黃病毒E蛋白N-糖基化研究進(jìn)展

潘昱婷，賈仁勇,3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心，四川成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川成都611130；3.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130)

糖基化是蛋白質(zhì)一種重要的翻譯后修飾調(diào)控機(jī)制。在真核細(xì)胞中，糖基化的合成主要包括：N糖基化、O 糖基化及糖基磷脂酰肌醇錨3 種途徑。新生肽鏈合成時(shí)或合成后，糖鏈與肽鏈中特定序列(Asn-X-Thr/Ser，其中X 為除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰胺(N)相連接，所以將該糖基化類型稱為N 連接糖鏈，又稱N糖基化[1]。在真核細(xì)胞中，N糖基化的合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中完成，糖蛋白中N 連接聚糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將預(yù)先生成的寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)至新生肽鏈的天冬酰胺殘基中，再將其轉(zhuǎn)移至高爾基體內(nèi)進(jìn)一步修飾，并在高爾基體糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成3 種類型的N 連接糖鏈：高甘露糖型(High mannose type)、雜合型(Hybrid type)及復(fù)合型(Complex type)(圖1)。

圖1 N- 糖基化的合成途徑

黃病毒(Flavivirus)是主要由節(jié)肢動(dòng)物傳播的一類單股正鏈RNA 病毒[1]，其基因組編碼3 種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白(Capsid protein，C)、膜蛋白前體/ 膜蛋白(Precursor membrane/Membrane protein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope protein，E)，其中包膜蛋白(即E蛋白)是病毒侵染過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，它能夠被細(xì)胞表面受體識(shí)別，介導(dǎo)病毒的吸附與侵入，并參與病毒同質(zhì)膜的融合[2]。黃病毒E蛋白大多數(shù)屬于糖蛋白，含一個(gè)或多個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)，位點(diǎn)的數(shù)量和位置也存在差異，如蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus， TBEV)[3]、 登革熱病毒(Dengue virus，DENV)[4]、西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)[5]、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)[6]、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)[7]和坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)[8]等，在E蛋白aa153～aa156 位殘基處存在潛在的N糖基。

1 黃病毒E蛋白N糖基化的功能

E蛋白是黃病毒生命周期中的重要物質(zhì)，其N糖基化在病毒復(fù)制、增殖、釋放等過(guò)程中發(fā)揮重要作用(表1)。

1.1 E蛋白N糖基化影響黃病毒的復(fù)制 E蛋白N糖基化對(duì)黃病毒在哺乳動(dòng)物和蚊子細(xì)胞系中進(jìn)行有效復(fù)制是非常必要的。研究表明DENV (16681 株)E蛋白aa67 處N糖基化位點(diǎn)缺失后嚴(yán)重影響病毒復(fù)制，使其無(wú)法產(chǎn)生新的感染性病毒，并嚴(yán)重影響其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的增殖；而aa153 處N糖基化位點(diǎn)缺陷的突變病毒仍然可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，表明DENV E蛋白aa153 處N糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒復(fù)制是非必需的，而aa67 處N糖基化位點(diǎn)對(duì)DENV 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制和增殖是必需的[10]。當(dāng)WNV E蛋白N糖基化缺失后，病毒組裝能力變?nèi)?，蛋白折疊效率顯著降低，表明N糖基化在促進(jìn)病毒蛋白折疊中發(fā)揮重要作用[17]。Zai 等將JEV (P3 株)E蛋白N糖基化的突變株與野生型病毒相比較，結(jié)果顯示JEV E蛋白N糖基化的缺失同樣降低了E蛋白的折疊效率[14]。

此外，研究者發(fā)現(xiàn)抑制E蛋白N糖基化的形成還將導(dǎo)致E蛋白分泌量顯著降低，這意味著E蛋白N糖基化嚴(yán)重影響黃病毒感染細(xì)胞后的釋放量[18]。在研究WNV E蛋白N糖基化時(shí)發(fā)現(xiàn)，其N糖基化有利于E蛋白更快速分泌[17]。Goto 等比較分析了TBEV (Oshima5 株，GenBank登錄號(hào)：AB062003)E蛋白在N糖基化缺失和未缺失的情況下導(dǎo)致E蛋白分泌水平、生物學(xué)特性等的變化，結(jié)果顯示，在E蛋白N糖基化缺陷的突變株中，E蛋白的分泌量降低至野生型病毒E蛋白分泌量的10 %，且當(dāng)E蛋白aa66 和aa153 處均具有N糖基化位點(diǎn)時(shí)，其分泌的E蛋白水平比野生型病毒分泌的蛋白水平高出4 倍[9]。對(duì)ZIKV 的研究也發(fā)現(xiàn)，E蛋白N糖基化對(duì)E蛋白的分泌也有相似影響，Mossenta 等揭示了ZIKV (MR766 株，Gen-Bank 登錄號(hào)：AEN75266.1)E蛋白N糖基化的缺失導(dǎo)致ZIKV E蛋白的分泌受損，推測(cè)缺失N糖基化的修飾致使E蛋白折疊受損進(jìn)而影響該蛋白的分泌[15]。這些數(shù)據(jù)均充分表明N糖基化在黃病毒E蛋白分泌過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

