豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用

叢廣義，劉建波，時洪艷，張鑫，陳建飛，馮力*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室豬消化道團隊，黑龍江哈爾濱150069)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是導(dǎo)致幼齡仔豬腹瀉、嘔吐，進而脫水死亡的一種腸致病性病毒。1971 年首次在英國報道[1]，隨后該病毒傳播到整個歐洲和一些亞洲國家[2]。最近PEDV 在中國養(yǎng)豬場中廣泛流行，仔豬死亡率在80 %～100 % ，大部分在出生后7 d 內(nèi)死亡，有的在出生幾小時后就死亡[3]。PEDV 主要經(jīng)糞口途徑傳播，皮膚和黏膜是機體的第一道防線，而黏膜免疫系統(tǒng)中的抗體對防止PEDV 感染至關(guān)重要。分泌型IgA (SIgA)抗體為黏膜免疫系統(tǒng)中重要的作用分子，可以識別病原體和共生菌[4-6]。SIgA 對仔豬腸道的保護作用包括很多方面：中和細(xì)胞內(nèi)排出的病毒顆粒，凝集細(xì)菌和病毒，以及防止病原體粘附到細(xì)胞表面，干擾細(xì)菌運動等[7]。由于PEDV 主要感染仔豬，仔豬獲得母源抗體的途徑主要來源于初乳和乳汁，母豬從接種疫苗后第13 d～14 d 分泌的乳汁中的PEDV SIgA 抗體達(dá)到最高值[8]。在高濃度的內(nèi)源性SIgA 抗體保護下，仔豬在斷奶期間患該病的可能性較小[6]。由于PEDV 主要感染仔豬，仔豬獲得母源抗體的途徑主要來源于初乳和乳汁，而SIgA和IgG 為乳汁中抗體的重要組分。腸道內(nèi)存在多種消化酶，可以破壞完整的IgG 結(jié)構(gòu)，使其結(jié)合抗原的功能受到影響，而SIgA 其有分泌成分(SC)片段和J 鏈(joining chain，J)的保護，可以使其避免被消化酶水解，表明在保護仔豬免受PEDV 的感染過程中，SIgA 抗體發(fā)揮的作用要明顯高于IgG 的作用[9-10]。

因此，檢測初乳或直腸拭子中的SIgA 抗體比檢測血清中的IgG 更能體現(xiàn)疫苗免疫后的母豬及吃過初乳仔豬的免疫水平，但目前PEDV SIgA 抗體檢測方法的缺失，影響了及時掌握豬群接種疫苗后的抗體評價及病毒感染情況的跟蹤，鑒于此，本研究擬建立檢測PEDV SIgA 抗體的間接ELISA 方法，為檢測豬群中PEDV SIgA 水平及黏膜免疫評價提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 分泌抗SIgA SC 抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F9、PEDV LNCT2 株、Vero E6 細(xì)胞系，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬消化道傳染病創(chuàng)新團隊保存；RPMI 1640 培養(yǎng)液購自Gibco 公司；BALB/c 小鼠由本所實驗動物中心代為購買；HRP 購自Sigma 公司；2，2- 連氮基雙-3- 乙基- 苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)購自BBI 公司；Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購自中杉金橋公司；Hi-Trap Protein G HP 購自GE Healthcare 公司；待檢測直腸拭子樣品均來自本創(chuàng)新團隊感染實驗中PEDV攻毒豬和陰性對照豬；待檢測初乳樣品采自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物基地；TGEV 陽性初乳和PoRV 陽性初乳均采自本創(chuàng)新團隊動物實驗中的母豬；待檢測的165 份直腸拭子樣本及90 份(每個省各30 份)初乳樣本及其對應(yīng)的直腸拭子樣本采集自貴州、遼寧、黑龍江省的部分豬場。

