皰疹病毒UL11基因及其編碼蛋白的研究進展

陽林江，汪銘書，程安春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/ 預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/ 禽病防治研究中心，四川成都 611130；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都 611130)

皰疹病毒在自然界分布廣泛，可以感染兩棲類、禽類、哺乳類，也能感染靈長類和人類。多數(shù)皰疹病毒感染后可以引起機體不同程度的臨床癥狀和病理變化，如血管損傷、組織出血、消化道黏膜丘疹樣病變、淋巴器官和實質(zhì)器官的變性[1-2]；但也有感染后無臨床癥狀和病理變化的，如成年豬感染偽狂犬病毒為隱性感染[3]。皰疹病毒感染典型的流行病學(xué)特征是能夠建立潛伏感染，感染或康復(fù)者長期攜帶病毒。因感染的人或動物會成為無癥狀的攜帶者，其僅在子代病毒間歇性地通過出芽、胞吐或誘導(dǎo)細胞凋亡而離開宿主細胞被釋放時才能檢測到，這使得皰疹病毒難以監(jiān)測和控制[4]。

根據(jù)病毒的理化性質(zhì)，皰疹病毒科可以分為α、β、γ 3 個亞科[5]。α 皰疹病毒主要包括人單純皰疹病毒1 型(Herpes simplex virus，HSV-1)、水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus， VZV)、 偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、馬皰疹病毒1 型(Equine herpesvirus 1，EHV-10 和鴨瘟病毒(Duck plague virus，DPV)等；β 皰疹病毒主要包括巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，如人CMV，即人皰疹病毒5 型(Human herpesvirus 5，HHV-5)等；γ 皰疹病毒如愛潑斯坦－巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，即人皰疹病毒4 型(Human herpesvirus 4，HHV-4)等。皰疹病毒體積較大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，基因組為雙鏈DNA，其基因編碼的蛋白中約有30 多種為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，分別凝聚形成核心、衣殼、皮層以及囊膜[6]。皮層填充于衣殼與囊膜間，但目前很多皮層蛋白的準(zhǔn)確功能還不是十分清楚[7-9]，其極有可能在病毒復(fù)制時具有雙重功能即參與病毒的初期感染和后期組裝，調(diào)控病毒的侵入、基因表達和免疫逃逸[10]。

UL11 基因編碼的皮層蛋白pUL11 對病毒粒子進入細胞、裝配、囊膜化、釋放等方面均具有重要作用。本文就UL11 基因及其編碼蛋白pUL11 的特點、結(jié)構(gòu)、定位以及相關(guān)功能等方面做一簡要綜述，以期為皰疹病毒及UL11基因的深入研究提供參考。

1 皰疹病毒UL11 基因及其編碼蛋白的特點

1.1 UL11 基因序列的特點 皰疹病毒的基因組由一獨特長區(qū)(UL)和一獨特短區(qū)(US)構(gòu)成，包繞于UL 和US 兩側(cè)的為反向重復(fù)序列。不同皰疹病毒的UL11 基因在基因組中的位置及基因大小有差異，如：HSV-1 UL11 基因的開放閱讀框(ORF)大小為288 bp[11]；EHV-1 UL11 由ORF51開放閱讀框編碼，大小為225 bp[12]；DPV 的UL11 基因位于基因組的100 220 bp～100 483 bp，全長為264 bp[13]；HCMV 的UL11 基因位于基因組的18 268 bp～19 119 bp，全長為852 bp[14]。大多數(shù)UL11 基因位于UL 區(qū)的UL10與UL12 之間，其編碼序列與UL12 基因的部分閱讀框重疊[15]；但也有不重疊的，如HHV-5 的UL11 基因不與UL12 重疊[14]。在所有高等脊椎動物皰疹病毒中均有UL11或同源基因，如EBV 中的BBLF1 即為UL11 的同源基因[16]。部分代表性皰疹病毒的UL11 ORF 在基因組中的定位及其與UL12 的關(guān)系見圖1。

1.2 UL11 基因編碼蛋白質(zhì)的特點 皰疹病毒UL11 基因的編碼蛋白pUL11 是一種小的外周結(jié)合膜蛋白。雖然不同皰疹病毒pUL11 的氨基酸序列同源性通常較低，但所有皰疹病毒pUL11 同系物的N 末端含有預(yù)測的N- 肉豆蔻?；盘栆约翱捎米髯貦磅；|(zhì)的一個或幾個連續(xù)的半胱氨酸殘基，pUL11 通過N- 末端肉豆蔻酸酯和鄰近的棕櫚酸酯部分結(jié)合宿主膜的細胞質(zhì)面或病毒囊膜的內(nèi)面[17]；C 端在不同皰疹病毒的功能尚未確定，Han 等的研究顯示，HSV-1 pUL11 的非保守C 末端具有與gE 的細胞質(zhì)尾結(jié)合的功能[18](圖2)。