表1 黃病毒E蛋白N糖基化位點(diǎn)Table 1 N-glycosylation of the E protein in flaviviruses

1.2 E蛋白N糖基化影響黃病毒的感染性 黃病毒E蛋白N糖基化與病毒的感染性也密切相關(guān)，其中DENV 較為典型。DENV E蛋白中具有兩個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)，Mondotte 等發(fā)現(xiàn)DENV E蛋白中的兩處N糖基化功能有所差異，將E蛋白aa153 處N糖基化位點(diǎn)敲除后，DENV的感染性明顯降低；而敲除E蛋白aa67 處的N糖基化位點(diǎn)后，DENV 仍然可以感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和翻譯，但沒(méi)有產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，結(jié)果顯示該病毒E蛋白aa153 處N糖基化修飾與病毒的感染性密切相關(guān)[19]。而TBEV (Oshima5 株)E蛋白N糖基化的缺陷則可以影響病毒粒子的折疊及其穩(wěn)定性，盡管E蛋白的總體水平保持不變，但由于E蛋白缺乏N糖基化修飾，導(dǎo)致病毒顆粒的感染性降低[20]。類似現(xiàn)象在ZIKV 中也存在，即E蛋白N糖基化缺失后使ZIKV 對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的感染性降低[15]。與此相反，Hanna 等在研究WNV 時(shí)得出了與之不同的結(jié)果，他們將哺乳動(dòng)物、禽類和蚊子細(xì)胞分別感染Ⅰ型、Ⅱ型WNV 和敲除了E蛋白N糖基化位點(diǎn)的Ⅱ型WNV，結(jié)果顯示E蛋白N糖基化的敲除增強(qiáng)了病毒的感染性，且該現(xiàn)象在蚊子細(xì)胞中尤為顯著[17]，不同黃病毒E蛋白N糖基化功能試驗(yàn)結(jié)果存在差異。因此，E蛋白N糖基化對(duì)病毒感染力的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。

1.3 E蛋白N糖基化影響黃病毒的毒力 E蛋白作為黃病毒的主要抗原，與病毒的致病性密切相關(guān)。研究表明，WNV E蛋白N糖基化對(duì)病毒的致病性和病毒對(duì)小鼠的神經(jīng)侵襲力均具有重要作用[12]。據(jù)報(bào)道，近期歐洲與北美洲暴發(fā)的WNV 病是由毒力較強(qiáng)的病毒所致，而一些早期流行的WNV 分離株則毒力較低。隨后有研究顯示引起近期大規(guī)模疾病暴發(fā)的WNV (PaH651 株，GenBank 登錄號(hào)：AF001560；Heg101 株，GenBank 登錄號(hào)：AF001568)在其E蛋白中均具有N糖基化位點(diǎn)，而早期毒力較低的流行WNV 分離株(ArD78016 株，GenBank 登錄號(hào)：AF001556；EntM63134 株，GenBank 登錄號(hào)：AF001573)E蛋白中則無(wú)N糖基化位點(diǎn)[13]。Beasley 等將WNV 強(qiáng)毒株與弱毒株進(jìn)行比較，分析其E蛋白中氨基酸序列，顯示強(qiáng)毒株E蛋白氨基酸序列中具有導(dǎo)致N糖基化基序喪失的差異氨基酸，為了確定增強(qiáng)WNV 神經(jīng)侵襲力的分子決定簇，采取定點(diǎn)敲除了WNV (NY99 株，GenBank 登錄號(hào)：AF196835)的N糖基化位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)該突變病毒株神經(jīng)侵襲力衰減到與弱毒野生型病毒相當(dāng)?shù)乃?，從而證實(shí)了E蛋白N糖基化具有影響WNV 毒力的能力，該結(jié)論同Khaled 等試驗(yàn)結(jié)果一致[21]。此外，也有研究顯示TBEV (16681 株)E蛋白中N糖基化的缺失，可以降低病毒在猿猴與蚊子細(xì)胞中的病毒滴度，并且觀察到病毒缺失株對(duì)小鼠的神經(jīng)毒力也顯著降低[10]。