1.2 小鼠腹水的制備、純化、標(biāo)記及效價測定 將凍存的2F9 雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)后制備小鼠腹水，離心除去沉淀后收集上清液，-70 ℃保存，備用[10]。按照HiTrap Protein G HP 抗體純化說明書純化收集的腹水并經(jīng)濃度測定后，按文獻(xiàn)[11]的碘酸鈉法采用HRP 標(biāo)記純化的2F9，以純化的豬SIgA蛋白[10]包被ELISA 板，采用本實驗室建立的直接ELISA 方法檢測HRP 標(biāo)記抗體的抗體效價。

1.3 PEDV 培養(yǎng)、純化及電鏡觀察 收集PEDV LNCT2 株病毒液，經(jīng)3 000 r/min 離心5 min 去除細(xì)胞碎片后10×104r/min 離心2 h，收集沉淀。利用蔗糖密度梯度(20 %、30 %、40 %和60 %)離心純化沉淀，收集40%～60%蔗糖層的樣品，經(jīng)10×104r/min離心2 h 進行脫糖處理，收集沉淀即為純化的病毒粒子，負(fù)染后經(jīng)電鏡鑒定。

1.4 待檢樣品的SIgA 抗體的間接免疫熒光(IFA)檢測 將新鮮采集的直腸拭子樣品浸泡在PBS 溶液中，搖晃數(shù)次后收集上清用于檢測；將新鮮采集的初乳8 000 r/min 離心5 min，去掉下層干物質(zhì)及上層油脂，取中間層液體用于檢測。待Vero E6 細(xì)胞長滿單層后，接種PEDV LNCT2，待細(xì)胞剛出現(xiàn)CPE 時利用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞，加入待檢直腸拭子浸出液或初乳處理樣品(1∶30)，37 ℃反應(yīng)1 h，以純化的MAb 2F9 (1 ∶10 000)為一抗，Alexa Fluor488 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1∶500)為二抗，經(jīng)IFA檢測待檢樣品中PEDV SIgA 抗體。

1.5 間接ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用方陣法，優(yōu)化下列各反應(yīng)條件：病毒粒子包被量(2 倍倍比稀釋：742 ng/ 孔～0.725 ng/ 孔)、封閉液(5 % BSA、5 %脫脂乳、5 %牛血清)、封閉時間(1 h、2 h)、待檢樣品稀釋度(1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320)、孵育時間(30 min、l h、1.5 h、2 h 和4 h)、HRP 標(biāo)記的鼠抗豬SIgA SC MAb (HRP-SIgA SC)的稀釋度(1:2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶16 000)、反應(yīng)時間(15 min、30 min、45 min、60 min、90 min)和底物(ABTS)反應(yīng)時間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)，初步建立檢測PEDV SIgA 的ELISA 方法。

1.6 陰性和陽性臨界值的判定 經(jīng)1.4 IFA 檢測的30 份PEDV SIgA 陰性直腸拭子處理樣品和27 份SIgA 陰性初乳處理樣品，利用本研究建立的ELISA方法檢測，確定陰性和陽性臨界值。根據(jù)OD405nm值分別計算出陰性直腸拭子樣品和初乳樣品的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)，根據(jù)+3SD 值確定樣品的陰、陽性臨界值。

1.7 特異性試驗 利用本研究建立的ELISA 方法檢測經(jīng)1.4 步驟處理的TGEV、PoRV 陽性初乳樣品，以PEDV SIgA 陽性初乳處理樣品作為陽性對照，PEDV 陰性初乳樣品作為陰性對照，每個樣品重復(fù)3 次，測定其OD405nm值，進行特異性試驗。

1.8 敏感性試驗 選取經(jīng)1.4 IFA 測定的1 份PEDV SIgA 抗體陽性的初乳樣品，經(jīng)2 倍倍比稀釋(1∶10～1∶12 800)后利用本研究建立的ELISA 方法進行檢測，以評估該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗 使用同一批次制備的ELISA 板，選取5 份初乳和直腸拭子處理樣品在3 個不同的時間點檢測，試驗重復(fù)3 次，評價該方法的批內(nèi)重復(fù)性；使用3 個批次包被的ELISA 板，選取相同的5份初乳和直腸拭子處理樣品進行檢測，試驗重復(fù)3次，評價該方法的批間重復(fù)性。