圖1 部分代表性的皰疹病毒UL11 開放閱讀框及其與UL12 的關(guān)系

Leege 等的研究表明，HSV-1 pUL11 高爾基體靶向作用參與了蛋白質(zhì)的分類、包裝及輸出，“晚期”蛋白質(zhì)修飾，保證蛋白與脂質(zhì)的單向轉(zhuǎn)運，因此推測pUL11 可能與感染細胞的膜相關(guān)[19]。

皰疹病毒pUL11 含有與肉豆蔻酸和棕櫚酸兩種脂肪酸共價修飾的氨基酸基序，這種雙重修飾的蛋白質(zhì)通常能與抗去垢劑膜(Detergent-resistant membranes，DRMs)相結(jié)合，DRMs 是細胞膜中富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架組織和病原體進入和退出等功能重要的“平臺”。Baird 等研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1 pUL11 中亮氨酸- 異亮氨酸和酸性簇氨基酸基序控制pUL11 分子與DRMs 的結(jié)合[20](圖2)。pUL11 作為一種膜相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，需要用肉豆蔻酸酯和棕櫚酸酯進行?；糜谀そY(jié)合、脂笩運輸和病毒的積聚[21]。人類免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)Gag需要通過肉豆蔻酰化來生產(chǎn)病毒，因此推測UL11 的?；瘜τ诎捳畈《居行У牟《玖Ｗ由a(chǎn)是必需的。

Western blot 檢測表明，傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)在感染雞胚腎細胞(CEK)后3 h、6 h 和9 h 檢測到低水平的pUL11，說明pUL11在病毒感染的晚期才表達[22]。

圖2 UL11 結(jié)構(gòu)域簡圖及其與抗去垢劑膜的關(guān)系

1.2.1 UL11 基因編碼蛋白在感染細胞中的定位皰疹病毒UL11 基因編碼蛋白在感染細胞中定位于細胞的各種膜結(jié)構(gòu)中，如細胞膜、胞漿中含膜結(jié)構(gòu)的細胞器。Kopp 等通過免疫熒光試驗和共聚焦激光掃描發(fā)現(xiàn)，在PRV 感染的兔腎細胞(RK13)中，pUL11 特異性熒光主要在細胞質(zhì)的高爾基體以及細胞膜中，但不具通透性的細胞上未檢測到pUL11 特異性熒光，表明pUL11 定位于細胞膜的內(nèi)表面[17]；Yeh-PC 等研究表明，HSV-1 感染細胞后，pUL11 錨定在細胞膜的細胞質(zhì)側(cè)[23]；Badr 等將EHV-1 Ab4p 株感染胎馬腎細胞(FHK-Tcl3.1)和RK13 細胞，通過間接免疫熒光(IFA)發(fā)現(xiàn)，pUL11 主要集中在[12]高爾基體；在β 皰疹病毒中，Gabaev 等將表達人CMV UL11 的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)上皮細胞和成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)pUL11 暴露在細胞膜上[21]；在γ 皰疹病毒中， Chiu 等將EBV BBLF1-Flag 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A7 細胞，通過IFA 發(fā)現(xiàn)BBLF1 定位在反面高爾基體區(qū)域[16]。

1.2.2 pUL11 在病毒粒子中的定位為了確定pUL11 是否是病毒粒子的組份及其在病毒顆粒中的定位，Kopp 等用兔抗pUL11 對純化的PRV 粒子進行膠體金免疫染色，通過電子顯微鏡觀察到膠體金標(biāo)記的pUL11 緊鄰囊膜，表明PRV 的pUL11 是膜相關(guān)的蛋白質(zhì)[17]；PRV 感染的RK13 超薄切片中，特異性pUL11 血清可以標(biāo)記胞質(zhì)內(nèi)具有囊膜的病毒粒子和可能為高爾基體衍生的胞內(nèi)膜以及細胞外病毒顆粒，而核周膜和核膜中的初級包膜病毒顆粒沒有特定的金顆粒標(biāo)記，表明UL11 定位在出核后的病毒粒子中。