1.4 E蛋白N糖基化是影響DC-SIGN 與病毒互作的關(guān)鍵部位 樹突狀細(xì)胞- 特異性細(xì)胞間黏附分子-3 捕獲非整合素(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integri，DC-SIGN)為鈣依賴性C 型凝集素家族的成員，在病毒與樹突狀細(xì)胞相互作用之間起著重要作用[22]。該凝集素DC-SIGN 受體對(duì)不同病原體中的N糖基化均具有親和力，也是DENV 和WNV 的主要細(xì)胞受體[23]。研究顯示：DC-SIGN 與DENV 之間的相互作用發(fā)生在E蛋白的N糖基化處[24]，Navarro 等證實(shí)了DENV 可以通過(guò)E蛋白N糖基化與DC-SIGN 相互作用影響病毒的感染性，在E蛋白aa67 和aa153 殘基處具有N糖基化位點(diǎn)的DENV 比僅在E蛋白aa67 處含N糖基化位點(diǎn)的DNEV 能夠更加有效地與DC-SIGN 相互作用[11]。研究ZIKV 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E蛋白N糖基化可以通過(guò)與DC-SIGN 結(jié)合抑制下游免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而加速ZIKV 對(duì)機(jī)體的侵襲[25]。

2 黃病毒N糖基化的應(yīng)用

E蛋白N糖基化不但可以維持抗原構(gòu)象，屏蔽潛在的中和表位，而且還與病毒的感染性及毒力緊密相關(guān)，因此，可以利用N糖基化修飾研發(fā)新型黃病毒疫苗。Roby等制備了針對(duì)E蛋白aa154 處缺失N糖基化的昆津病毒(KUNV)疫苗，得到了較為理想的結(jié)果[26]。有學(xué)者構(gòu)建了含野生型JEVprME基因和突變型JEVprME基因的核酸疫苗，結(jié)果顯示：采用prME蛋白aa154 處N糖基化缺失的核酸疫苗免疫的小鼠能夠完全抵抗JEV 的攻擊，佐證了prME蛋白aa154 處N糖基化位點(diǎn)的缺失顯著增強(qiáng)了該核酸疫苗的免疫原性，隨后開展了該核酸疫苗對(duì)豬的免疫保護(hù)性的深入探究[27]。也有學(xué)者使用反向疫苗學(xué)方法，從黃病毒基因組中篩選出具有N糖基化的抗原基因作為候選疫苗，對(duì)該抗原基因進(jìn)行高通量克隆、蛋白表達(dá)，再對(duì)純化后的抗原進(jìn)行體內(nèi)外評(píng)價(jià)以期獲得能夠抵抗病毒的疫苗[28]。這些研究均表明了黃病毒E蛋白N糖基化對(duì)黃病毒新型疫苗的研發(fā)有著重要作用，但具體如何應(yīng)用N糖基化對(duì)E蛋白的影響來(lái)研制相關(guān)疫苗尚待探究。

有研究顯示在DENV 嚴(yán)重感染時(shí)，使用α- 糖苷酶類藥物可以抑制DENV 的復(fù)制，從而減少患者體內(nèi)的病毒載量，達(dá)到控制病情及防止病情惡化的作用，其機(jī)制主要是通過(guò)藥物抑制機(jī)體糖基化酶，從而抑制病毒蛋白糖基化，進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制[29]。葡萄糖苷酶抑制劑也可以用于抗病毒，該抑制劑可以阻礙病毒蛋白質(zhì)的糖基化過(guò)程，并降低病毒與CD4+T 細(xì)胞的結(jié)合能力，在抗病毒藥物研發(fā)方面有著廣泛的前景[30]。有研究指出具有N糖基化的DENV 感染可以被某些碳水化合物結(jié)合劑(Carbohydratebinding agents，CBAs)有效阻斷，該CBAs 可以通過(guò)與DENV E蛋白N糖基化的結(jié)合，阻礙DC-SIGN 介導(dǎo)的病毒向T 淋巴細(xì)胞傳播而直接抑制病毒感染，起到抗病毒效果[31]。更有通過(guò)針對(duì)抗體藥物N糖基化結(jié)構(gòu)進(jìn)行糖工程改造制備糖鏈優(yōu)化的抗體藥物，該藥物可以進(jìn)一步提高抗體藥物療效，并優(yōu)化藥物穩(wěn)定性，這是單克隆抗體藥物的研發(fā)新思路。

3 展 望

近年來(lái)關(guān)于黃病毒E蛋白N糖基化對(duì)病毒生命周期影響的研究越來(lái)越多，黃病毒依賴E蛋白N糖基化實(shí)現(xiàn)病毒侵入宿主細(xì)胞、病毒復(fù)制和病毒釋放等功能，還與病毒毒力、感染性密切相關(guān)。雖然已經(jīng)對(duì)黃病毒E蛋白N糖基化進(jìn)行了大量的探究，其理論已被逐步應(yīng)用于抗病毒新型疫苗及相關(guān)藥物的研發(fā)，但黃病毒E蛋白N糖基化的功能及其作用機(jī)制尚不十分清晰，藥物研發(fā)與應(yīng)用尚需深入研究。