃h(huán)境受到脅迫后的響應(yīng)能力,使其成為評(píng)價(jià)土壤微生物質(zhì)量的潛在指示劑[4].在有關(guān)土壤生態(tài)學(xué)以及土壤微生物的測(cè)定中,關(guān)鍵土壤酶活性的測(cè)定成為必不可少的指標(biāo)[2].

    對(duì)采集的土壤立即進(jìn)行分析可能是最接近實(shí)際情況的,但由于各方面的限制較難實(shí)現(xiàn),因此就需要采用適宜的方法來保存土壤,這可能影響到土壤胞外酶的活性,但不同類型土壤酶活性的差異仍可得以保留[5].在特定的實(shí)驗(yàn)條件下使用人工底物測(cè)量土壤胞外酶活性,大多采用熒光法或吸光度法[6].熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性與吸光度法相比具有靈敏性高、所需樣本量少、高通量、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也存在著底物較貴、底物和標(biāo)準(zhǔn)品難溶解等缺點(diǎn)[7].在熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性的實(shí)驗(yàn)中,緩沖溶液與土壤混勻是土壤酶提取的重要一步,其作用在于破壞土壤團(tuán)聚體將土壤酶充分釋放出來,但不同類型的土壤使用相同的緩沖溶液可能對(duì)不同土壤酶的提取存在差異[1].大多采用漩渦震蕩將緩沖溶液與土壤混勻,使土壤中的酶與底物發(fā)生完全反應(yīng)[8].不同酶與底物充分反應(yīng)所需的培養(yǎng)時(shí)間不同,大多為4 h[9-12].酶與底物充分反應(yīng)還會(huì)受到培養(yǎng)溫度的影響,在合適的溫度下培養(yǎng)更能獲得實(shí)際的土壤中酶活性情況.因土壤類型不同、酶的種類不同等,可能在可控的實(shí)驗(yàn)步驟方面存在一定的差異,需要逐項(xiàng)優(yōu)化.

    本研究檢測(cè)了根際土壤中5種關(guān)鍵的胞外酶:纖維素降解的β-葡萄糖苷酶(βG)[13],從甲殼素中釋放出含氮小氨基糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)[14],將纖維素分解為纖維二糖、果糖和葡萄糖的纖維二糖水解酶(CBH)[15],水解蛋白質(zhì)和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP),礦化有機(jī)磷的堿性磷酸酶(AKP)[16].通過測(cè)定不同緩沖溶液提取、不同混勻方式、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)酶活性的影響,確定熒光法測(cè)定5種土壤胞外酶活性的最佳參數(shù),為其標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考.

    1 材料與方法

    1.1 土壤樣本的選擇

    選取來自不同類型宿主的根際土壤樣本.刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn)和一年生的歐美雜交楊‘546’(Populusdeltoidescv.′55/56′×P.deltoidescv. ′Imperial′,高敏感性,含有典型臭氧敏感性差異楊樹基因型),均來自北京延慶地區(qū)臭氧實(shí)驗(yàn)基地(40.47° N,116.34° E).樹木種植在20 L的塑料花盆中,盆內(nèi)裝有從附近農(nóng)田采集的0~10 cm深度的棕色砂壤土.生長5個(gè)月后取植物根際土,過2 mm篩用于測(cè)定土壤理化指標(biāo),再過1 mm篩用于測(cè)定土壤胞外酶活性,密封袋保存后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存.

    1.2 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定

    土壤pH采用國標(biāo)法,使用pH計(jì)(ST3100,奧豪斯)進(jìn)行測(cè)定[17].

    含水率:土壤過1 mm篩,110 ℃至恒質(zhì)量,計(jì)算含水率.

    含水率=(濕土質(zhì)量-烘干土質(zhì)量)/烘干土質(zhì)量×100%.

    有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和速效鉀的測(cè)定均采用鮑士旦[18]所記錄的方法.所測(cè)得楊樹土壤理化指標(biāo)見表1.

    表1 根際土壤的理化指標(biāo)

    1.3 相關(guān)溶液的配制

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為4-甲基傘形酮(MUB)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(麥克林試劑).LAP的參考標(biāo)準(zhǔn)是AMC,其余4種酶是MUB[19].本研究以MUB和AMC的偶聯(lián)物作為底物[19-20],其原理是:5種酶分解其特異性的底物,其底物中包含的熒光物質(zhì)MUB、AMC被釋放出來,通過測(cè)定熒光強(qiáng)度值,將酶活性轉(zhuǎn)化為所產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)物的量.在Merck網(wǎng)站上(https://www.sigmaaldrich.cn),MUB在甲醇中的溶解度為50 mg/mL;AMC在丙酮中的溶解度為10 mg/mL.另有文獻(xiàn)采用另一種極佳的有機(jī)溶劑DMSO(二甲基亞砜)作為溶劑[21].本研究中MUB和AMC標(biāo)準(zhǔn)物采用甲醇作為溶劑,超純水稀釋(AMC在超純水中溶解較好),配制濃度為40 mmol/L.