2 UL11 基因編碼蛋白質(zhì)的功能

皰疹病毒UL11 基因編碼的蛋白會影響病毒復(fù)制。Schimmer 等在RK13 細胞中研究UL11 基因?qū)? 型馬皰疹病毒(Equine herpesvirus 1，EHV-1)分離株和疫苗株在細胞中的一步生長動力學(xué)的影響，結(jié)果缺失UL11 基因后可引起細胞內(nèi)和細胞外病毒滴度降低約10 至20 倍[24]。Kopp研究UL11 基因缺失對PRV 在RK13 細胞中的一步生長動力學(xué)的影響，結(jié)果顯示，與親本病毒株相比，UL11 缺失株的病毒滴度降低了10 倍，非必需包膜糖蛋白M 缺失株的病毒滴度降低了50 倍[25]；UL11/gM 雙缺失株與gM 缺失株、UL11 缺失株相比，病毒滴度降低了大約100 倍。表明，gM 與UL11 同時缺后會對病毒粒子的復(fù)制產(chǎn)生顯著影響。Kim 等研究也發(fā)現(xiàn)，僅在同時刪除UL11 和編碼gM 的UL10 基因后才觀察到HSV-1 的復(fù)制缺陷，表明兩種蛋白質(zhì)可能有助于病毒粒子的復(fù)制[26]。Walter 等研究發(fā)現(xiàn)，缺失UL11 的ILTV 感染CEK，形成的空斑大小較野毒株縮小了58 %，而回補株表現(xiàn)出與野毒株一致的空斑大?。蝗笔е甑淖畲蟛《镜味缺纫岸局杲档土?0 倍[22]。這些研究表明，多數(shù)皰疹病毒的pUL11 雖然對病毒在細胞中的復(fù)制不是必需的，卻可以影響病毒復(fù)制。而Badr等構(gòu)建了缺失UL11 和UL11 C 端截斷的EHV-1 感染性克隆，結(jié)果顯示將UL11 缺失和截短的BAC DNAs 轉(zhuǎn)染細胞后不產(chǎn)生子代病毒，而回復(fù)UL11 后轉(zhuǎn)染細胞則可以產(chǎn)生病毒，表明EHV-1 的UL11 對病毒復(fù)制是必需的[12]。UL11 基因編碼蛋白對病毒復(fù)制周期的影響具體體現(xiàn)在進入宿主細胞、囊膜化、釋放等方面。

2.1 誘導(dǎo)病毒包膜與細胞膜融合 Kim 等研究了UL11對HSV-1 進入細胞的影響，缺失gM 或UL11 的病毒株與野毒株相比形成相同的空斑形成單位所需的時間更長，表明gM 或UL11 缺失使病毒進入細胞的速度變慢，且嚴(yán)重抑制病毒誘導(dǎo)細胞融合[26]；Han 等用缺失了UL11 的HSV-1 感染HaCa T 細胞，發(fā)現(xiàn)與野毒株相比缺失病毒在細胞上產(chǎn)生的空斑變小[27]。Schimmer 等用缺失UL11 的病毒株EHV-1 感染RK13 細胞，發(fā)現(xiàn)UL11 的缺失對空斑形態(tài)影響顯著，最大空斑的平均直徑分別降低到親本病毒空斑的23.2 %或34.7 %，并且對缺失株形成合胞體的能力有影響[24]。這些研究表明pUL11 與病毒的侵入及病毒在細胞與細胞之間的擴散有關(guān)。

2.2 參與病毒粒子初級包膜的形成和次級囊膜化過程對HSV-1、 ILTV、 PRV 和鼠巨細胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)的研究均表明，UL11 在病毒粒子的次級囊膜化過程中具有重要作用，pUL11 的缺失將導(dǎo)致病毒粒子在細胞質(zhì)中次級包膜的缺損[22,25,28-29]。Leege 等在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-1 的UL11 缺失株與親本株相比，其發(fā)生次級囊膜化缺陷，表現(xiàn)在細胞質(zhì)中存在裸露核衣殼；在感染HSV-1 的gM/UL11 雙缺失突變株的RK13 細胞中，形成大量由與電子致密物質(zhì)皮層結(jié)合的核衣殼組成的胞質(zhì)內(nèi)包涵體[19]。Kopp 等用PRV UL11 缺失株感染RK13，電子顯微鏡觀察到感染細胞的細胞核形態(tài)正常，在核膜的內(nèi)層沒有明顯的衣殼積聚且細胞核未受任何損傷，然而胞質(zhì)內(nèi)膜(特別是高爾基體附近或高分子膜)扭曲，膜聚集彎曲并且緊密連接，推測pUL11 可能會妨礙蛋白質(zhì)核衣殼到次級囊膜化位點的進程[17]。

