糖基化榛仁蛋白對(duì)高內(nèi)相乳液穩(wěn)定性的影響

摘要：多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，從而影響其溶解性和乳化性能。該研究通過(guò)將低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS）與平歐榛仁分離蛋白（hazelnut protein isolate，HPI）進(jìn)行糖基化改良，以提高榛仁蛋白的乳化效果，并以該糖基化產(chǎn)物（HPI-XOS）作為乳化劑，在較高的油相體積分?jǐn)?shù)下成功制備了穩(wěn)定的高內(nèi)相乳液（high internal phase emulsions，HIPEs）。結(jié)果顯示，與HPI相比，經(jīng)糖基化處理的HPI-XOS空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。同時(shí)，這種糖基化產(chǎn)物的乳化性能和乳化穩(wěn)定性明顯提升，尤其是在HPI-XOS-1.5 h，分別提高了18.58%和37.1%。此外，在不同油相體積分?jǐn)?shù)下以HPI和HPI-XOS作為乳化劑制備HIPEs時(shí)發(fā)現(xiàn)HPI-XOS所形成的HIPEs具有更高的表觀黏度和離心穩(wěn)定性。該研究為改善榛仁蛋白質(zhì)的乳化特性提供了一種新思路，并拓寬了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。

關(guān)鍵詞：平歐榛仁；低聚木糖；糖基化；高內(nèi)相乳液

中圖分類號(hào)：TS201.21""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""""文章編號(hào)：1000-9973（2025）02-0030-07

Effect of Glycosylated Hazelnut Protein on Stability of

High Internal Phase Emulsion

YOU Yuan-hui¹， WANG Jia-rong¹， ZHANG Ran-ran¹， ZHAO Yu-hong^1，2*

（1.School of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China; 2.Key Laboratory

of Forest Food Resources Utilization in Heilongjiang Province， Harbin 150040， China）

Abstract： The glycosylation reaction between polysaccharides and proteins can lead to the changes in protein structure， thus affecting its solubility and emulsifying properties. In this study， xylooligosaccharide （XOS） is glycosylated with Flat-European hazelnut protein isolate （HPI） to improve the emulsifying effect of hazelnut protein. The glycosylated product （HPI-XOS） is used as an emulsifier to successfully prepare stable high internal phase emulsions （HIPEs） at a high oil phase volume fraction. The results show that compared with HPI， the spatial structure of HPI-XOS changes after glycosylation. At the same time， the "emulsifying properties and emulsion stability of the glycosylated products significantly improve， especially in HPI-XOS-1.5 h， which increases by 18.58% and 37.1% respectively （Plt;0.05）. In addition， it is found that HIPEs formed by HPI-XOS has higher apparent viscosity and centrifugal stability when HPI and HPI-XOS are used as the emulsifiers to prepare HIPEs at different oil phase volume fractions. This study has provided a new idea for improving the emulsifying properties of hazelnut protein and broadening its application scope in the food industry.

Key words： Flat-European hazelnut; xylooligosaccharides; glycosylation; high internal phase emulsion

蛋黃醬作為生活中常見的食品調(diào)味醬，是一種水包油型高內(nèi)相乳液。高內(nèi)相乳液（HIPEs）是指內(nèi)相體積分?jǐn)?shù)大于74%的高濃縮乳液體系，其中液滴緊密堆積在一起，形成具有黏彈性的凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而賦予乳液半固體的質(zhì)地特性^[1]。目前，利用植物蛋白部分或全部替代動(dòng)物蛋白制作具有類似蛋黃醬結(jié)構(gòu)的HIPEs是熱門課題之一^[2]。平歐榛子（Corylus heterophylla×Corylus avellana）由平榛（Corylus heterophylla Fisch.ex Trautv.）和歐榛（Corylus avellana Linn.）雜交而成，其脫脂榛仁粕中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%～41%，可作為開發(fā)新型植物蛋白質(zhì)產(chǎn)品的良好來(lái)源^[3-4]。然而，其低溶解度和乳化性能限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