    1.3.2 底物溶液的配制

    底物濃度200 μmol/L,底物溶劑為超純水,其中βG底物需超聲使其徹底溶解.有文獻(xiàn)使用底物濃度4 μmol/L[22],但大多數(shù)文獻(xiàn)使用200 μmol/L[23-24],后者可使大多數(shù)土壤樣品分解[20, 24].所配溶液分裝且用錫紙包裹后,放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫玫孜镆姳?(羅恩試劑).

    表2 所測(cè)土壤胞外酶及相應(yīng)底物

    1.3.3 土壤胞外酶活性測(cè)定的操作步驟及計(jì)算方法

    稱取1 g土壤于50 mL離心管中,加入緩沖溶液,振蕩混勻,制備土壤均質(zhì)懸濁液.先將土壤懸濁液(在磁力攪拌器上取樣)、超純水加入黑色96孔酶標(biāo)板(上海WHB),然后在暗處加入底物溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液.加入完成后,在黑暗條件下使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng).培養(yǎng)完成后在每孔中加入10 μL、1 mol/L的NaOH(終止反應(yīng),增加熒光強(qiáng)度),反應(yīng)1 min后使用酶標(biāo)儀(美國/Biotek,Cytation5,激發(fā)365 nm,發(fā)射450 nm)測(cè)定熒光值.各孔加入物質(zhì)[25]見表3.

    表3 黑色96孔酶標(biāo)板各孔加入物質(zhì)

    計(jì)算方法:

    酶活=(凈熒光值×緩沖溶液體積)/(發(fā)射系數(shù)×懸濁液體積×培養(yǎng)時(shí)間×土壤干質(zhì)量).

    其中,

    凈熒光值=(樣品微孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/淬滅系數(shù)-基底控制孔的熒光值;淬滅系數(shù)=(淬火標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值;發(fā)射系數(shù)=參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值/(參考標(biāo)準(zhǔn)物濃度×參考標(biāo)準(zhǔn)物體積).

    1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.4.1 緩沖溶液的選擇

    分別選取乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)、檸檬酸-檸檬酸鈉(0.2 mol/L,pH 6.6)、PBS(0.2 mol/L,pH 7.5)、超純水4種溶液作為緩沖溶液.

    1.4.2 混勻方式的選擇

    選取幾種常用的混勻方式,混勻時(shí)間根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)置.本研究中所用的混勻方式見表4.

    表4 本研究所用的混勻方式

    1.4.3 培養(yǎng)溫度的選擇

    恒溫培養(yǎng)箱(SPX型智能生化培養(yǎng)箱)設(shè)置3個(gè)不同的溫度(20、25、30 ℃).

    1.4.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

    每種酶的培養(yǎng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h.

    2 結(jié)果

    2.1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹、刺槐根際土壤各1 g,分別加入1.4.1中不同的緩沖溶液30 mL,搖床搖勻1 h,25 ℃培養(yǎng)5 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖1.

    a.楊樹;b.刺槐圖1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of buffer solutions on the enzyme activities

    由圖1可知,不同樹種之間對(duì)緩沖溶液的反應(yīng)是一致的.AKP、βG、LAP在以超純水為緩沖溶液的情況下,酶活最高;CBH、NAG在乙酸鈉為緩沖溶液的情況下,酶活最高.

    本研究的土壤均呈弱堿性,而乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液屬于酸性.由乙酸鈉緩沖溶液測(cè)得的CBH、NAG酶活最高,但是測(cè)得的βG酶活很低.PBS作為緩沖溶液測(cè)得的AKP酶經(jīng)計(jì)算得出的酶活為負(fù)值(圖1中取0),PBS可能并不適合作為測(cè)定土壤胞外酶酶活的緩沖溶液,至少不適合本研究土壤中的AKP酶活的測(cè)定.

    2.2 混勻方式對(duì)酶活的影響

    稱取5份刺槐根際土壤各1 g,加入超純水30 mL,分別以1.4.2中5種方法混勻處理,25 ℃培養(yǎng)4 h.所用底物從4 ℃冰箱中取出,置于室溫避光處放置12 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖2.

