circPRMT5靶向miR-376a-3p調(diào)控膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制

摘要""目的：探討circPRMT5對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制。方法：選取2020年5月—2022年5月我院腦膠質(zhì)瘤組織和顱腦外傷病人腦組織標(biāo)本各37例；膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251分為si-NC組、si-circPRMT5組、pcDNA組、pcDNA-circPRMT5組、miR-NC組、miR-376a-3p組、si-circPRMT5＋anti-miR-NC組及si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測circPRMT5和miR-376a-3p表達(dá)水平；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。雙熒光素酶報告實驗檢測circPRMT5和miR-376a-3p的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果：與顱腦外傷病人腦組織比較，膠質(zhì)瘤組織中circPRMT5表達(dá)水平（2.55±0.18與1.00±0.07）升高，miR-376a-3p表達(dá)水平（0.42±0.05與1.00±0.06）］降低（P＜0.05）。抑制circPRMT5表達(dá)后，細(xì)胞活性（0.32±0.03與0.74±0.06）降低，細(xì)胞凋亡率［（22.37±1.83）%與（7.47±0.62）%］升高，周期蛋白D1（CyclinD1）及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）蛋白相對表達(dá)量降低，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）及Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。過表達(dá)miR-376a-3p后，細(xì)胞活性（0.41±0.04與0.76±0.07）降低，細(xì)胞凋亡率［（19.51±1.40）%與（7.37±0.53）%］升高，CyclinD1及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低，p21及Bax蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。miR-376a-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circPRMT5的細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC組（0.59±0.04與1.03±0.07，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染MUT-circPRMT5的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化（1.00±0.05與1.02±0.08，P＞0.05）。結(jié)論：抑制circPRMT5表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-376a-3p抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞""膠質(zhì)瘤；增殖；凋亡；circPRMT5；miR-376a-3p；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.04.008

circPRMT5 Targets miR-376a-3p to Regulate Proliferation and Apoptosis of Glioma U251 Cells

HUANG Chao， FANG Xinggang， CHEN Lu

Taihe Hospital， Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China

Corresponding Author "FANG Xinggang， E-mail： 957336859@qq.com

Abstract "Objective：To explore the effect and molecular mechanism of circPRMT5 on the proliferation and apoptosis of glioma U251 cells.Methods：A total of 37 specimens of brain glioma tissues and 37 specimens of brain tissues from patients with craniocerebral trauma were selected from May 2020 to May 2022.U251 glioma cells were divided into si-NC group，si-circPRMT5 group，pcDNA group，pcDNA-circPRMT5 group，miR-NC group，miR-376a-3p group，si-circPRMT5+anti-miR-NC group，and si-circPRMT5+anti-miR-376a-3p group.Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） was used to detect the expressions of circPRMT5 and miR-376a-3p.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） was used to detect cell activity.Flow cytometry was used to detect apoptosis.The expression of proteins related to cell proliferation and apoptosis was detected by Western Blot.The dual luciferase reporter assay was used to detect the relationship between circPRMT5 and miR-376a-3p.Results：Compared with the brain tissue of patients with traumatic brain injury，the expression level of circPRMT5 in glioma tissue was increased（2.55±0.18 vs 1.00±0.07，P＜0.05），and the expression level of miR-376a-3p was decreased（0.42±0.05 vs 1.00±0.06，P＜0.05）.After inhibiting the expression of circPRMT5，cell viability （0.32±0.03 vs 0.74±0.06） was decreased，cell apoptosis rate [（22.37±1.83）% vs （7.47±0.62）%] was increased，the expression levels of CyclinD1 and B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2） were decreased，and the expression levels of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A（p21） and Bcl-2 related X（Bax） protein were increased（P＜0.05）.After overexpression of miR-376a-3p，cell viability（0.41±0.04 vs 0.76±0.07） was decreased，and cell apoptosis rate[（19.51±1.40）% vs （7.37±0.53）%] was increased，the expression levels of CyclinD1 and Bcl-2 were decreased，and the expression levels of p21 and Bax were increased（P＜0.05）.Compared with the miR-NC group，the luciferase activity of cells transfected with WT-circPRMT5 in the miR-376a-3p group was decreased（0.59±0.04 vs 1.03±0.07，P＜0.05），while the luciferase activity of cells transfected with MUT-circPRMT5 was no significant change（1.00±0.05 vs 1.02±0.08，P＞0.05）.Conclusion：Inhibition of circPRMT5 expression may inhibit the proliferation of glioma U251 cells and promote apoptosis by targeting up-regulation of miR-376a-3p.

