馬錢苷對膿毒癥大鼠炎癥反應及腸道屏障損傷的影響

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0574-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.12

摘要 目的 探討馬錢苷通過調節(jié)Ras 同源基因家族成員A（RhoA）/Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）信號通路對膿毒癥大鼠炎癥反應及腸道屏障損傷的影響及機制。方法 采用盲腸結扎和穿刺法建立膿毒癥大鼠模型，并隨機分為膿毒癥組、馬錢苷低劑量組（50 mg/kg 馬錢苷，灌胃）、馬錢苷高劑量組（200 mg/kg 馬錢苷，灌胃）、陽性對照組（0.2 mg/kg 阿托伐他汀，腹腔注射）、馬錢苷高劑量+溶血磷脂酸（LPA）組（200 mg/kg馬錢苷，灌胃+10 mg/kg RhoA激活劑LPA，腹腔注射），另設假手術組，每組10只，每6 h 給藥1 次，連續(xù)給藥4 次。末次給藥24 h 后，檢測大鼠血清中炎癥因子白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β水平；觀察大鼠回腸組織病理學變化并進行Chiu’s 腸黏膜損傷評分；檢測大鼠回腸組織中D-乳酸、D-氨基酸氧化酶（DAO）、內毒素水平，閉鎖小帶蛋白（ZO-1）、閉鎖蛋白（Occludin）陽性染色面積百分比以及RhoA、ROCK1 的蛋白相對表達水平。結果 與膿毒癥組比較，馬錢苷低劑量組、馬錢苷高劑量組大鼠的ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著升高，IL-6、TNF-α、IL-1β、DAO、D-乳酸、內毒素水平和Chiu’s 腸黏膜損傷評分以及RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著降低（P＜0.05），大鼠回腸組織的破壞程度得到緩解，組織水腫及炎性浸潤均明顯減輕，且馬錢苷高劑量組的改善效果均優(yōu)于馬錢苷低劑量組（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，RhoA激活劑LPA可顯著逆轉上述指標的變化趨勢（P＜0.05）。結論 馬錢苷能減輕膿毒癥大鼠炎癥反應及腸道屏障損傷，其機制與抑制RhoA/ROCK1 信號通路有關。

關鍵詞 馬錢苷；膿毒癥；RhoA/ROCK1信號通路；炎癥反應；腸道屏障損傷

膿毒癥是宿主對感染的異常反應引發(fā)的危重疾病，進展迅速且死亡率高，可導致多器官功能障礙，已成為公認的全球健康問題，且尚無特異性療法。膿毒癥可引發(fā)腸道屏障損傷進而發(fā)生細菌易位，加劇全身炎癥反應，并導致多器官功能障礙[1]，因此關注腸道屏障損傷是治療膿毒癥的關鍵。腸道屏障功能的完整性可以通過上皮緊密連接蛋白的表達來評估，Ras 同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）/Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coilforming protein kinase 1，ROCK1）信號通路已被證明在調節(jié)腸道細胞間緊密連接中起關鍵作用[2]，同時也被證實在膿毒癥急性肺損傷等并發(fā)癥中發(fā)揮著調控作用[3]。馬錢苷是一種具有強大藥理作用的環(huán)烯醚萜類化合物，研究表明，通過其抗炎、抗凋亡作用可明顯改善燒傷后引發(fā)的腸道屏障損傷和腸道功能障礙，發(fā)揮腸道保護作用[4]。但馬錢苷是否通過調節(jié)RhoA/ROCK1 信號通路來改善膿毒癥大鼠的腸道屏障損傷尚不可知。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，旨在探討馬錢苷對膿毒癥大鼠炎癥反應、腸道屏障損傷的影響及其潛在機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Multiskan MK3 型酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；DM4B型光學顯微鏡（德國Leica 公司）；Enduro GDS型凝膠成像系統(tǒng)（北京蘭博康斯科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

馬錢苷對照品（純度99.7%，批號yb-2148）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；RhoA 激活劑溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA；批號SAB2107510）購自美國Sigma 公司；阿托伐他汀對照品（純度98.0%，批號T3116）購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號27193）購自深圳市科潤達生物工程有限公司；內毒素試劑盒（批號SBJR0392）、山羊血清（批號SBJ012）均購自南京森貝伽生物科技有限公司；D-乳酸試劑盒、D-氨基酸氧化酶（Daminoacid oxidase，DAO）試劑盒、鼠源閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）抗體、鼠源閉鎖蛋白（Occludin）抗體、鼠源RhoA抗體、鼠源ROCK1 抗體（批號依次為ab197004、ab273325、ab307799、ab216327、ab187027、ab134181）均購自英國Abcam 公司；IL-6 試劑盒（批號QN-PS1726）購自上海岑特生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號ER006）購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級大鼠，雄性，體重（190±20） g，購自廣州明迅生物科技有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2024-0070。大鼠在無特異性病原體的標準環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1 周，自由攝食、飲水。本研究通過河北中醫(yī)藥大學實驗動物管理和倫理委員會批準（編號：DWLL202306019）。

