基于LDHA基因和Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討自噬在卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移及糖酵解中的作用

［摘 要］目的 探討自噬通過調(diào)控乳酸脫氫酶A（LDHA）和Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力和糖酵解的影響。方法 2021年1月至2022年12月在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院使用厄爾平衡鹽溶液（EBSS）饑餓處理誘導(dǎo)人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞誘導(dǎo)自噬。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組1為：Control組、EBSS組和EBSS+3-MA組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組2為：EBSS+NC-shRNA組、EBSS+LDHA-shRNA1組和EBSS+LDHA-shRNA2組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組3為：EBSS+NC-shRNA組、EBSS+β-catenin-shRNA1組和EBSS+β-catenin-shRNA2組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法、Western blotting法、Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色等檢測并統(tǒng)計(jì)分析有關(guān)表達(dá)量的情況。結(jié)果 Control組和EBSS組及EBSS+3-MA組間細(xì)胞的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量相對(duì)比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝113.900，P＜0.01）。Control組和EBSS組及EBSS+3-MA組間細(xì)胞的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為2 448.000、1 405.000、111.000、132.200，P＜0.01）。Control組和EBSS組及EBSS+3-MA組間細(xì)胞的LDHA mRNA、GLUT1 mRNA、LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為311.400、66.940、154.200，P＜0.01）。NC-shRNA組和LDHA-shRNA1組及LDHA-shRNA2組間細(xì)胞的LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝123.200，P＜0.01）。Control組和EBSS組及EBSS+3-MA組間細(xì)胞的β-catenin、p-β-catenin磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為206.500、222.200，P＜0.01）。NC-shRNA組和β-catenin-shRNA1組及β-catenin-shRNA2組間細(xì)胞的β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝127.000，P＜0.01）。結(jié)論 饑餓誘導(dǎo)的自噬激活可促進(jìn)卵巢癌的侵襲、遷移能力及糖酵解活性，其機(jī)制可能與自噬激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路并上調(diào)LDHA表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］卵巢癌；自噬；乳酸脫氫酶A；糖酵解；β-連環(huán)蛋白

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2025.02.006

［中圖分類號(hào)］R173 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1673-5293（2025）02-0037-10

Role of autophagy in invasion and migration and glycolysis of ovarian cancer cellsinvestigated based on LDHA gene and Wnt/β-catenin signaling pathway

CHEN Liangfeng1，2，LV Xiaohui3，WANG Jian3，MA Yuanyuan4

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Ankang Central Hospital，Shaanxi Ankang 725000，China;2.Department of Obstetrics and Gynecology，Ankang Gaoxin Hospital，Shaanxi Ankang 725000，China;3.Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of the Air Force Military Medical University，Shaanxi Xi′an 710032，China;4.Department of Obstetrics and Gynecology，Yan′an Central Hospital，Shaanxi Yan′an 716000，China）

［Abstract］ Objective To investigate the effects of autophagy on ovarian cancer cell invasion，migration and glycolysis by regulating lactate dehydrogenase A （LDHA） and Wnt/β-caten β in signaling pathways. Methods From January 2021 to December 2022，autophagy was induced by starvation treatment with Earl balanced salt solution （EBSS） in Xijing Hospital of Air Force Medical University，human ovarian adenocarcinoma cell line SKOV3 cells. Cell experiment group 1 was divided into control group，EBSS group and EBSS+3-MA group. Cell experimental group 2 was as follows：EBSS+NC-shRNA group，EBSS+LDHA-shRNA1 group and EBSS+LDHA-shRNA2 group. Group 3 of the cell experiment was EBSS+NC-shRNA group，EBSS+β-catenin-shRNA1 group，and EBSS+β-catenin-shRNA2 group. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR），Western blotting，Transwell assay，and cell immunofluorescence staining were used to detect and statistically analyze the expression level. Results There was a significant difference in the relative ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression between control group，EBSS group and EBSS+3-MA group （F＝113.900，P＜0.01）. There were significant differences in the number of invasive and migrating cells and the relative expression levels of MMP2 and MMP9 proteins between the Control group，the EBSS group and the EBSS+3-MA group （F values were 2 448.000，1 405.000，111.000 and 132.200，respectively，P＜0.01）. There were significant differences in the relative expressions of LDHA mRNA，GLUT1 mRNA and LDHA protein between the control group，the EBSS group and the EBSS+3-MA group （F values were 311.400，66.940 and 154.200，P＜0.01，respectively）. There was a significant difference in the relative expression of LDHA protein between the NC-shRNA group，LDHA-shRNA1 group and LDHA-shRNA2 group （F＝123.200，P＜0.01）. There were significant differences in the relative expressions of β-catenin and phosphorylated p-β-catenin between the control group，the EBSS group and the EBSS+3-MA group （F-values were 206.500 and 222.200，P＜0.01，respectively）. There was a significant difference in the relative expression of β-catenin between the NC-shRNA group，the β-catenin-shRNA1 group and the β-catenin-shRNA2 group （F＝127.000，P＜0.01） . Conclusion Starvation-induced autophagy activation can promote the invasion，migration and glycolytic activity of ovarian cancer，which may be related to the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway and up-regulation of LDHA expression by autophagy.