Fulmer 等研究中，還觀察到UL11 的缺失會抑制細胞核中病毒核衣殼初級包膜的形成從而引起衣殼在細胞核內(nèi)的積聚，并且UL11 缺失的病毒粒子形成具有彌漫性的衣殼的聚集體，表明UL11 對病毒粒子的初級囊膜化也具有重要的作用[30]。

2.3 影響病毒粒子的釋放 UL11 基因?qū)Σ《玖Ｗ拥某鲅坑幸欢ǖ挠绊憽aines 等的研究表明，缺失61 % UL11 基因的HSV-1 突變病毒與野生型病毒相比，從Vero 細胞中釋放到細胞外的感染性病毒的量降低了1 000 倍以上；缺失61 % UL11 基因的突變病毒釋放到細胞外的過程顯著延遲，在感染后20 h～26 h 細胞外的感染性病毒顆粒只增加15 倍，而野生型病毒在感染后8 h～14 h 細胞外病毒卻增加500 倍[31]；Chouljenko 等構(gòu)建了HSV-1 的UL11缺失株，采用Q-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，感染細胞上清中病毒粒子比細胞中病毒粒子少[32]。

3 pUL11 與病毒其它蛋白以及宿主相關(guān)蛋白的相互作用

3.1 pUL11 與pUL16 和pUL21 的相互作用 pUL11 可與多種蛋白相互作用，其中與pUL16、pUL21 之間的相互作用受到了廣泛的關(guān)注。Yeh 對HSV-1 pUL11 和pUL16 皮層蛋白相互作用進行研究，認為pUL11 和pUL16 之間的相互作用是直接的，并且研究表明兩種蛋白間的結(jié)合需要pUL16 內(nèi)幾種保守的半胱氨酸[23]。

Chadha 等通過共轉(zhuǎn)染表達pUL11 和pUL16，觀察到二者的共定位；然后將大腸桿菌表達的含His 標(biāo)簽的UL16 蛋白與含pUL11 的GST 和不含pUL11 的GST 混合孵育后進行Pull down 試驗，用His 標(biāo)簽抗體對pUL16 進行免疫印跡分析，結(jié)果GST-pUL11 能顯出pUL16 條帶，而GST 卻不能[33]。PRV 的GST-pUL11 能下拉pUL16 和pUL21，但GST-pUL11 不能下拉缺失了UL16 基因病毒的pUL21[34]，表明pUL11 與pUL16 具有直接相互作用，但只有在pUL16 存在的情況下，pUL11、pUL16 和pUL21 才能結(jié)合在一起，pUL11 與pUL21 不存在直接相互作用。

Han 等將UL11、UL16 和gE 真核表達質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染Vero 細胞，發(fā)現(xiàn)UL16 與gE 的相互作用很弱，但pUL11 能募集pUL16 而促進pUL16 與gE 在核周位置共定位[28]。

3.2 UL11 與gE 相互作用 Kopp 等最先報道pUL11 可以與gE 結(jié)合[17]。pUL11 能特異性結(jié)合到gE 胞內(nèi)域(CT)。Farnsworth 采用免疫沉淀方法檢測量化分析后，發(fā)現(xiàn)結(jié)合到全長gE 的pUL11 與缺失了gE CT 結(jié)構(gòu)域的gE- 突變株相比，大約多了5 倍；與缺少大部分CT 結(jié)構(gòu)域的突變株相比，大約多了2 倍；只表達gE 495 位之后氨基酸和519 位之后氨基酸的兩個突變株免疫共沉淀結(jié)果為全長gE 的83.6 %，表明pUL11 特異性結(jié)合gE 主要涉及gE CT 結(jié)構(gòu)域C 末端附近的495～550 位氨基酸殘基[35]。Han等分別缺失UL11 和gE 尾端后，對感染細胞的病毒粒子進行純化，免疫印跡檢測顯示，在缺失gE 尾端的情況下，參與病毒粒子裝配的pUL11 的量降低[28]；同樣，在缺失UL11 的情況下，參與病毒粒子裝配的gE 的量也下降[17]。

