CRISPR-Cas技術在食品微生物檢驗中的應用

摘 要：食品安全檢測是保障公眾健康的重要環(huán)節(jié)。CRISPR-Cas技術作為一種新型的基因編輯工具，在食品微生物檢驗領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景。本文系統(tǒng)綜述了CRISPR-Cas技術的基本原理及其在乳制品、肉類、水產(chǎn)品和果蔬等不同食品微生物檢驗中的應用，為進一步推動CRISPR-Cas技術在食品安全領域的應用提供參考。

關鍵詞：CRISPR-Cas技術；食品安全；微生物檢驗

Application of CRISPR-Cas Technology in Food Microbiological Inspection

FENG Xue

（Tangshan Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center， Tangshan 063000， China）

Abstract： Food safety testing is an important link to protect public health. CRISPR-Cas technology， as a new gene editing tool， has shown broad application prospects in the field of food microbiological testing. In this paper， the basic principle of CRISPR-Cas technology and its application in microbial inspection of different foods such as dairy products， meat， aquatic products and fruits and vegetables were systematically reviewed， so as to provide references for further promoting the application of CRISPR-Cas technology in the field of food safety.

Keywords： CRISPR-Cas technology; food safety; microbial testing

食品安全是關系國計民生的重大問題，其中食源性病原菌污染一直是食品安全領域的重點關注對象[1]。隨著社會的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們對食品安全和質(zhì)量的要求越來越高。因此，建立快速、靈敏、特異性強的食品微生物檢測方法對于保障食品安全、維護公眾健康具有重要意義。近年來，基因編輯技術CRISPR-Cas因其操作簡單、特異性強、檢測速度快等優(yōu)勢而受到廣泛關注。本文將重點介紹CRISPR-Cas技術的基本原理，綜述CRISPR-Cas技術在不同食品（如乳制品、肉類、水產(chǎn)品和果蔬等）微生物檢驗中的應用，為進一步推動CRISPR-Cas技術在食品安全領域的應用提供參考。

1 食品微生物檢驗現(xiàn)狀

食品微生物檢驗是食品安全控制體系中不可或缺的重要環(huán)節(jié)，其目的是及時準確地檢測出食品中潛在的微生物危害，為食品安全風險評估和控制提供科學依據(jù)。目前，食品微生物檢驗主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和現(xiàn)代分子生物學技術。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法包括平板計數(shù)法、最大似然數(shù)法等。其原理是將食品樣品在選擇性或差異性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征進行初步鑒定，再結合生化實驗確定微生物種類。盡管培養(yǎng)法操作簡單，但存在檢測周期長（一般需要2～7 d）、無法檢出難以培養(yǎng)或處于應激狀態(tài)的微生物等問題。隨著分子生物學技術的發(fā)展，核酸擴增技術如聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、核酸雜交等在食品微生物檢驗中得到廣泛應用。PCR技術通過特異性引物擴增微生物基因組的特定片段，再通過瓊脂糖凝膠電泳或實時熒光定量的方法進行產(chǎn)物分析，可在數(shù)小時內(nèi)對目標微生物進行定性或定量檢測，大大縮短了檢測周期。但PCR技術對反應條件要求較高，易受到食品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，且無法區(qū)分活菌和死菌。此外，核酸雜交技術利用DNA分子間的互補配對原理，通過探針與靶標雜交實現(xiàn)微生物的快速檢測，但操作較為煩瑣，靈敏度和特異性也有待進一步提高。因此，迫切需要開發(fā)新的食品微生物快速檢測技術，CRISPR-Cas技術有望在該領域發(fā)揮重要作用。

2 CRISPR-Cas技術原理與特點

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌和古細菌中廣泛存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可以特異性識別并切割外源DNA，從而抵御病毒或質(zhì)粒等遺傳元件的侵染[2]。CRISPR-Cas系統(tǒng)由CRISPR基因座和Cas蛋白構成。CRISPR基因座包含一系列重復序列和間隔序列，其中間隔序列來源于外源DNA片段，作為病毒或質(zhì)粒入侵的“分子記憶”。Cas蛋白是一類RNA介導的核酸酶，根據(jù)序列和結構的差異可分為多個家族和型別。在CRISPR-Cas系統(tǒng)介導的適應性免疫過程中，外源DNA首先被Cas蛋白處理成短小片段并整合到CRISPR基因座的間隔區(qū)，形成新的間隔序列。當再次受到同源病毒或質(zhì)粒入侵時，間隔序列被轉錄成前crRNA，并在Cas蛋白的作用下成熟為crRNA。成熟的crRNA與Cas蛋白形成效應復合物，crRNA的間隔序列與入侵的外源DNA互補配對，引導Cas蛋白特異性切割靶標DNA，從而抵御外源遺傳元件的侵染。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的基本原理，研究者發(fā)展了多種基于CRISPR-Cas的核酸檢測技術，其中最具代表性的是CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a介導的DNA檢測，以及CRISPR/Cas13a介導的RNA檢測[3]。