［Key words］ ovarian cancer;autophagy;lactate dehydrogenase A;glycolysis;β-catenin

卵巢癌是世界范圍內(nèi)最常見的婦科惡性腫瘤之一，因早期診斷準(zhǔn)確率低，晚期廣泛轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡率最高，預(yù)后差［1-2］。雖然卵巢癌的治療策略已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，包括手術(shù)、化療和放療，但卵巢癌患者的5年生存率仍然低于45%［3］。因此，尋找更多有效地治療卵巢癌的方法迫在眉睫。

正常細(xì)胞在有氧條件下，首先通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后丙酮酸通過三羧酸循環(huán)進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化磷酸化，并產(chǎn)生大約38個(gè)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）分子。當(dāng)氧氣不足時(shí)，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，通過厭氧糖酵解只產(chǎn)生2個(gè)ATP分子。而在腫瘤中存在另一種被稱為“沃伯格效應(yīng)”的現(xiàn)象，即使有足夠的氧氣，腫瘤細(xì)胞仍然使用效率較低的“有氧糖酵解”過程來更快地獲得能量［4］。由于氧化磷酸化的代謝損傷，ATP濃度降低。為了補(bǔ)償減少的能量產(chǎn)出，腫瘤細(xì)胞大量攝取葡萄糖，厭氧糖酵解、戊糖磷酸途徑等上調(diào)，生物合成增加。在腫瘤的中心區(qū)域通常是低氧、缺氧環(huán)境，腫瘤細(xì)胞會(huì)更多地進(jìn)入“沃伯格效應(yīng)”的能量代謝重編程，這將需要更高地合成代謝。細(xì)胞（巨）自噬（autophagy）是一種具有維持穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞生存功能的溶酶體分解代謝過程，自噬后的降解產(chǎn)物可作為底物被腫瘤細(xì)胞用于新的合成代謝途徑［5］。自噬是一把雙刃劍，具有促癌和抑癌兩種效應(yīng)。自噬降解去除受損或功能失調(diào)的細(xì)胞器和損傷的DNA，可以抑制腫瘤的發(fā)展；也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在缺氧惡劣環(huán)境中的存活并賦予其耐藥性［5-6］。缺氧導(dǎo)致的ATP濃度降低可上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），激活5′-腺苷磷酸依賴蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑，增強(qiáng)癌細(xì)胞存活率［7-8］。但自噬如何調(diào)控葡萄糖代謝尚不明晰。

乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶。在卵巢癌中，LDHA表達(dá)顯著增強(qiáng)，并賦予卵巢癌聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribos polymerase，PARP）抑制劑抗性［9］。但是LDHA在糖酵解調(diào)節(jié)中的作用仍不清楚。本研究旨在探討自噬、LDHA影響卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移及糖酵解能力的機(jī)制，為進(jìn)一步研究自噬在卵巢癌疾病發(fā)展和治療中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1研究材料與方法

自2021年1月至2022年12月在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，研究自噬通過調(diào)控LDHA和Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力及糖酵解的影響。

本研究已經(jīng)通過空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：20241183）。

1.1主要試劑和儀器

人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞，中國科學(xué)院ATCC細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）厄爾平衡鹽溶液（Earle’s balanced salt solution，EBSS）、3-甲基腺嘌呤（3-methyl-3H-adenine，3-MA），美國Gibco公司；乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒，上海碧云天生物有限公司；NC-shRNA、LDHA-shRNA1、LDHA-shRNA2、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）-shRNA1、β-catenin-shRNA2，BCA蛋白測定試劑盒，賽默飛世爾科技公司（中國）；LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、LDHA、β-catenin一抗，美國Sigma公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）儀，美國Applied Biosystems公司；多功能酶標(biāo)儀，奧地利TECAN公司；倒置普通光學(xué)顯微鏡，德國Leica公司。