1.10 臨床樣品的檢測 采集貴州、遼寧、黑龍江省部分豬場豬直腸拭子165 份和母豬初乳樣品90 份(每個省份各30 份)及其對應(yīng)的直腸拭子，經(jīng)1.4 步驟處理后，利用本研究建立的間接ELISA 方法和1.4 的IFA 同時檢測各樣品中的PEDV SIgA 抗體，比較二者的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 HRP- SIgA SC 的效價測定 HRP-SIgA SC 經(jīng)純化后測定其濃度為3 mg/mL，純化效果較好。通過直接ELISA 方法對純化的HRP-SIgA SC 進行效價測定，在1∶3 000 稀釋時OD405nm接近1 (圖1)，根據(jù)文獻(xiàn)[11]將OD405nm值為1 左右對應(yīng)的抗體效價為標(biāo)記抗體的效價，所以HRP-SIgA SC 效價為1∶3 000。

圖1 HRP-SIgA SC 效價測定結(jié)果Fig.1 Results of HRP-SIgA SC titer determination

2.2 PEDV 的培養(yǎng)、純化及電鏡觀察結(jié)果 經(jīng)蔗糖梯度離心方法純化的病毒粒子經(jīng)負(fù)染法后觀察，可見病毒純化效果較好，雜質(zhì)少，該病毒為有囊膜病毒，纖突蛋白完整且明顯，呈冠狀分布于病毒囊膜外層，病毒粒子直徑為95 nm～130 nm (圖2)。表明獲得了完整的PEDV 病毒粒子。

2.3 待檢樣品的SIgA 抗體IFA 檢測結(jié)果 將待檢的樣品經(jīng)IFA 檢測，結(jié)果顯示共檢測到30 份PEDV陰性豬直腸拭子和27 份PEDV 陰性的初乳樣品，以及30 份PEDV 陽性豬直腸拭子和30 份PEDV 陽性的初乳樣品(圖3)?？梢杂糜诤罄m(xù)臨界值的確定和敏感性試驗。

2.4 ELISA 方法最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)方陣滴定法確定該間接ELISA 方法的最優(yōu)反應(yīng)條件見表1。

圖2 電鏡觀察PEDV 粒子(負(fù)染法)Fig.2 Electron microscopic observation of PEDV virus particles(negative staining method)

圖3 直腸拭子和初乳樣品中PEDV SIgA 的IFA 檢測結(jié)果Fig.3 Detection of PEDV SIgA in rectal swabs and colostrum samples by IFA

表1 間接ELISA 最佳工作濃度的確定Table 1 Determination of the optimal working concentration of the indirect ELISA

2.5 間接ELISA 方法臨界值的確定 分別對30 份PEDV 陰性直腸拭子和27 份陰性初乳樣品經(jīng)建立的ELISA 方法檢測。結(jié)果顯示各樣品的OD405nm值成正態(tài)分布(圖4)。經(jīng)計算，直腸拭子X+3SD 值=0.261，因此將OD405nm值＞0.261 判為陽性，OD405nm值≤0.261 判為陰性；初乳X+3SD 值=0.305 因此將OD405nm值＞0.305 判為陽性，OD405nm值≤0.305 判為陰性。

圖4 間接ELISA 方法臨界值的確定Fig.4 Determination of the indirect ELISA threshold

2.6 特異性試驗結(jié)果 采用建立的間接ELISA 方法進行特異性試驗，每個樣品做3 個重復(fù)，檢測其OD405nm值，并計算平均數(shù)，結(jié)果顯示除PEDV 陽性初乳樣品OD405nm＞0.305 為陽性結(jié)果外，TGEV 及PoRV 陽性初乳樣品均為陰性結(jié)果(表2)。表明該間接ELISA 方法與TGEV 和PoRV 的陽性初乳樣品無交叉反應(yīng)，具有較強的特異性。