糖基化是一種有效的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾方法，該反應(yīng)由還原糖羰基和蛋白質(zhì)氨基共價(jià)結(jié)合生成蛋白-多糖偶聯(lián)物，從而改變蛋白質(zhì)的功能特性，并賦予食物特殊的感官品質(zhì)，如味道和顏色^[5]。劉琳琳等^[6]研究表明，經(jīng)糖基化反應(yīng)后的大豆分離蛋白具有更佳的乳化性和乳化穩(wěn)定性。糖基化反應(yīng)可分為干熱法和濕熱法兩種類型。干熱法需要長(zhǎng)時(shí)間的高溫反應(yīng)，導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的不可控生成，很難適用于工業(yè)生產(chǎn)^[7]。Boonlao等^[8]研究表明，由于反應(yīng)物的接觸面積不足，干熱法需要3 d或更長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到與1 h的濕熱反應(yīng)相似的結(jié)果。濕熱法糖基化操作簡(jiǎn)單快捷、綠色健康，在食品加工中被廣泛應(yīng)用。低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS）是一種能維護(hù)腸道健康的功能性低聚糖，熱量極低且可調(diào)節(jié)血糖水平^[9]，在保健食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Delahaije等^[10]研究表明，多糖修飾的蛋白比單糖修飾的蛋白乳化性更好。此外，多糖與單糖和雙糖相比，具有較高的空間抗性，具有較低的后續(xù)美拉德反應(yīng)性，可進(jìn)一步防止過(guò)度的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的安全問(wèn)題^[11]。

本研究采用濕熱法制備HPI和XOS的糖基化產(chǎn)物，探討了糖基化反應(yīng)對(duì)榛仁蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響，并以最佳反應(yīng)時(shí)間的糖基化產(chǎn)物為乳化劑制備穩(wěn)定的高內(nèi)相乳液。本研究為提高榛仁蛋白乳化性提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為開發(fā)新型植物蛋白基高油相食品提供了新思路，擴(kuò)大了榛仁蛋白在調(diào)味品行業(yè)中的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步提高了平歐榛仁粕的利用價(jià)值。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

平歐榛仁粕：黑龍江宏泰松果有限公司；低聚木糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）、石油醚、四硼酸鈉、丙烯酰胺、鄰苯二甲醛、巰基乙醇、冰乙酸、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250：上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸：北京索萊寶生物科技有限公司；甲醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2"儀器與設(shè)備

LC-LX-H185C型高速離心機(jī)"上海力辰儀器科技有限公司；YTLG-10型冷凍干燥機(jī)"上海葉拓科技有限公司；FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀"天津港東科技發(fā)展股份有限公司；LS-55型熒光光譜儀"美國(guó)Perkin Elmer公司；Nano-ZS90納米激光粒度和電位分析儀"英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3"試驗(yàn)方法

1.3.1"HPI的提取

將榛仁粕過(guò)40目篩，采用索氏抽提法去除油脂得到脫脂榛仁粕。按脫脂榛仁粕∶水為1∶10的比例混勻，得到脫脂榛仁粕漿。用NaOH溶液將脫脂榛仁粕漿的pH調(diào)至9.5，攪拌1 h后離心取上清液。再用鹽酸溶液將得到的上清液的pH調(diào)至4.5，充分?jǐn)嚢? h后離心，取下層沉淀物。用蒸餾水將沉淀物再次溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，-20 ℃冷凍，凍干后得到HPI。

1.3.2"榛仁蛋白糖基化產(chǎn)物的制備

制備質(zhì)量濃度為10 mg/mL的HPI溶液，均勻溶解后置于4 ℃冰箱中過(guò)夜使其充分水合。按照HPI∶XOS為1∶2加入XOS，攪拌2 h后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為10，然后在90 ℃的水浴中分別加熱0～2 h。在冰水浴中快速冷卻，放置在4 ℃冰箱中過(guò)夜，離心后取上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到不同加熱時(shí)間的糖基化產(chǎn)物。

1.3.3"糖基化產(chǎn)物接枝度的測(cè)定

參照Yang等^[12]的方法采用鄰苯二甲醛法測(cè)定游離氨基含量，將80 mg OPA溶于2 mL甲醇中，再加入50 mL 10 mmol/L四硼酸鈉、5 mL 20% SDS和200 μL β-巰基乙醇混合后，用蒸餾水定容至100 mL。取200 μL樣品溶液加入到4 mL以上混合試劑中，在35 ℃下加熱2 min后在340 nm處測(cè)定吸光度。接枝度（DG）按照公式（1）計(jì)算：

