殼聚糖接枝慶大霉素綴合物的毒理安全性評價

摘要：對殼聚糖—慶大霉素綴合物（CS-GT）毒理學(xué)安全性評價并研究其在動物機體內(nèi)的毒物代謝動力效果。通過亞急性經(jīng)口毒性試驗以及CS-GT在小鼠體內(nèi)吸收及組織分布試驗評價CS-GT的毒理安全性。在亞急性經(jīng)口毒性試驗中發(fā)現(xiàn)大鼠生理機能正常，各劑量組均未見不可逆性毒性損傷。CS-GT在組織中的分布主要集中于腎、小腸中，6～7.5 h間基本可以代謝完畢，隨糞便排除。在該試驗研究劑量與條件下，殼聚糖—慶大霉素綴合物無致死性作用和明顯毒性作用。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；慶大霉素綴合物；安全性評價

慶大霉素是從放線菌科單孢子屬發(fā)酵培養(yǎng)液中提取出的一種氨基糖苷類抗生素，具有良好的水溶性，主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的感染，但慶大霉素在使用過程中有諸多毒副作用，例如耳毒性和腎毒性[1]。單一慶大霉素的使用、治療仍存在許多限制因素，為了避免使用慶大霉素給藥時產(chǎn)生的毒副作用，大量功能化抗生素藥物被開發(fā)研究，優(yōu)化后的慶大霉素既有較好的抗菌性能且有效避免其毒副作用[2]。殼聚糖是一種結(jié)構(gòu)類似于纖維素的天然高分子化合物，具有高密度正電荷且能被動物機體完全吸收的特點[3]。將殼聚糖和慶大霉素通過氧化和席夫堿反應(yīng)接枝，利用美拉德反應(yīng)對殼聚糖上的氨基、羥基進行化學(xué)修飾，可顯著提高殼聚糖的抗氧化性、抗菌性、溶解性等理化性質(zhì)[4]。本試驗旨在確定CS-GT在小鼠體內(nèi)的適宜劑量，通過亞急性經(jīng)口毒性試驗和毒代動力學(xué)研究，初步揭示藥物毒性，為慢性毒性試驗和臨床試驗劑量提供參考，并分析其在體內(nèi)的吸收、代謝及濃度變化，判斷毒性靶器官，為臨床不良反應(yīng)預(yù)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

殼聚糖接枝慶大霉素綴合物（接枝率：16.76%）由廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院李程鵬老師課題組提供；異硫氰酸熒光素FITC購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 亞急性經(jīng)口毒性試驗

12只100～150 g SPF級SD大鼠隨機分為4組（n=3）：對照組、CS-GT低（250 mg/kg）、中（500 mg/kg）、高（1 000 mg/kg）劑量組。禁食12 h后，分別灌胃CS-GT或蒸餾水，連續(xù)5 d監(jiān)測體重、飼料和飲水消耗，并觀察一般癥狀。

1.3 CS-GT在小鼠體內(nèi)吸收及組織分布試驗

48只SPF級小鼠分12組，按4.5 h、6 h、7.5 h采樣時間分為3組，每組再分對照組、低（200 mg/kg）、中（400 mg/kg）、高（800 mg/kg）劑量組。禁食12 h后，F(xiàn)ITC-CS-GT溶解灌胃。給藥后按設(shè)定的采樣時間眼球取血離心制備血清樣品，取肝、脾、腎、胃內(nèi)容物、腸及腸內(nèi)容物，勻漿離心制組織樣，檢測熒光強度。

試驗小鼠經(jīng)口給藥后按設(shè)定的采樣時間分別避光收集糞便，按每100 mg糞加入1 mL PBS，充分勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液制備樣品，測定樣品中熒光強度變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗結(jié)果均來自至少3個獨立試驗，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，通過單因素方差分析和T檢驗確定統(tǒng)計學(xué)意義。試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 27軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞急性經(jīng)口毒性試驗

試驗期間，各劑量組大鼠生長行為正常，無死亡，各劑量組大鼠的精神狀態(tài)、食量等無異常，未見嗜睡、煩躁、嘔吐、厭食、脫毛及排泄無異常。各組大鼠體重均有不同程度的增長，其中實驗組大鼠體重增長顯著，高劑量組大鼠增重27.3 g，總進食113.41 g，食物利用率24.1%（圖1）。解剖未見明顯病理變化。