表2 間接ELISA 特異性試驗結(jié)果Table 2 Specificity test results of the indirect ELISA

2.7 敏感性試驗結(jié)果 取1 份經(jīng)IFA 檢測后的陽性初乳處理樣品2 倍倍比稀釋后，利用本研究建立的ELISA 方法檢測，評估該方法的敏感性。結(jié)果顯示，ELISA 檢測OD405nm值與IFA 測定的效價呈正相關(guān)，隨著陽性初乳稀釋倍數(shù)增加，其OD405nm值平緩遞減。當(dāng)陽性初乳的SIgA 抗體效價為1∶6 400 時，該ELISA 檢測的OD405nm值仍然大于0.305，而稀釋到1∶12 800 時，其OD405nm值小于0.305 (圖5)，判為陰性，所以該ELISA 的敏感性為1∶6 400。表明該方法的敏感性較高。

2.8 重復(fù)性試驗結(jié)果 使用同一批次制備的ELISA板，檢測隨機抽取的5 份初乳、直腸拭子處理樣品，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)小于10 % (表3)；使用不同批次制備的ELISA 板檢測上述5 份初乳、直腸拭子處理樣品，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)小于10 %(表4)。表明該檢測方法重復(fù)性較好。

圖5 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of the ELISA

表3 初乳樣品的重復(fù)性試驗結(jié)果(n=5)Table 3 Colostrum reproducibility test results of the indirect ELISA (n=5)

表4 直腸拭子樣品的重復(fù)性試驗結(jié)果(n=5)Table 4 Rectal swab repeatability test results of the indirect ELISA (n=5)

2.9 間接ELISA 方法的初步應(yīng)用 對不同省份采集的165 份豬直腸拭子樣品分別經(jīng)本研究建立的ELISA 方法和IFA 同時檢測。結(jié)果顯示，165 份樣品中PEDV SIgA 抗體陽性率達(dá)49.7 %，IFA 檢測的陽性率為50.9 %，二者符合率為97.6 % (表5)；對每個省份30 份，共計90 份采集的母豬初乳樣品及其對應(yīng)的直腸拭子分別經(jīng)IFA 和ELISA 方法檢測，結(jié)果顯示二者檢測結(jié)果完全一致，PEDV SIgA 抗體陽性樣品90 份，無陰性樣品。陽性率均為100 %(表6)。表明該間接ELISA 方法檢測結(jié)果較準(zhǔn)確，可以用于臨床檢測。

表5 間接ELISA 和IFA 檢測臨床豬直腸拭子中的SIgA 抗體結(jié)果比較Table 5 Comparison of SIgA results in clinical pig rectal swabs by indirect ELISA and IFA

表6 間接ELISA 和IFA 檢測母豬初乳及其對應(yīng)直腸拭子中SIgA 抗體的結(jié)果比較Table 6 Comparison of SIgA results in clinical sow colostrum and corresponding rectal swabs by indirect ELISA and IFA

3 討 論

PEDV 感染的靶器官是仔豬小腸絨毛膜上皮細(xì)胞[9]，其在感染小腸上皮細(xì)胞時需穿過黏膜層，因此黏膜免疫系統(tǒng)在防控PEDV 感染的過程中至關(guān)重要。在黏膜免疫系統(tǒng)中病原特異性SIgA 抗體能夠有效中和病毒、阻斷病原體與機體接觸，促進病原體排出體外。因此，機體內(nèi)PEDV 特異性SIgA 抗體水平是評價機體能否有效阻斷PEDV 感染的重要指標(biāo)。為了檢測豬針對PEDV 產(chǎn)生的黏膜免疫，有必要建立一種檢測PEDV SIgA 的方法。本研究建立了能夠評價PEDV 感染及其免疫狀態(tài)的SIgA 檢測方法滿足了該需要。

