分子生物學(xué)技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用

摘 要：沙門氏菌是一種常見的人畜共患食源性病原體，對(duì)公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，影響了食品行業(yè)的健康發(fā)展，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)之一。本文綜述分子生物學(xué)在沙門氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用，以期為政府監(jiān)管部門及第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)；應(yīng)用

Application of Molecular Biology Techniques in Salmonella Detection

ZHAI Pingping， ZHU Yingfei*， FAN Hongwei， ZHAN Zhongxu， XIONG Lixia

（Jiangxi Provincial Institute of Inspection， Testing and Certification Food Inspection and Testing Institute，

Nanchang 330000， China）

Abstract： Salmonella is a common zoonotic food-borne pathogen， which poses a serious threat to public health and affects the healthy development of the food industry， and has become one of the focus of global concern. In this paper， the application of molecular biology in Salmonella detection is reviewed in order to provide reference for the research of government supervision departments and third party detection institutions.

Keywords： Salmonella; molecular biology techniques; application

沙門氏菌是一種主要的食源性病原體，可導(dǎo)致嚴(yán)重的人類和動(dòng)物疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。由于傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品安全和診斷該類食源性疾病至關(guān)重要。常規(guī)的沙門氏菌檢測(cè)步驟包括細(xì)菌分離、生化鑒定和血清學(xué)確證試驗(yàn)等[3]。雖然該方法可靠，但耗時(shí)（需要5～7 d）。此外，不同細(xì)菌之間可能發(fā)生生化交叉反應(yīng)[4]。近年來基于核酸分子檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展速度較快，此類技術(shù)具有敏感、特異、快速和簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。隨著時(shí)代的進(jìn)步，該技術(shù)在我國(guó)檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷擴(kuò)大。我國(guó)要求市級(jí)以上疾病預(yù)防控制中心具有核酸分子檢測(cè)技術(shù)的能力，旨在有效監(jiān)管食品安全[5]。目前，各種基于分子生物學(xué)方法，如PCR、qPCR、數(shù)字PCR以及等溫?cái)U(kuò)增等，具有快速性、特異性和敏感性，已成功用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)。

1 常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)

常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)因不涉及樣品的預(yù)富集或樣品處理，具有簡(jiǎn)單、高效（耗時(shí)3～4 h）和高靈敏度（5～10 CFU·mL-1）的特點(diǎn)[6]。AHMED等[7]使用常規(guī)培養(yǎng)法和PCR檢測(cè)技術(shù)鑒定牛肉和雞肉等食品樣本中的沙門氏菌，其中常規(guī)培養(yǎng)法需要花費(fèi)7 d時(shí)間，樣本檢出率為21.3%，而PCR檢測(cè)技術(shù)顯示在收到樣本后到檢測(cè)完成在12 h內(nèi)，檢出率為23.3%。相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法，常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中的耗時(shí)更短、檢出率更高，已被廣泛用于食源性病原體檢測(cè)。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為一種通用方法[8-9]。XIONG等[10]開發(fā)并驗(yàn)證了快速雙重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，用于準(zhǔn)確識(shí)別和定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌，熔解曲線和凝膠電泳分析結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)lygD和invA的擴(kuò)增具有很強(qiáng)的特異性，雙重實(shí)時(shí)PCR從40種沙門氏菌菌株（包含29種沙門血清型）和12種非沙門氏菌菌株中鑒定出腸炎沙門氏菌，每次反應(yīng)能檢測(cè)到4個(gè)腸炎沙門氏菌DNA拷貝，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，預(yù)富集6 h后，該檢測(cè)方法可從雞蛋樣品中鑒定出腸炎沙門氏菌和沙門氏菌屬分離株，且靈敏度更高。qPCR技術(shù)由于能夠檢測(cè)非常低濃度的目標(biāo)樣品，且檢測(cè)速度快，靈敏度高，已被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測(cè)中。

3 數(shù)字PCR技術(shù)

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增方法，能夠?qū)Σ煌奈廴緲颖具M(jìn)行非常低的濃度定量[11]。FANG等[12]成功開發(fā)了一種新型三重液滴數(shù)字PCR技術(shù)，用于同時(shí)鑒定和絕對(duì)定量沙門氏菌及其兩種重要血清型（腸炎菌和傷寒菌）。該方法的檢測(cè)限分別低至5 fg·μL-1 gDNA和

10 CFU·mL-1純培養(yǎng)物。此外，與qPCR相比，三重液滴數(shù)字PCR技術(shù)用于檢測(cè)人為污染的食品樣品時(shí)，檢測(cè)限較低，為10～102 CFU·mL-1。與qPCR相比，三重液滴數(shù)字PCR技術(shù)具有高度特異性、靈敏性和絕對(duì)定量能力，檢驗(yàn)結(jié)果更靈敏[13]，適用于樣本中低濃度的沙門氏菌檢測(cè)。