2.2 CS-GT在小鼠體內(nèi)的組織分布

小鼠單次經(jīng)口給藥FITC-CS-GT 4.5h后，除血清外，在肝、脾和腎組織有CS-GT分布，在肝中，低中劑量CS-GT在4.5 h～6 h代謝極顯著，其他時間段并無顯著性差異。在脾中，低劑量和中劑量，在4.5 h～6 h代謝極顯著，高劑量在6h～7.5 h代謝顯著，在腎組織中CS-GT隨時間依賴性減少；由于存在吸收過程，在給藥后6 h左右藥物吸收達到高峰，之后迅速從血液中向外周分布（圖2）。

2.3 CS-GT在小鼠體內(nèi)的吸收及排泄

由圖3可知，小腸內(nèi)低、中、高劑量CS-GT熒光強度分別在4.5 h、6 h和7.5 h出現(xiàn)顯著增加，并隨時間增長而上升。在大腸中，低、中劑量CS-GT在4.5 h和6 h與對照組差異顯著，7.5 h時極顯著增加，而高劑量CS-GT在所有時間段均極顯著增加。糞便中，6 h的藥物量與其他時間點存在顯著差異，4.5 h至6 h藥物代謝量增多，代謝增強；6 h至7.5 h藥物代謝量減少，呈現(xiàn)下降趨勢。

3 討論

硫酸慶大霉素的腹腔注射半數(shù)致死量為294.52 mg/kg[5]，殼聚糖的LD50gt;1 500 mg/kg[6]。在亞急性毒性試驗中，根據(jù)試驗大鼠的體重計算出灌胃量約為2～3 mL。試驗組分別選擇了250 mg/kg、500 mg/kg以及1 000 mg/kg劑量的藥物進行試驗。結(jié)果顯示與正常對照組相比，大鼠各項生理檢測指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異。

異硫氰酸熒光素（FITC）是熒光免疫測定中常見的熒光探針，并廣泛用于蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記，也用于與其他類型的生物材料或生物分子偶聯(lián)以進行成像的示蹤劑[7-8]。Onish[9]等將腹腔注射熒光標(biāo)記水溶性殼聚糖后，殼聚糖迅速分布于小鼠腎臟和尿液中，無體內(nèi)積累。本試驗結(jié)果顯示CS-GT在小鼠體內(nèi)經(jīng)口服吸收后主要分布在肝、脾、腎，并在這些組織中代謝。肝、腎中CS-GT低中劑量在4.5～6 h代謝差異顯著，腎中藥物濃度隨時間降低，提示組織特異性分布和腎小管重吸收作用，推測CS-GT由腸道吸收后在腎臟和肝臟中代謝。此外，在腸道中不同時間段均出現(xiàn)顯著性增加，糞便中藥物的濃度在6 h時達到峰值，推測部分CS-GT在腸道中吸收后，剩余部分經(jīng)腸道隨著糞便排泄。

隨著新型生物材料應(yīng)用技術(shù)的不斷探索，CS-GT作為一種具有較強抑菌性的藥物，在生物用藥領(lǐng)域存在巨大的研究及應(yīng)用價值，此試驗結(jié)果可為進一步藥理實驗提供參考。

結(jié)語

本研究結(jié)果表明，在該實驗條件下，CS-GT未見亞急性毒性，通過腸道吸收后在8 d后經(jīng)肝和腎代謝出體外。CS-GT具有較高的食用安全性，殼聚糖接枝有效降低了慶大霉素的毒性，該試驗結(jié)果可為進一步開發(fā)CS-GT成為飼料添加劑提供理論依據(jù)?！?/p>

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收稿時間：2025-1-10

作者簡介：王玉玲（2000—），女，碩士。研究方向：家畜中病毒與霉菌毒素脫毒劑的研發(fā)。

通訊作者：雍艷紅（1977—），女，博士。研究方向：動物應(yīng)激性致病機制及防控、海洋加工副產(chǎn)物資源化利用的研究。