1.2方法

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組1為：Control組、EBSS組和EBSS+3-MA組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組2為：EBSS+NC-shRNA組、EBSS+LDHA-shRNA1組和EBSS+LDHA-shRNA2組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組3為：EBSS+NC-shRNA組、EBSS+β-catenin-shRNA1組和EBSS+β-catenin-shRNA2組。

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將人卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞在含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。使用EBSS或10μmol/L自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞6h。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板，密度為1×106細(xì)胞/孔。進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞至50%融合，使用Lipofectamine 3000并根據(jù)說明書將NC-shRNA、LDHA-shRNA1、LDHA-shRNA2、β-catenin-shRNA1和β-catenin-shRNA2轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。shRNAs序列如下：

LDHA-shRNA1：5′-GGATATACCAACTGGG CTA-3′，LDHA-shRNA2：5′-GTACAGTCCTGAT TGCATC-3′；β-catenin-shRNA1：5′-TTGGAATGA GACTGCTGAT-3′，β-catenin-shRNA2：5′-CATGG AAGAAATAGTTGAA-3′；NC-shRNA：5′-TTCTC CGAACGTGTCACGT-3′。

1.2.2 RT-qPCR檢測分析

按照說明書，使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。然后，使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，采用SYBR Green進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增分析。每個(gè)樣本中基因的相對(duì)表達(dá)均采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量。GAPDH作為基因的內(nèi)參。

引物序列如下：GLUT1 F 5′-CCCCGTCCTGC TGCTATTG-3′，R 5′-GCACCGTGAAGATGATG AAGAC-3′；LDHA F 5′-CCAACATGGCAGCCTT TTCCTTAGAACACC-3′，R 5′-GACGTGCCCCA GCCGTGATAATGAC-3′；LDHB F 5′-GTGGAG TGGAGTGAATGTGG-3′，R 5′-TGTCTGTTCCC ATTCTGGA-3′；β-Actin F 5′-TGATGATATCGC CGCGCTCG-3′，R 5′-AGGCCCAGAGCAAGAGA GGC-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定6次。

1.2.3 Western blotting法

使用放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）從SKOV3細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品在10% SDS-PAGE上分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）上。5%脫脂牛奶封閉后，用一抗LDHA（1∶1 000稀釋）、β-catenin（1∶1 000稀釋）和β-Actin（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。然后用TBST沖洗膜3次，山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）孵育1h，再次沖洗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑觀察蛋白條帶，并使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定6次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移

檢測細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，將轉(zhuǎn)染的2×105個(gè)SKOV3細(xì)胞接種在涂有Matrigel膠的Transwell小室上腔中，下腔加入600μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，將小室取出。用PBS洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，并用棉簽小心地擦拭小室內(nèi)側(cè)底面的細(xì)胞，在室溫下放置5min進(jìn)行空氣干燥。用0.1%結(jié)晶紫染色30min，隨后PBS洗滌3次，風(fēng)干。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不同的視野進(jìn)行觀察拍照，使用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使用未涂有Matrigel膠的Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)一致。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定6次。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞爬片后，在培養(yǎng)板中用PBS洗滌細(xì)胞，隨后用4%多聚甲醛固定15min，0.2% Triton X-100通透10min，山羊血清封閉30min，PBS洗滌3次。用抗LC3的一抗（1∶500稀釋）4℃孵育過夜。然后，將細(xì)胞與相應(yīng)的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育1h，并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核。共聚焦熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.6細(xì)胞能量代謝水平的檢測

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基，分別使用葡萄糖檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒，根據(jù)說明書測定葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量。結(jié)果按細(xì)胞總蛋白量歸一化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定6次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）的形式表示，采用t檢驗(yàn)分析兩組之間的差異，使用單因素方差分析多組間差異。當(dāng)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1饑餓對(duì)卵巢癌細(xì)胞自噬的影響

采用Western blotting和免疫熒光染色法對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與Control組比較，EBSS組SKOV3細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量相對(duì)比值顯著升高，熒光斑點(diǎn)聚集增多；與EBSS組比較，EBSS+3-MA組細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量相對(duì)比值顯著降低，熒光斑點(diǎn)減少；三組間細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量相對(duì)比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝113.900，P＜0.01），表明饑餓處理可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬，見圖1和表1。