經(jīng)主動免疫或自然感染PEDV 后，豬的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對PEDV 不同結(jié)構(gòu)蛋白及不同表位的SIgA，這些SIgA 分子均可以與PEDV 結(jié)合。而本實驗以全病毒粒子作為間接ELISA 的包被抗原，可以結(jié)合病毒不同抗原或抗原表位產(chǎn)生的SIgA。PEDV有兩種基因亞型：G1 和G2 亞型[3]。兩種基因亞型病毒株的差異主要存在于S 基因[12]，本研究中所用的PEDV LNCT2 株(G2 亞型)S 基因與CV777 株S基因(G1 亞型)的同源性為93.2 %；PEDV 其它結(jié)構(gòu)蛋白如M、E 等變異率較低。因此，以PEDV LNCT 株病毒粒子為包被抗原建立的間接ELISA 方法完全可以檢測出CV777 病毒株誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生的SIgA 抗體。

此外，因IFA 具有敏感性和特異性強等優(yōu)點，所以本研究將初乳及直腸拭子待檢測樣品經(jīng)IFA 檢測，其檢測結(jié)果與本研究建立的ELISA 檢測結(jié)果相似。由于目前無PEDV 特異性SIgA 抗體商品化檢測試劑盒，因此，本研究將建立的ELISA 方法與IFA進行比較，結(jié)果可信度較高。同時，本研究應(yīng)用的抗SC 片段的MAb 能夠與SIgA 分子中的SC 片段特異性結(jié)合，與IgA 分子無反應(yīng)，能夠有效排除IgA分子對SIgA 抗體檢測結(jié)果的影響，特異性較強。相較于血清抗體ELISA 檢測方法對樣品的采集過程，該方法采集的樣品為豬肛拭子和初乳，采集方便且動物應(yīng)激反應(yīng)低，無需使用注射器采血，避免了由于消毒不徹底造成繼發(fā)感染，目前市售的PEDV 抗體ELISA 檢測試劑盒多是檢測血清抗體，如間接ELISA 試劑盒、競爭或阻斷ELISA 試劑盒[8]，這些方法均不能對局部黏膜免疫進行評價。相較于檢測血清抗體，檢測SIgA 抗體能夠更加直觀的反映動物機體對PEDV 免疫的應(yīng)答情況，所以本研究建立的PEDV SIgA 抗體間接ELISA 檢測方法比血清學(xué)檢測方法更方便科學(xué)地評價豬群的感染狀況和免疫狀況。

本實驗檢測樣品為初乳或肛拭子，在樣品運輸過程中需維持4 ℃低溫以保證樣品新鮮。采用該方法對來自3 個省部分豬場的初乳或肛拭子樣品進行了檢測，結(jié)果顯示3 個省份平均PEDV SIgA 抗體陽性率達(dá)49.7 %，這與Chen 的血清抗體檢測結(jié)果相似[7]，其中以貴州省采集的樣品陽性率最高達(dá)71.4%，初步表明這3 個省份部分豬場的部分豬體內(nèi)產(chǎn)生了PEDV SIgA，但仍需要加強疫苗的免疫覆蓋率。

綜上所述，檢測PEDV SIgA 抗體水平比檢測血清中IgG 及IgA 水平能夠更加科學(xué)的評價仔豬感染PEDV 的狀態(tài)或仔豬的母源抗體水平。檢測母豬初乳和直腸拭子中的SIgA 可以為制定PEDV 免疫程序提供參考依據(jù)。本實驗建立的PEDV 特異性SIgA抗體ELISA 方法為檢測豬體的主動免疫和被動免疫狀態(tài)提供了有效的技術(shù)手段。