    圖2 混勻方式對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of mixing methods on the enzyme activities

    由圖2可知,使用漩渦混合器提取出的AKP、βG、CBH酶活最高.搖床1 h,提取出的NAG、LAP酶活最高.使用超聲清洗器提取的酶活較小,可能由于超聲時(shí)間過長,破壞了酶的結(jié)構(gòu).超聲后又經(jīng)立式混勻器混勻提取的βG、CBH、NAG酶活非常低,AKP、LAP酶活也有所降低.使用立式混勻器可能由于轉(zhuǎn)速不夠的原因,所測(cè)得LAP酶活與搖床相比較低.雖然經(jīng)不同混勻方式提取的酶活不同,但每種方式下5種酶的酶活趨勢(shì)基本一致(AKP>LAP>CBH>βG/NAG).

    2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹根際土壤1 g,加入30 mL超純水,漩渦混勻5 min后,將土壤懸濁液稀釋10倍,25 ℃培養(yǎng)5 h.所用底物、標(biāo)準(zhǔn)品從4 ℃冰箱中取出,置于室溫避光處放置24 h,酶活測(cè)定結(jié)果見圖3.

    圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperatures on the enzyme activities

    由圖3可知,除LAP經(jīng)30 ℃和20 ℃培養(yǎng)相差不大以外,其余酶的趨勢(shì)基本為25 ℃培養(yǎng)的酶活>30 ℃培養(yǎng)的酶活>20 ℃培養(yǎng)的酶活.

    2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

    稱取楊樹根際土壤1 g,加入30 mL超純水,漩渦混勻5 min后,將土壤懸濁液稀釋10倍,25 ℃培養(yǎng).根據(jù)酶的培養(yǎng)時(shí)間曲線,判斷5種酶最佳的培養(yǎng)時(shí)間,結(jié)果見圖4.

    由圖4可知,在培養(yǎng)4 h的情況下,AKP、βG的酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間延長呈上升趨勢(shì),在4 h時(shí)達(dá)到最高值.隨后繼續(xù)分別培養(yǎng)5、6 h,AKP的酶活在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為303.63、253.25 nmol/(g·h)),βG的酶活也在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為12.25、8.76 nmol/(g·h)).LAP酶活最高點(diǎn)在1 h,然后隨著時(shí)間呈波浪變化,但始終沒有超過1 h時(shí)的酶活.CBH、NAG的酶活隨時(shí)間不斷變化,CBH酶活在2 h時(shí)達(dá)到最高值,NAG的酶活在3 h時(shí)達(dá)到最高值.

    2.5 優(yōu)化后參數(shù)的應(yīng)用

    根據(jù)1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的條件,選取楊樹根際土壤進(jìn)行5種酶酶活的測(cè)定,結(jié)果見圖5.

    圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of culture times on the enzyme activities

    圖5 楊樹根際土壤胞外酶的酶活Fig.5 Activities of extracellular enzymes in the rhizosphere soil of poplar

    由圖5可知,楊樹根際土壤中AKP、LAP的酶活遠(yuǎn)高于其他3種酶,βG、CBH、NAG的酶活均小于40 nmol/(g·h).上述實(shí)驗(yàn)中5種土壤胞外酶AKP、βG、CBH、NAG、LAP的活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為(237.70±74.72)、(24.68±6.20)、(17.05±2.76)、(26.38±3.03)、(289.70±130.60)nmol/(g·h).

    3 討論

    采用熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性,是一種高通量且簡(jiǎn)便的方法.標(biāo)準(zhǔn)品 MUB 和AMC較難溶解,本研究中用甲醇作溶劑,再用超純水稀釋到相應(yīng)濃度.研究過程中發(fā)現(xiàn)SynergyHTX酶標(biāo)儀(使用鎢絲燈,用濾光片作為光源)的檢測(cè)范圍較低(100~6 000),測(cè)得的熒光值較??;Cytation5酶標(biāo)儀(使用氙閃燈,單色器作為光源)的檢測(cè)范圍較高(10 000~3 000 000)、靈敏度高,故本研究采用Cytation5酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定.研究還發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中使用的水土比30∶1(mL∶g)較低[26],實(shí)驗(yàn)過程中用此水土比測(cè)得的熒光值較大,所以本研究加大了水土比,圖3為在水土比30∶1(mL∶g)再稀釋10倍的條件下計(jì)算出的土壤胞外酶酶活,此時(shí)實(shí)際水土比為300∶1(mL∶g).