2.2饑餓及自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組比較，EBSS組SKOV3細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.01），MMP2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與EBSS組比較，EBSS+3-MA組細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），MMP2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；三組間細(xì)胞的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)及基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為2 448.000、1 405.000、111.000、132.200，P＜0.01），表明饑餓可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，抑制自噬抑制饑餓對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的促進(jìn)作用，見圖2和表2。

2.3饑餓及自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶活性的影響

與Control組比較，EBSS組SKOV3細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖消耗量和乳酸生成量顯著升高（P＜0.01），與EBSS組比較，EBSS+3-MA組細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖消耗量和乳酸生成量顯著降低（P＜0.01）；三組間細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖消耗量和乳酸生成量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為53.060、44.300，P＜0.01），見表3。

RT-qPCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，EBSS組SKOV3細(xì)胞LDHA mRNA、GLUT1 mRNA、LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），而LDHB mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著性變化（P＞0.05）；與EBSS組比較，EBSS+3-MA組細(xì)胞LDHA mRNA、GLUT1 mRNA、LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），而LDHB mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著性變化（P＞0.05）；三組間細(xì)胞的LDHA mRNA、GLUT1 mRNA、LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為311.400、66.940、154.200，P＜0.01），表明饑餓上調(diào)了LDHA的表達(dá)，抑制自噬抑制饑餓對(duì)LDHA的上調(diào)表達(dá)，見圖3和表3。

2.4 LDHA和自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞糖酵解的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NC-shRNA組比較，LDHA-shRNA1組和LDHA-shRNA2組LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），三組間細(xì)胞的LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝123.200，P＜0.01），見圖4、表4。

進(jìn)一步用EBSS對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理（誘導(dǎo)自噬）后結(jié)果顯示，與EBSS+NC-shRNA組比較，EBSS+LDHA-shRNA1和EBSS+LDHA-shRNA2組細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖消耗量、乳酸生成量顯著降低（P＜0.01）；三組間細(xì)胞的相對(duì)葡萄糖消耗量、乳酸生成量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為106.300、90.110，P＜0.01），表明LDHA參與了饑餓及自噬誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞糖酵解，見表5。

2.5 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在卵巢癌細(xì)胞自噬中的作用

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，EBSS組SKOV3細(xì)胞內(nèi)β-catenin、p-β-catenin磷酸化相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與EBSS組比較，EBSS+3-MA組細(xì)胞β-catenin、p-β-catenin磷酸化相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；三組間細(xì)胞的β-catenin、p-β-catenin磷酸化相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為206.500、222.200，P＜0.01），表明饑餓誘導(dǎo)的自噬可以激活磷酸化的β-catenin，抑制自噬可以抑制β-catenin的磷酸化，見圖5和表6。

2.6 β-catenin對(duì)饑餓和自噬誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞糖酵解的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NC-shRNA組比較，β-catenin-shRNA1組和β-catenin-shRNA2組SKOV3細(xì)胞內(nèi)β-catenin相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；三組間細(xì)胞的β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝127.000，P＜0.01），見圖6、表7。

與EBSS+NC-shRNA組比較，EBSS+β-catenin-shRNA1組和EBSS+β-catenin-shRNA2組LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量、相對(duì)葡萄糖消耗量及乳酸生成量均顯著降低（P＜0.01），三組間細(xì)胞的LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)量、相對(duì)葡萄糖消耗量及乳酸生成量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為153.600、128.300、50.530，P＜0.01），表明β-catenin下調(diào)抑制饑餓及自噬誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞糖酵解，見圖6和表8。