4 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是最具創(chuàng)新性的分子技術(shù)之一，主要用于診斷包括沙門氏菌在內(nèi)的多種病原體[14]，具有良好的特異性和靈敏度[15]。DOMESLE等[16]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)-比濁法和熒光法分別檢測(cè)了300種測(cè)試菌株，包括247種沙門氏菌（包含185個(gè)血清型）和53種非沙門氏菌。結(jié)果表明，兩種檢驗(yàn)方法具有100%的特異性，不同血清型的

6種沙門氏菌菌株的檢測(cè)限范圍為1.3～28個(gè)細(xì)胞。在檢測(cè)動(dòng)物食品中低濃度水平的沙門氏菌時(shí)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比熒光技術(shù)更敏感，并且可以提前

3 d獲得結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)速度更快，靈敏度更高，已成為沙門氏菌篩查的快速、可靠和穩(wěn)健的方法。

4.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù)具有靈敏度高、成本低的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的日常檢驗(yàn)中。LI等[17]建立了檢測(cè)沙門氏菌的比色重組酶聚合酶擴(kuò)增方法，通過對(duì)沙門氏菌的invA基因設(shè)計(jì)RPA引物，等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA擴(kuò)增子，并通過光敏比色測(cè)定直接定量。結(jié)果表明，該方法的最低可檢測(cè)濃度為

5×103 CFU·mL-1，可以快速且低成本地檢測(cè)沙門氏菌。

4.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）技術(shù)作為一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，近年來在沙門氏菌檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用[18]，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可測(cè)序分析驗(yàn)證結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)[19]。WANG等[20]建立了一種基于跳躍式滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合光敏比色測(cè)定食品中沙門氏菌的新方法。結(jié)果表明，該方法的檢出限低至13 CFU·mL-1，可快速、靈敏地檢測(cè)食品中的沙門氏菌。此外，該方法無須昂貴的儀器，可以用于其他食源性病原體或其他含有核酸的生物樣本的即時(shí)檢測(cè)。

4.4 聚合酶螺旋反應(yīng)技術(shù)

聚合酶螺旋反應(yīng)（Polymerase Spiral Reaction，PSR）技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中具有較高的靈敏度和特異性。XU等[21]建立了一種針對(duì)沙門氏菌保守入侵基因的聚合酶螺旋反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)限為50 CFU·mL-1，具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速的特點(diǎn)，為食源性疾病的預(yù)防和檢測(cè)提供了參考。

4.5 解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)

解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)，作為一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效、便捷精準(zhǔn)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在病原體檢測(cè)研究中得到廣泛應(yīng)用[22]。DU等[23]開發(fā)了一種快速、簡(jiǎn)單、便攜的沙門氏菌檢測(cè)方法，即將嗜熱解旋酶依賴擴(kuò)增與橫向流動(dòng)分析相結(jié)合，可在90 min內(nèi)進(jìn)行視覺信號(hào)檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法對(duì)DNA和純培養(yǎng)細(xì)菌的檢出限分別為73.4～80.7 fg

和35～40 CFU。特異性分析顯示，沙門氏菌與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌和空腸彎曲桿菌無交叉反應(yīng)。該方法可用于食品樣品中沙門氏菌的快速檢測(cè)，適用于設(shè)備有限的地區(qū)。

5 PMA-PCR檢測(cè)技術(shù)

PCR技術(shù)無法區(qū)分來自非存活細(xì)胞和存活細(xì)胞的DNA擴(kuò)增，食品樣品中死亡或受損細(xì)胞泄漏的大量DNA也可能被擴(kuò)增，導(dǎo)致出現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量的高估和潛在的假陽性檢測(cè)結(jié)果的情況[24]。PMA-PCR檢測(cè)技術(shù)只擴(kuò)增活細(xì)胞中目標(biāo)基因，死亡或受損的細(xì)胞中的基因擴(kuò)增則被抑制，很好地解決了這一難題。HUANG等[25]采用生物信息學(xué)方法篩選單增李斯特菌和沙門氏菌高特異性引物，并將其組合構(gòu)建雙qPCR系統(tǒng)，使用單疊氮化丙啶來彌補(bǔ)qPCR無法區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞的缺陷，建立了快速、高特異性、靈敏的AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測(cè)技術(shù)。此外，與qPCR系統(tǒng)相比，該技術(shù)顯著增強(qiáng)了活菌擴(kuò)增的熒光信號(hào)，對(duì)乳制品中單增李斯特菌和沙門氏菌富集

6 h后，檢測(cè)限低至5×101 CFU·g-1。PMA-PCR檢測(cè)技術(shù)可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，從而減少了假陽性結(jié)果的發(fā)生概率。

6 結(jié)語

由于影響公共衛(wèi)生的食源性疾病暴發(fā)現(xiàn)象日益增加，對(duì)食源性病原體的快速、可靠、敏感和廉價(jià)的檢測(cè)方法的需求增加。PCR、qPCR、dPCR和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室。此外，分子生物學(xué)檢測(cè)方法也存在一些挑戰(zhàn)和局限性，亟待解決。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)對(duì)于食源性病原體的檢測(cè)更加可靠、靈敏和節(jié)省時(shí)間，可以提供快速、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

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