    測(cè)試土壤樣本均來自相同類型的土壤,因其宿主植物差異,根際土壤的理化性質(zhì)并不完全一致,其有機(jī)質(zhì)是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因子[2, 27].本研究中不同樣本之間的pH、有機(jī)質(zhì)的含量相似.乙酸鈉是測(cè)定這5種土壤胞外酶酶活常用的緩沖溶液,其所測(cè)定的土壤多呈酸性[9, 28-29].本研究發(fā)現(xiàn)CBH、NAG在用乙酸鈉緩沖液提取時(shí)測(cè)得的酶活最高,AKP、βG、LAP在用超純水提取時(shí)測(cè)得的酶活最高.

    對(duì)于混勻方式來說,使用XH-C漩渦混合器混勻5 min,測(cè)得AKP、βG、CBH酶活性最高,搖床混勻60 min所得NAG、LAP酶活最高.可能XH-C漩渦混合器的功率及時(shí)間、搖床的轉(zhuǎn)速及時(shí)間都對(duì)酶活有影響,這就需要根據(jù)不同樣本性質(zhì)多次測(cè)定所得的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇.有研究發(fā)現(xiàn),不同酶之間有著不同的最佳攪拌時(shí)間[8].梅孔燦等[28]在測(cè)定βG、CBH中,使用磁力攪拌器攪拌5 min.當(dāng)樣本較少時(shí),選擇漩渦混合器省時(shí)省力;當(dāng)樣本數(shù)較多時(shí),選擇搖床可一次混勻所有的樣本.

    在水解酶的培育時(shí)間上各學(xué)者都有不同選擇,李歡等[30]在對(duì)這5種酶的測(cè)定中,采用黑暗下培育2 h;杜璨[26]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中采用黑暗下培育4 h;Brockett等[24]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中分別培育3、7、3 h;賈淑嫻等[8]在對(duì)CBH、βG、NAG測(cè)定方法探究上,證明這3種酶培養(yǎng)4 h是最佳的.培養(yǎng)時(shí)間在4 h內(nèi)是多數(shù)研究者所采用的時(shí)間.本研究設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間為1~6 h,發(fā)現(xiàn)AKP、βG的最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間是4 h,LAP是1 h,CBH是2 h,NAG是3 h.溫度對(duì)土壤胞外酶活性有著重要的影響[27].通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在25 ℃下5種土壤胞外酶的酶活均為最高,在20 ℃下培養(yǎng)的5種酶的酶活均為最低,這5種酶的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃左右(較20 ℃和30 ℃來說),培養(yǎng)溫度可能需要根據(jù)實(shí)際采樣時(shí)的溫度來設(shè)置,比如:福建省4月份采樣,實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為20 ℃[28];云南元謀縣采樣土壤年均溫度23.4 ℃,實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為25 ℃[29].25 ℃幾乎是本研究中土壤樣本采集時(shí)的溫度,也比較符合實(shí)際的情況.徐國慶[31]用熒光法測(cè)定施加污泥生物碳的楊樹土壤酶的酶活,βG、LAP、NAG酶活依次是140~240、10~20、50~80 nmol/(g·h).本研究結(jié)果與之相比較,βG活性較小,LAP活性較大.βG是有關(guān)C分解的酶,LAP是有關(guān)N分解的酶,根據(jù)土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)[26],本研究樣本可能受到了微生物的N限制.

    4 結(jié)論

    本研究依據(jù)熒光法優(yōu)化了土壤中常見的5種胞外酶酶活的測(cè)定方法,考察了不同的混勻方式、不同緩沖溶液提取、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)酶活的影響.結(jié)果得出:在使用Cytation5等高靈敏度的酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)所采用水土比值應(yīng)高于300∶1(mL∶g).轉(zhuǎn)速會(huì)影響土壤胞外酶提取,若選擇較高轉(zhuǎn)速則應(yīng)相對(duì)減少混勻時(shí)間.基于以下土壤胞外酶測(cè)試的關(guān)鍵參數(shù)可獲得最大酶活:測(cè)定AKP、βG時(shí)用超純水作為緩沖溶液,用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min,在25 ℃培養(yǎng)4 h;測(cè)定CBH時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)作為緩沖溶液,用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min,在25 ℃培養(yǎng)2 h;測(cè)定NAG時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L,pH 5.8)作為緩沖溶液,搖床(150 r/min)混勻60 min,在25 ℃培養(yǎng)3 h;測(cè)定LAP時(shí)用超純水作為緩沖溶液,搖床(150 r/min)混勻60 min,在25 ℃培養(yǎng)1 h.本研究結(jié)果可為提高熒光法準(zhǔn)確測(cè)定土壤胞外酶活性提供依據(jù).

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