3討論

3.1自噬對(duì)癌細(xì)胞行為的影響

由于過度的自我消耗可能對(duì)細(xì)胞有害，自噬由一系列稱為UNC-51樣激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）和激酶2（UNC-51-like kinase 2，ULK2）的蛋白因子控制，其與自噬相關(guān)基因13（autophagy-related genes 13，ATG13）、自噬核心蛋白和200kDa家族相互作用蛋形成復(fù)合物，在自噬起始中起關(guān)鍵作用。自噬主要受AMPK和雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)剝奪或氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，AMPK可激活自噬；相反，在營養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1通過降低ULK1的激活抑制自噬。高水平自噬可導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡；因此誘導(dǎo)細(xì)胞高水平自噬是卵巢癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)［10］。但另一方面，自噬對(duì)受損細(xì)胞器和DNA降解過程中的中間體可以為腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝提供底物，其能影響癌細(xì)胞的行為，包括在代謝惡劣環(huán)境條件下增強(qiáng)癌細(xì)胞生存、促進(jìn)侵襲性生長、促進(jìn)免疫逃逸和化療耐藥等。在卵巢癌中，癌細(xì)胞釋放炎癥因子激活腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)成纖維細(xì)胞、抑制免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤殺傷活性；基質(zhì)成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞釋放自噬衍生的代謝物和底物，通過自分泌和旁分泌途徑調(diào)節(jié)臨近癌細(xì)胞的自噬水平和癌細(xì)胞行為［11］。本研究顯示，饑餓引起卵巢癌細(xì)胞上調(diào)自噬。

3.2乳酸脫氫酶、癌細(xì)胞內(nèi)糖酵解活性和癌細(xì)胞行為的相關(guān)性

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一種高活性糖酵解途徑酶，屬于2-羥基酸氧化還原酶家族，其在氧化磷酸化向糖酵解的轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用。在丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的過程中，要發(fā)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（還原形式）（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化形式）（oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的再生，這對(duì)于正在進(jìn)行的糖酵解是必不可少的，LDH是這一再生過程的關(guān)鍵酶［12］。LDH是一種同源四聚體或異源四聚體分子，由兩個(gè)M亞基（肌肉）和兩個(gè)H亞基（心臟）組成。ldha基因編碼M亞基，LDHA基因編碼H亞基。M和H亞基組合形成LDH1～LDH5共五種同工酶［13］。LDHA在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。下調(diào)LDHA抑制卵巢癌細(xì)胞增殖［14］。LDHA抑制劑可增敏卵巢癌細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑的抗腫瘤活性［15］。miR-383通過靶向抑制LDHA的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和有氧糖酵解［16］。本研究顯示，饑餓上調(diào)了LDHA的表達(dá)，并促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

MMP2和MMP9是癌細(xì)胞侵襲、遷移和血管發(fā)生過程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)降解基質(zhì)成分，協(xié)助癌細(xì)胞從原位退出及進(jìn)入新的微環(huán)境。與癌旁組織相比，人類惡性卵巢癌組織中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑巨核細(xì)胞性白血病因子1（megakaryocytic leukemia 1，MKL1）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平升高，伴有MMP2表達(dá)水平也升高的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，MKL1是MMP2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在缺氧條件下負(fù)責(zé)促進(jìn)MMP2及其活化相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并賦予卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力［17］。LncRNA TP73-AS1通過上調(diào)MMP2和MMP9，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)移［18］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和生理過程中起重要作用。當(dāng)該通路受到Wnt配體的刺激時(shí)，β-catenin從其降解復(fù)合物中解離并易位到細(xì)胞核中，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，在子宮內(nèi)膜樣和黏液型上皮性卵巢癌中多有報(bào)道，并被證明在所有類型卵巢癌中促進(jìn)癌癥干細(xì)胞自我更新、轉(zhuǎn)移及化療耐藥［19］。Wnt/β-catenin是高級(jí)別漿液性低分化卵巢癌惡性轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號(hào)通路；性別決定區(qū)Y-盒轉(zhuǎn)錄因子9（SRY-box 9，SOX9）通過活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)一步促進(jìn)高級(jí)別漿液性卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)移［20］。本研究顯示，饑餓上調(diào)了磷酸化-β-catenin的水平并激活β-catenin。敲低β-catenin可下調(diào)LDHA的表達(dá)，并抑制乳酸生成。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)饑餓激活卵巢癌細(xì)胞自噬，并促進(jìn)其侵襲和遷移能力，增強(qiáng)糖酵解活性。與此同時(shí)，饑餓上調(diào)了LDHA的表達(dá)并磷酸化活化β-catenin信號(hào)，敲低β-catenin可下調(diào)LDHA的表達(dá)并抑制乳酸生成。本研究結(jié)果揭示了卵巢癌細(xì)胞自噬與糖代謝之間的聯(lián)系，可能為卵巢癌治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。

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［專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳］

［中文編輯：王 懿；英文編輯：李曉雪］

［收稿日期］2024-04-24

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金（81172458）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2024JC-ZDXM-52）

［作者簡介］陳良鳳（1981—），女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤及子宮內(nèi)膜異位癥的基礎(chǔ)研究。

［通訊作者］馬園園，副主任醫(yī)師。