2 方法

2.1 膿毒癥大鼠模型的制備及干預

大鼠禁食8 h 后，按照隨機數(shù)字表法分為造模組（n＝50）及假手術組（n＝10）。造模組大鼠腹腔注射30mg/kg 戊巴比妥鈉進行麻醉，采用盲腸結扎和穿刺法建立膿毒癥模型[5]。假手術組大鼠接受相同的手術，不包括盲腸結扎和穿刺。術后監(jiān)測大鼠平均動脈壓，當平均動脈壓下降30%，提示膿毒癥大鼠模型構建成功。將造模成功的大鼠隨機分為膿毒癥組、馬錢苷低劑量組、馬錢苷高劑量組、陽性對照組、馬錢苷高劑量+LPA組，每組10 只。馬錢苷低、高劑量組大鼠分別灌胃50、200mg/kg 的馬錢苷[6]；陽性對照組大鼠腹腔注射0.2 mg/kg的阿托伐他汀[7]；馬錢苷高劑量+LPA 組大鼠灌胃200mg/kg 的馬錢苷，并腹腔注射10 mg/kg 的LPA[8]；膿毒癥組和假手術組大鼠灌胃與馬錢苷等體積的生理鹽水，每6 h給藥1 次，連續(xù)給藥4 次。

2.2 血清炎癥因子指標分析

末次給藥24 h 后，麻醉并處死各組大鼠，從其心臟抽取血液，并以3 000×g 離心15 min，取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

2.3 回腸組織病理學變化觀察

對各組大鼠血液收集完畢后，分離其回腸組織，取部分組織用4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋，制成切片（5μm），經(jīng)脫蠟、脫水后，行蘇木精和伊紅染色，用光學顯微鏡觀察回腸組織病理學變化，依據(jù)組織學損傷變化進行Chiu’s 腸黏膜損傷評分[9]。

2.4 回腸組織中腸功能指標的檢測

取“2.3”項下各組大鼠的回腸組織，以5 000×g 離心10 min 進行勻漿，取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腸道黏膜屏障功能指標DAO、D-乳酸及內毒素的水平。

2.5 回腸組織中ZO-1、Occludin的陽性表達檢測

取“2.3”項下各組大鼠的回腸組織切片，常規(guī)脫蠟并用梯度乙醇水合，用抗原修復溶液，冷卻后，滴加山羊血清封片，隨后加入ZO-1、Occludin 抗體（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000），在4 °C下孵育過夜；次日加入相應二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫避光孵育2 h 后，以DAB顯色、蘇木精再染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹脂封片，用顯微鏡觀察ZO-1、Occludin 的陽性染色面積。采用Image J軟件計算陽性染色面積百分比。

2.6 回腸組織中RhoA、ROCK1 的蛋白表達檢測

取“2.3”項下各組大鼠的回腸組織，提取總蛋白，于98 ℃水浴中煮沸10 min 進行變性，經(jīng)電泳分離并濕法轉膜后加入脫脂牛奶，封閉過夜，次日加入RhoA、ROCK1、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（稀釋比例均為1∶1 000），在4 °C下孵育過夜；洗膜后，次日加入相應二抗（稀釋比例為1∶200），室溫孵育1.5 h；使用Super ECL試劑盒呈色，采用凝膠成像系統(tǒng)和Image J 軟件分析，以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 27.0 軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 馬錢苷對大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 水平的影響

與假手術組比較，膿毒癥組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，馬錢苷低、高劑量組和陽性對照組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P＜0.05），且馬錢苷高劑量組顯著低于馬錢苷低劑量組（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，馬錢苷高劑量+LPA 組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 馬錢苷對大鼠回腸組織病理學的影響

假手術組大鼠回腸組織無壞死、水腫等現(xiàn)象，組織結構完整；膿毒癥組大鼠回腸組織絨毛排列紊亂，黏膜下間質水腫及炎性浸潤顯著，組織破壞嚴重，Chiu’s 腸黏膜損傷評分[（5.17±0.53）分]較假手術組（0 分）顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，馬錢苷低、高劑量組和陽性對照組大鼠回腸組織的破壞程度得到緩解，組織水腫及炎性浸潤均明顯減輕，Chiu’s 腸黏膜損傷評分[分別為（3.34±0.37）、（2.06±0.22）、（2.18±0.23）分]均顯著降低（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，馬錢苷高劑量+LPA組大鼠回腸組織損傷加重，Chiu’s 腸黏膜損傷評分[（3.42±0.36）分]顯著升高（P＜0.05）。結果見圖1。

3.3 馬錢苷對大鼠回腸組織中DAO、D-乳酸及內毒素水平的影響

與假手術組比較，膿毒癥組大鼠回腸組織中DAO、D-乳酸及內毒素水平均顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，馬錢苷低、高劑量組和陽性對照組大鼠回腸組織中DAO、D-乳酸及內毒素水平均顯著降低，且馬錢苷高劑量組顯著低于馬錢苷低劑量組（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，馬錢苷高劑量+LPA組大鼠回腸組織中DAO、D-乳酸及內毒素水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