Keywords""glioma; proliferation; apoptosis; circPRMT5; miR-376a-3p; experimental research

膠質(zhì)瘤屬于顱內(nèi)惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療方法效果有限，分子靶向治療作為一種新的方法在治療膠質(zhì)瘤中逐漸得到認(rèn)可^［1-2］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在癌癥中起著重要作用，可作為分子治療的靶點^［3］。circPRMT5與許多惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。研究報道，circPRMT5參與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱上皮癌等腫瘤的調(diào)控^［4-7］。目前膠質(zhì)瘤中circPRMT5表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚無相關(guān)報道。研究顯示，微小RNA（miRNA）參與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制^［8］，過表達(dá)miR-376a-3p可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖^［9］。miR-376a-3p過表達(dá)抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力^［10］。本研究前期通過生物學(xué)在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circPRMT5與miR-376a-3p存在結(jié)合位點，推測circPRMT5可能對miR-376a-3p具有靶向調(diào)控作用。本實驗探討circPRMT5對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月—2022年5月本院經(jīng)病理組織學(xué)確診為腦膠質(zhì)瘤37例病人組織標(biāo)本，男17例，女20例；年齡（35±2）歲；世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級4例，Ⅱ級15例，Ⅲ級12例，Ⅳ級6例。另選擇37例顱腦外傷病人為對照，包括男19例，女18例；年齡（31±2）歲。病人及家屬知情并同意本研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理批號：科研快審〔2020KS31〕號）。

1.2 細(xì)胞與主要試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自武漢愛博泰克公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒、蛋白質(zhì)提取及檢測相關(guān)試劑盒購自武漢賽維爾公司；膜凋亡檢測相關(guān)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京義翹神州公司。

1.3 細(xì)胞處理與分組

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251完全培養(yǎng)基為10%胎牛血清＋90%RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃培養(yǎng)箱、5% CO₂，取對數(shù)生長期細(xì)胞，將si-NC、si-circPRMT5、pcDNA、pcDNA-circPRMT5、miR-NC及miR-376a-3p分別轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞（分別標(biāo)記為si-NC組、si-circPRMT5組、pcDNA組、pcDNA-circPRMT5組、miR-NC組、miR-376a-3p組）。分別將si-circPRMT5與anti-miR-NC、anti-miR-376a-3p共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中（分別記為si-circPRMT5＋anti-miR-NC組、si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組）。另選擇未行任何處理的U251細(xì)胞為對照（Con組）。周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X（Bcl-2 associated X，Bax）蛋白等一抗購自北京天根公司。上述各組細(xì)胞處理24 h后培養(yǎng)24 h行后續(xù)檢測。

1.4 circPRMT5和miR-376a-3p表達(dá)檢測

qRT-PCR檢測circPRMT5和miR-376a-3p表達(dá)。提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA擴(kuò)增檢測，circPRMT5正向引物序列：5′-GTACCGTTATGGGCTGCTGT-3′，反向引物序列：5′-TATGCATTTCCCTCCCTCTG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物序列：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；miR-376a-3p正向引物序列：5′-ATCATAGAGGAAAATCCACGT-3′，反向引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6正向引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。具體檢測步驟參考文獻(xiàn)［5］。采用2^－△△Ct法計算circPRMT5和miR-376a-3p的相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測

采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm下吸光度（OD）值，計算細(xì)胞增殖活性。

1.6 CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白表達(dá)檢測

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白表達(dá)。提取各組細(xì)胞總蛋白，電泳顯像后拍照，選擇GAPDH為內(nèi)參，計算CyclinD1、Bcl-2、p21及Bax蛋白相對表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。收集上述各組細(xì)胞并制作成細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡并計算凋亡率。

1.8 檢測circPRMT5和miR-376a-3p的靶向調(diào)控關(guān)系

構(gòu)建circPRMT5野生型（WT-circPRMT5）和突變型（MUT-circPRMT5）熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miRNA共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Medcalc 22.8行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（組間兩兩比較采用SNK檢驗）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circPRMT5和miR-376a-3p在膠質(zhì)瘤病人及顱腦外傷病人中的表達(dá)比較

與對照組比較，膠質(zhì)瘤組織中circPRMT5表達(dá)水平升高（t=48.818，P＜0.05），miR-376a-3p表達(dá)水平降低（t=－45.171，P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 抑制circPRMT5表達(dá)時U251細(xì)胞增殖改變