DG（%）=A₀-A_tA₀×100%。（1）

式中：A₀為HPI在340 nm處的吸光度；A_t為不同反應(yīng)時(shí)間下偶聯(lián)物在340 nm處的吸光度。

1.3.4"傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

參照J(rèn)iang等^[11]的方法，將樣品與適量溴化鉀研磨均勻后，用壓片機(jī)壓成薄片。用紅外光譜儀在波長(zhǎng)400～4 000 cm^-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描32次，分辨率為4 cm^-1，每次掃描前扣除背景。

1.3.5"熒光光譜測(cè)定

參照Wang等^[13]的方法，配制0.1 mg/mL樣品溶液，采用熒光光譜儀測(cè)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，掃描速度為1 200 nm/min。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm。

1.3.6"乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參照Z(yǔ)heng等^[14]的方法，以SDS溶液為空白對(duì)照，取50 μL乳液與5 mL 0.01 g/mL的SDS溶液混合。在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A₀，10 min后測(cè)定吸光度A₁₀，根據(jù)公式（2）和公式（3）計(jì)算EAI和ESI：

EAI（m²/g）=2×2.303×A₀φ×m_Pr。（2）

ESI（g/mL）=A₀A₀-A₁₀×Δt。 （3）

式中：m_Pr為蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)，0.1；Δt為兩次試驗(yàn)之間的時(shí)間間隔（min）；A₀和A₁₀分別為0 min和10 min時(shí)的吸光度。

1.3.7"高內(nèi)相乳液的制備

將6 g HPI和HPI-XOS-1.5 h分別溶于100 mL的去離子水中，充分?jǐn)嚢? h后，置于冰箱中冷藏過(guò)夜，使蛋白質(zhì)充分水合。取出后分別在油相體積分?jǐn)?shù)為74%～82%條件下用高剪切乳化機(jī)于10 000 r/min的條件下剪切1 min，得到高內(nèi)相乳液，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8"HIPEs外觀和微觀結(jié)構(gòu)表征

取少量新鮮制備的高內(nèi)相乳液分別置于玻璃瓶中，拍照觀察其表觀形態(tài)，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.9"HIPEs粒徑測(cè)定

將乳液滴于去離子水中，使用納米激光粒度和電位分析儀測(cè)定粒徑。具體參數(shù)設(shè)置：分散介質(zhì)為水，顆粒折射率為1.46，分散介質(zhì)折射率為1.33，上樣體積為1 mL，溫度平衡時(shí)間為2 min。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.10"HIPEs流變學(xué)測(cè)定

參照Kan等^[15]的方法，用流變儀測(cè)定不同油相體積分?jǐn)?shù)HIPEs的流變性能。先將流變儀進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，安裝40 nm夾具后再次校準(zhǔn)，加樣后除去多余的樣品。所有流變特性的測(cè)定均在25 ℃下進(jìn)行，表觀黏度變化試驗(yàn)是在0.1～100 s^-1的剪切速率范圍內(nèi)進(jìn)行的，掃描頻率為0.1～10 Hz，應(yīng)力固定為0.5%。

1.3.11"HIPEs離心穩(wěn)定性測(cè)定

將5 mL HIPEs置于10 mL離心管中，用游標(biāo)卡尺測(cè)量乳液的高度，記為H_T，稱量離心管和乳液的總質(zhì)量，記為M₁。離心（8 000 r/min）5 min后，測(cè)定下清液的高度，記為H_S，將上層大豆油吸出，再次稱重得到總質(zhì)量M₂。乳液的乳析指數(shù)（CI）和上層析出的大豆油質(zhì)量（M）分別按照公式（4）和公式（5）計(jì)算：

CI（%）=H_SH_T×100%。（4）

M（mg）=M₁-M₂。（5）

1.4"數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan顯著性分析，Plt;0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2"結(jié)果與分析