3.3 pUL11 與pUL16、pUL21 和gE 的相互作用 pUL11-pUL16-pUL21 復(fù)合體通過pUL11 和pUL16 組裝在gE 的細胞質(zhì)尾部上與膜相互作用，pUL11 與gE 直接結(jié)合促進gE-pUL16 相互作用。pUL11-pUL16-pUL21 復(fù)合物對gE 在感染細胞膜上的積累很重要，gE 可促進病毒感染細胞合胞體的形成和病毒在細胞之間的傳播，缺失UL11、UL16和UL21 后的HSV-1 感染Vero 細胞后，gE 在細胞表面的積累大幅度降低[27]。

Han 等研究了pUL11、pUL16、pUL21 和gE 的共定位，單獨轉(zhuǎn)染表達時，pUL16 和pUL21 分布在整個細胞中但主要在胞核；gE 分布在核膜和細胞質(zhì)中類似于高爾基體腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)域的斑點區(qū)；而pUL11 如預(yù)期在反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(Trans-golgi network，TGN)中分布。當(dāng)4 者共同表達時，它們發(fā)生了共定位：pUL16 和pUL21的定位發(fā)生了改變，由原來的細胞核定位轉(zhuǎn)移到核周位置；gE 的定位也發(fā)生了改變，從核膜轉(zhuǎn)移并與其它3 種蛋白質(zhì)在相同的核周位置積聚[27]。

綜上可知，UL11 與gE、UL16 和UL21 均存在較強的結(jié)合能力，但UL16 與gE 結(jié)合能力較弱；UL11 與UL21不存在直接的相互作用，但可與UL16 結(jié)合間接與UL11發(fā)生相互作用，且UL21 可以促進UL11 與UL16 的相互作用；UL11 可以促進gE 與ULL16 的結(jié)合(圖3)。

圖3 pUL11 的定位及其與其他蛋白的相互作用

3.4 pUL11 與CD45 的相互作用與免疫逃逸 受體型酪氨酸磷酸酶CD45 在淋巴細胞的發(fā)育成熟、功能調(diào)節(jié)及信號傳遞中具有重要意義，在T 細胞受體(T cell receptor，TCR)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有中心作用。Gabaev 等通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，HCMV 膜結(jié)合的pUL11 以及可溶性pUL11-Fc 蛋白均可以與CD45 相互作用，當(dāng)T 細胞與較高濃度的可溶性UL11-Fc (人IgG 的Fc 區(qū)域與pUL11 C 末端胞外域融合)融合蛋白孵育后，再用TCR 特異性抗體刺激，T 細胞的增殖減弱。該結(jié)果表明，pUL11 可能降低CD45 的活性而抑制T 細胞效應(yīng)子功能，有助于保護感染細胞免受HCMV 特異性T 細胞的侵害[21]?？梢?，pUL11 具有免疫抑制特性，通過抑制CD45 破壞T 細胞功能是HCMV 的一種免疫調(diào)節(jié)策略。

3.5 pUL11 與CD8 T 細胞 Gabaev 將野生HCMV 及其UL11 缺失病毒分別感染人胚肺成纖維細胞后，再與HCMV 立即早期蛋白IE1 和被膜蛋白pp65 抗原特異性的細胞毒性T 淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)共同培養(yǎng)，結(jié)果檢測到野生HCMV 及其UL11 缺失病毒組IE1和pp65 蛋白的表達量、人白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)以及IFN-γ 的表達水平相似；進一步用慢病毒載體在HEK293T 細胞中高水平表達pUL11 后，用ELISA 的方法檢測干擾素產(chǎn)生量，結(jié)果IFN-γ 水平與對照組也無差異，表明pUL11 不影響CD8 T 細胞活性[36]。

4 展 望

目前，皰疹病毒UL11 基因及其功能的研究大都是針對人源皰疹病毒的，動物皰疹病毒的研究較少，對多種皰疹病毒UL11 基因的研究將有利于全面闡明UL11 基因的功能和作用。UL11 基因雖然小，但對于病毒粒子復(fù)制和裝配具有重要意義，因此進一步開展UL11 基因及其編碼蛋白與病毒DNA 的復(fù)制相關(guān)的出芽、包裝、囊膜化、釋放等機制的研究，不僅可為闡述病毒復(fù)制的生命周期提供參考，也有利于了解皰疹病毒致病機理。此外，大多數(shù)皮層蛋白均具有免疫逃逸的功能[37-39]，UL11 也編碼一種皮層蛋白，且與其發(fā)生相互作用的pUL16 和gE 也具有逃逸功能[40-41]，但UL11 與免疫逃逸的關(guān)系報道較少，因此有必要進一步明確其在病毒免疫逃逸中的作用及其作用機制。