3.4 馬錢苷對大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 陽性表達的影響

與假手術組比較，膿毒癥組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著降低（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，馬錢苷低、高劑量組和陽性對照組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著升高，且馬錢苷高劑量組顯著高于馬錢苷低劑量組（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，馬錢苷高劑量+LPA組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、圖3、表3。

3.5 馬錢苷對大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白表達的影響

與假手術組比較，膿毒癥組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，馬錢苷低、高劑量組和陽性對照組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著降低，且馬錢苷高劑量組顯著低于馬錢苷低劑量組（P＜0.05）；與馬錢苷高劑量組比較，馬錢苷高劑量+LPA組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4、表4。

4 討論

在膿毒癥發(fā)生期間，機體炎癥反應急劇增加，釋放大量炎癥因子，大量細菌和內毒素進入血液，加劇炎癥反應并加速隨后器官損傷的過程。腸道是受膿毒癥影響的第一個器官。腸黏膜的完整性被破壞，會導致腸道屏障功能受損，引起宿主的過度炎癥反應，誘發(fā)全身炎癥反應綜合征，而全身炎癥反應綜合征會再次損害腸道，兩者互為因果、相互促進，最終造成膿毒癥及多器官功能障礙[10―11]。TNF-α在膿毒癥的發(fā)病機制中起關鍵作用，IL-1β、IL-6 則能啟動膿毒癥級聯(lián)反應并反映炎癥反應程度[12]。本研究通過盲腸結扎和穿刺法建立膿毒癥大鼠模型，結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高，回腸組織損傷嚴重，Chiu’s 評分顯著升高，表明炎癥反應可引發(fā)腸黏膜的損害。DAO是哺乳動物腸道黏膜中的一種高濃度酶，D-乳酸是腸道細菌的一種代謝產物，是腸道黏膜病變和屏障功能的敏感標志物[13]。本研究結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組大鼠回腸組織中DAO、D-乳酸、內毒素水平均顯著升高，提示膿毒癥大鼠腸道屏障受損，此時迫切需要能調控該并發(fā)癥的藥物以改善療效。

馬錢苷具有抗炎、抗氧化等活性，對某些炎癥性疾病具有明顯的治療作用，如結腸炎、嚴重燒傷引發(fā)的腸道損傷等[4]。本研究結果顯示，馬錢苷能顯著改善大鼠的炎癥反應、腸道指標及組織損傷，與陽性對照藥阿托伐他汀的改善效果無明顯差異。這提示馬錢苷可能對膿毒癥引發(fā)的腸道損傷具有改善作用。

細胞間緊密連接對維持和調節(jié)腸道屏障功能具有重要性。Occludin、ZO-1 是腸黏膜中緊密連接蛋白的成員，Occludin 影響細胞間物質的通透性，ZO-1 可結合多種細胞骨架蛋白，二者在維持腸黏膜屏障功能方面至關重要[14]。RhoA是Rho家族蛋白的一員，是細胞信號轉導的轉導分子之一，而ROCK1 是RhoA的主要下游信號分子。Rho/ROCK1 信號通路會影響細胞骨架及其緊密連接，進而改變腸黏膜屏障的通透性，在維持腸黏膜屏障完整性中發(fā)揮重要作用[15]。本研究結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著升高，ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著降低，提示激活RhoA/ROCK1 信號通路可能影響膿毒癥大鼠的腸道屏障功能；但經(jīng)馬錢苷干預后，大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1 蛋白的相對表達水平均顯著降低，ZO-1、Occludin 陽性染色面積百分比均顯著升高，推斷馬錢苷對膿毒癥引發(fā)的腸道損傷具有改善作用，這可能與抑制RhoA/ROCK1 信號通路有關。為了驗證上述推斷，本研究還將RhoA 激活劑LPA納入實驗，設置了馬錢苷高劑量+LPA組，結果顯示，LPA可顯著逆轉高劑量馬錢苷對膿毒癥致腸道損傷的改善作用，提示馬錢苷可通過降低RhoA/ROCK1 信號通路的活性來減輕膿毒癥大鼠腸道屏障損傷及炎癥反應。

綜上所述，馬錢苷可減輕膿毒癥大鼠炎癥反應和腸道屏障損傷，其機制與抑制RhoA/ROCK1 信號通路有關。但由于膿毒癥并發(fā)腸道屏障損傷的發(fā)病機制復雜，具有多方面的發(fā)病機制及通路，因此后續(xù)實驗將針對其他機制進行進一步的研究。

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（收稿日期：2024-09-30 修回日期：2025-02-24）

（編輯：鄒麗娟）

基金項目河北省中醫(yī)藥類科研計劃課題（No. 2022065，No.2020103）