2.1"糖基化產(chǎn)物接枝度分析

蛋白質(zhì)的游離氨基與糖鏈的羰基發(fā)生羰氨縮合反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)上的游離氨基含量減少。消耗的游離氨基越多，接枝程度越高。由圖1可知，蛋白質(zhì)的接枝度呈先增大后減小的趨勢(shì)，與林澤鉗等^[16]的研究結(jié)果一致。經(jīng)糖基化反應(yīng)后接枝度顯著增加至32.44%（Plt;0.05），但在1.5 h后略有下降。由于在糖基化反應(yīng)初期，HPI與XOS受熱后開始結(jié)合，消耗的游離氨基增多，致使接枝度升高，但繼續(xù)加熱后會(huì)破壞HPI中的部分賴氨酸，使HPI結(jié)構(gòu)充分松散，增強(qiáng)了蛋白分子之間的相互作用，使蛋白質(zhì)聚集^[17]，不利于HPI與XOS共價(jià)接技反應(yīng)的進(jìn)行，反而導(dǎo)致游離氨基含量升高，接枝度降低。因此，適當(dāng)?shù)乜刂萍訜釙r(shí)間是必要的。

2.2"傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜法能夠反映蛋白質(zhì)中各種化學(xué)基團(tuán)和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，進(jìn)而表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化明顯高于HPI和HPI-XOS-0 h。由圖2中a可知，由于游離羥基振動(dòng)吸收，加入多糖的樣品組在3 700～3 000 cm^-1處與單一的蛋白組相比都表現(xiàn)出更寬的伸縮振動(dòng)峰^[18]。在1 180～950 cm^-1處，加入多糖的樣品組均出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的峰，這是XOS的C—H彎曲和C—C/CO伸縮導(dǎo)致的。糖基化產(chǎn)物在1 530 cm^-1處的吸收強(qiáng)度低于HPI和HPI-XOS-0 h，證實(shí)糖基化導(dǎo)致游離氨基損失，與之前的接枝度試驗(yàn)結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲的含量變化，對(duì)蛋白質(zhì)特征吸收譜帶中的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步對(duì)糖基化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化進(jìn)行研究。由圖2中b可知，與未改性HPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量相比，糖基化榛仁蛋白中α-螺旋、β-折疊含量隨著反應(yīng)時(shí)間的增加均略有減少，無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量增加，這是因?yàn)閰⑴c美拉德反應(yīng)的氨基位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的α-螺旋區(qū)域。在正常狀態(tài)下，有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)被埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)，這種結(jié)構(gòu)的減少證實(shí)了空間構(gòu)象發(fā)生變化。β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的變化趨勢(shì)顯示了更松散的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)^[19]。Zang等^[20]研究認(rèn)為，提高無(wú)規(guī)則卷曲水平有助于提高蛋白質(zhì)的溶解度和乳化性能，使其更容易被吸附到油滴的表面。這些構(gòu)象變化表明蛋白質(zhì)肽鏈展開，產(chǎn)物的柔韌性增強(qiáng)，乳化效果也因此得到改善，這與后續(xù)乳化性和乳化穩(wěn)定性的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.3"熒光光譜分析

當(dāng)色氨酸的疏水或親水環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長(zhǎng)也會(huì)隨之發(fā)生變化^[21]。因此，可以用來(lái)表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。由圖3可知，HPI經(jīng)糖基化改性后，熒光強(qiáng)度均顯著降低并伴隨著紅移，從329 nm移至332 nm，表明與XOS的共價(jià)反應(yīng)阻斷了色氨酸殘基的熒光信號(hào)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光淬滅^[22]，熒光強(qiáng)度下降。熒光光譜中最大吸收波長(zhǎng)（λ_max）與色氨酸殘基所處的微環(huán)境有關(guān)，λ_max越大表明色氨酸殘基的微環(huán)境極性越強(qiáng)。糖基化產(chǎn)物λ_max發(fā)生紅移說(shuō)明糖基化反應(yīng)使蛋白質(zhì)暴露出更多的發(fā)色基團(tuán)，結(jié)構(gòu)更加松散，親水能力增強(qiáng)，從而更有利于溶解、乳化等功能性質(zhì)的發(fā)揮。此外，HPI-XOS-0 h的熒光強(qiáng)度略高于HPI，這是因?yàn)槎嗵堑募尤雽?dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輕微開放，暴露了位于內(nèi)部的少量色氨酸，這與Hong等^[23]的研究結(jié)果一致。