與si-NC組比較，si-circPRMT5組circPRMT5表達(dá)水平降低（t=－14.298，P＜0.05），細(xì)胞活性降低（t=－18.783，P＜0.05），CyclinD1表達(dá)降低（t=－27.504，P＜0.05），p21表達(dá)水平升高（t=24.820，P＜0.05）。詳見圖2～圖4。

2.3 抑制circPRMT5表達(dá)時U251細(xì)胞凋亡改變

si-circPRMT5組凋亡率及Bax蛋白表達(dá)升高，明顯高于Con組及si-NC組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于Con組及si-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖5～圖8。

2.4 circPRMT5靶向調(diào)控miR-376a-3p檢測

circPRMT5與miR-376a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列提示circPRMT5對miR-376a-3p存在靶向調(diào)控可能，見圖9。miR-376a-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circPRMT5的細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miR-NC組（t=16.373，P＜0.05），詳見圖10。pcDNA-circPRMT5組miR-376a-3p表達(dá)水平低于pcDNA組（t=－19.181，P＜0.05）；si-circPRMT5組miR-376a-3p表達(dá)水平高于si-NC組（t=21.441，P＜0.05）。詳見圖11。

2.5 上調(diào)miR-376a-3p表達(dá)時U251細(xì)胞增殖和凋亡改變

miR-376a-3p組miR-376a-3p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、p21、Bax表達(dá)明顯高于miR-NC組，細(xì)胞活性、CyclinD1、Bcl-2表達(dá)明顯低于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖12～圖14及表1

2.6 下調(diào)miR-376a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circPRMT5表達(dá)對U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響

si-circPRMT5＋anti-miR-376a-3p組miR-376a-3p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、p21、Bax表達(dá)低于si-circPRMT5＋anti-miR-NC組，細(xì)胞活性、CyclinD1、Bcl-2表達(dá)高于si-circPRMT5＋anti-miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖15～圖17及表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中circPRMT5表達(dá)水平升高，提示circPRMT5可能在膠質(zhì)瘤中有促癌基因作用。下調(diào)circPRMT5表達(dá)后U251細(xì)胞活性、CyclinD1及Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率、p21及Bax表達(dá)升高，提示下調(diào)circPRMT5表達(dá)時可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。研究報道circPRMT5在乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，敲低circPRMT5可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡^［11］。circPRMT5可通過調(diào)控不同miRNA促進(jìn)胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌細(xì)胞的進(jìn)展^［12-14］。表明circPRMT5在多種腫瘤中可能作為促癌基因起作用，與本實驗circPRMT5在膠質(zhì)瘤中起促癌作用的結(jié)果一致。本研究報道了circPRMT5在膠質(zhì)瘤中的作用，不僅進(jìn)一步揭示了膠質(zhì)瘤的可能發(fā)病機(jī)制，還為其靶向治療提供了可能的分子靶點。

circRNA可充當(dāng)具有基因調(diào)控潛力的高效microRNA的海綿，為研究circPRMT5影響膠質(zhì)瘤的可能作用機(jī)制，本研究通過StarBase在線軟件預(yù)測circPRMT5可能結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)circPRMT5與miR-376a-3p存在可能結(jié)合位點，進(jìn)一步雙熒光素酶報告實驗表明，circPRMT5對miR-376a-3p具有靶向調(diào)控作用。本研究還發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中miR-376a-3p表達(dá)水平降低，與研究中miR-376a-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)的結(jié)果^［10］一致。且本實驗過表達(dá)miR-376a-3p后可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步證明了過表達(dá)miR-376a-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，且新發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-376a-3p可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。miR-376a-3p可影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展^［15］。說明miR-376a-3p在結(jié)直腸癌中也起抑癌基因作用，本實驗結(jié)果與其一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-376a-3p表達(dá)后，抑制circPRMT5表達(dá)對U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響得到逆轉(zhuǎn)，這些證據(jù)表明circPRMT5調(diào)控U251細(xì)胞的增殖和凋亡的分子機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-376a-3p有關(guān)。

綜上所述，circPRMT5對U251細(xì)胞增殖及凋亡具有調(diào)控作用，其分子機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-376a-3p有關(guān)。然而本研究目前僅在體外細(xì)胞層面研究circPRMT5對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響，有一定的局限性。下一步將在小鼠中進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)實驗，以進(jìn)一步證實其在體內(nèi)腫瘤中的作用。

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（收稿日期：2023-05-01）

（本文編輯"王麗）