2.4"乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

EAI和ESI是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)乳化劑乳化性能的兩個(gè)常見指標(biāo)，可以反映蛋白質(zhì)形成和穩(wěn)定乳化體系的能力，可用于衡量蛋白質(zhì)的乳化性^[24]。與預(yù)期的結(jié)果一樣，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈先增大后減小的趨勢(shì)。其中，HPI-XOS-1.5 h組的EAI和ESI較HPI組有明顯改善，分別增加了18.58%、37.1%，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和親水多糖之間的相互作用提高了蛋白質(zhì)的溶解度，進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)在水溶液中的有效濃度和遷移率。此外，蛋白與多糖形成的共軛分子增加了體系的黏度，并在油滴周圍形成較厚的大分子屏障，從而保護(hù)油滴不受空間排斥力的聚集和聚結(jié)^[25]。

2.5"HIPEs外觀和微觀結(jié)構(gòu)分析

HIPEs較高的油相體積分?jǐn)?shù)和適量的乳化劑導(dǎo)致液滴緊密地?cái)D在一起，可形成黏彈性的半固體狀態(tài)，具有較高的穩(wěn)定性^[1]。由圖5可知，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到78%時(shí)，HPI穩(wěn)定的HIPEs雖然呈倒置不下滑的凝膠狀態(tài)，但已經(jīng)開始出現(xiàn)漏油現(xiàn)象。繼續(xù)增加油相體積分?jǐn)?shù)，HPI無(wú)法穩(wěn)定HIPEs，呈流動(dòng)狀態(tài)。而HPI-XOS-1.5 h可穩(wěn)定更高油相體積分?jǐn)?shù)的HIPEs。榛仁蛋白經(jīng)糖基化處理后，由原本卷曲折疊的結(jié)構(gòu)變得舒展，使更多的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，吸附在油滴表面，增強(qiáng)了乳液的穩(wěn)定性。

視覺(jué)上觀察HIPEs的外觀差異并不明顯，因而通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。從各組HIPEs的微觀結(jié)構(gòu)圖中可以直觀地看出，HPI-XOS-1.5 h制備的HIPEs液滴直徑普遍更小。由于HPI與XOS發(fā)生糖基化反應(yīng)后，蛋白溶解度增強(qiáng)，更多的顆粒能在油滴表面更加緊密地排列，阻礙了油滴的絮凝。在油相體積分?jǐn)?shù)為74%時(shí)，HIPEs油滴多呈天然的油滴圓形形態(tài)。增大加油量后，使油滴之間發(fā)生彈性擠壓，縮小了間距，油滴形態(tài)由圓形逐漸變?yōu)槎噙呅谓Y(jié)構(gòu)。更為緊密的油滴排布使HIPEs具有更強(qiáng)的凝膠性，不易發(fā)生相對(duì)滑動(dòng)，乳液更加穩(wěn)定。然而，若繼續(xù)增大加油量，蛋白將無(wú)法完全覆蓋在油滴表面，內(nèi)部的油滴會(huì)逐漸發(fā)生相融聚集，導(dǎo)致大尺寸的油滴形成，造成水油分離而無(wú)法形成高內(nèi)相乳液。

2.6"HIPEs粒徑分析

粒徑是鑒定乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，隨著粒徑的減小，乳液穩(wěn)定性增加。由圖6可知，油相體積分?jǐn)?shù)增大，HPI組制備的HIPEs粒徑及PDI值也隨之增大，表明乳液中大尺寸油滴增多且大小分布不均，導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定。而HPI-XOS-1.5 h穩(wěn)定的HIPEs粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，這可能是由于隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，自由度降低的油滴更緊密地聚集在一起，吸附在油水界面的顆粒相互作用增強(qiáng)，抑制聚結(jié)，降低了油滴的平均尺寸。在油相體積分?jǐn)?shù)小于82%時(shí)，PDI值均小于0.4，說(shuō)明液滴的尺寸分布相對(duì)較窄，液滴大小相近。在所有樣品中，78%油相體積分?jǐn)?shù)HIPEs的PDI值最小，其液滴分散最均勻，乳液體系最穩(wěn)定。隨著油相體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，油滴在連續(xù)相中過(guò)于擁擠，界面張力降低。蛋白濃度不足以錨定在更大的界面上，無(wú)法穩(wěn)定額外的油滴，從而形成了大尺寸的液滴。

與HPI穩(wěn)定的HIPEs相比，HPI-XOS穩(wěn)定的HIPEs液滴粒徑更小，與之前觀察到的乳液微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。HPI-XOS的溶解性高于HPI，能夠更好地分散在油水界面。更多的小粒徑顆粒會(huì)在油滴表面形成一層穩(wěn)定的物理屏障，防止油滴互相交融聚集，這與吳爽等^[17]的研究結(jié)果一致，糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的HPIEs具有較小的液滴粒徑和更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.7"HIPEs流變特性分析

流變特性是影響乳液加工利用的重要因素。表觀黏度見圖7中a和b，乳液的表觀黏度隨著剪切速率的增大而下降，是一種假塑性行為。在相同油相體積分?jǐn)?shù)下，HPI-XOS-1.5 h穩(wěn)定的HIPEs具有更高的表觀黏度，這主要是由于蛋白經(jīng)糖基化反應(yīng)后結(jié)構(gòu)逐漸展開，增強(qiáng)了分子鏈之間的纏繞作用，阻礙了乳液的流動(dòng)。

由圖7中c和d可知，在頻率掃描測(cè)試中，所有HIPEs的G′幾乎比G″大一個(gè)數(shù)量級(jí)，且HPI-XOS-1.5 h穩(wěn)定的HIPEs的G′和G″遠(yuǎn)高于HPI組，形成了更強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，糖基化反應(yīng)導(dǎo)致HIPEs的粒徑減小，較小的粒徑使得液滴分布更緊密，抗變形能力更強(qiáng)，有助于獲得更高的凝膠強(qiáng)度和黏度^[26]。

2.8"高內(nèi)相乳液離心穩(wěn)定性分析

乳液經(jīng)過(guò)離心后，油相和水相的分離可能導(dǎo)致乳狀液分為三層：頂層（油相）、中間層（乳化層）、和底層（水相）^[27]。由表1可知，在相同的油相體積分?jǐn)?shù)下，HPI-XOS-1.5 h穩(wěn)定的HIPEs的乳析指數(shù)均小于HPI組，且沒(méi)有油相析出。一方面，HPI-XOS-1.5 h吸附層厚度大于HPI，其穩(wěn)定的HIPEs具有更高的黏度和凝膠性，限制了液滴的運(yùn)動(dòng)，提高了抵抗離心作用力的能力。另一方面，由于HPI的粒徑較大，其在水相中的擴(kuò)散速度慢，無(wú)法更多地吸附在油滴表面，只能形成薄且弱的界面膜。施加離心作用力后，乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，界面膜發(fā)生大面積破裂，致使油滴析出。因此，HPI經(jīng)過(guò)糖基化處理可以提高其穩(wěn)定的HIPEs的離心穩(wěn)定性，與Kan等^[15]的研究結(jié)果一致。

3"結(jié)論

通過(guò)濕熱法使HPI和XOS發(fā)生糖基化反應(yīng)，對(duì)HPI修飾改性。XOS的加入改變了HPI的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，同時(shí)顯著提高了HPI的乳化性。與HPI和XOS的物理混合物相比，糖基化反應(yīng)生成的共價(jià)鍵可以有效防止顆粒聚集，從而提高蛋白質(zhì)的乳化性能。相比于HPI，加熱時(shí)間為1.5 h時(shí)得到的糖基化產(chǎn)物具有更佳的乳化特性，能夠穩(wěn)定更高油相體積分?jǐn)?shù)的HIPEs。在油相體積分?jǐn)?shù)為78%時(shí)，HPI-XOS-1.5 h制備的HIPEs粒徑最小且分布均勻，并具有更高的離心穩(wěn)定性。本研究利用糖基化榛仁蛋白成功制備了穩(wěn)定的植物蛋白高內(nèi)相乳液，在代替動(dòng)物蛋白生產(chǎn)蛋黃醬的產(chǎn)品方面具備一定的開發(fā)潛力，促進(jìn)了平歐榛仁蛋白在調(diào)味品行業(yè)中的應(yīng)用和發(fā)展，為改善榛仁蛋白的乳化性開辟了一條新途徑。

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