與傳統(tǒng)核酸擴增技術相比，CRISPR-Cas技術具有顯著優(yōu)勢。①由于Cas蛋白具有極高的特異性，可以實現(xiàn)單堿基差異的區(qū)分，因此該方法的特異性較強。②CRISPR-Cas技術可以在恒溫條件下快速檢測，操作簡便、快速。③CRISPR-Cas技術的靈敏度較高，遠高于PCR法等傳統(tǒng)方法。④通過設計多重sgRNA，可實現(xiàn)對多種核酸靶標的同時檢測。⑤Cas蛋白切割可以產(chǎn)生多種可檢測信號，如熒光、比色、電化學等，適用于不同的檢測平臺。

3 CRISPR-Cas技術在不同食品微生物檢驗中的應用

3.1 乳制品微生物檢驗

乳制品是最易受到微生物污染的食品之一，其中以李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食源性致病菌危害最為嚴重，因此建立高效、快速的乳制品微生物檢測方法對于保障乳品質(zhì)量安全至關重要。近年來，多項研究成功將CRISPR-Cas技術應用于乳制品中重要致病菌的特異性檢測。狄慧玲[4]建立了基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的單核細胞增生李斯特菌快速檢測方法。結果表明，該系統(tǒng)可有效評估不同種類食品中單核細胞增生李斯特菌的流行現(xiàn)狀，同時通過研究該菌不同毒力株中CRISPR/Cas系統(tǒng)的存在形式及保護范圍，可用于預防和控制由該菌引發(fā)的食品安全風險。段寧慧[5]利用基于G四面體的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)檢測沙門氏菌。結果表明，基于G四面體的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)不僅充分利用了基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)診斷的高靈敏度和高特異性，還將目標識別轉化為可視化的信號讀數(shù)，拓寬了應用范圍。

3.2 生鮮肉類微生物檢驗

生鮮肉類是食源性致病菌的主要載體之一，尤其是禽畜產(chǎn)品中常見的沙門氏菌、彎曲菌和大腸桿菌O157：H7等，這些致病菌不僅會引起腹瀉、嘔吐等胃腸道癥狀，還可能誘發(fā)敗血癥、腎衰竭等嚴重并發(fā)癥，因此對生鮮肉類進行微生物檢驗對于預防食品安全事故至關重要。近年來，CRISPR-Cas技術憑借其高特異性、靈敏度和通量的優(yōu)勢在生鮮肉類微生物檢驗領域得到了廣泛應用。WANG等[6]建立了基于CRISPR/Cas12a的豬肉中沙門氏菌的快速檢測方法。結果表明，以invA基因為靶標設計的crRNA引導Cas12a切割靶標DNA后可激活對單鏈熒光報告探針的非特異性切割，產(chǎn)生可檢測的熒光信號，檢測時間為30 min，靈敏度達到101 CFU·g-1，與傳統(tǒng)的PCR方法相當。

3.3 水產(chǎn)品微生物檢驗

水產(chǎn)品是人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢苫蛉钡闹匾M成部分，然而由于水環(huán)境復雜多變，加之漁業(yè)養(yǎng)殖、貯運和加工等環(huán)節(jié)容易引入微生物污染，因此水產(chǎn)品極易成為副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌等水源性致病菌的傳播介質(zhì)，嚴重威脅消費者的身體健康。傳統(tǒng)的水產(chǎn)品微生物檢驗方法如平板計數(shù)法和PCR技術，存在檢測周期長、特異性差等缺點，難以滿足水產(chǎn)品安全監(jiān)管的需求。近年來，CRISPR-Cas技術以其操作簡便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢，在水產(chǎn)品微生物檢驗領域得到了廣泛關注。LV等[7]建立了用于檢測蝦樣品中的副溶血性弧菌的CRISPR/Cas12a-RAA的單管新型檢測系統(tǒng)。結果表明，該方法在純培養(yǎng)物和蝦樣品中的檢測限分別為67 CFU·mL-1和73 CFU·mL-1，具有更高的靈敏度和特異性。

3.4 生鮮果蔬微生物檢驗

生鮮果蔬是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚臓I養(yǎng)來源，然而其生長環(huán)境復雜，采收和運輸過程不當極易造成微生物污染，尤其是大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌等食源性致病菌，已成為導致果蔬相關疾病暴發(fā)的主要原因。傳統(tǒng)的果蔬微生物檢測主要依賴于細菌分離培養(yǎng)和血清學鑒定，存在檢測周期長、靈敏度低等不足，難以滿足生鮮果蔬快速檢測的需求。近年來，CRISPR-Cas技術憑借其操作簡單、特異性強和通量高的優(yōu)勢，為生鮮果蔬中致病菌的快速、靈敏檢測提供了新的思路。LUO等[8]建立了用于水果中沙門氏菌現(xiàn)場快速檢測的CRISPR/Cas12a的可視化微流控芯片。結果表明，該系統(tǒng)利用Cas12a的特異性切割雙鏈DNA和非特異性單鏈DNA轉切能力，為分子診斷提供了有效的信號放大工具。

3.5 豆類微生物檢驗

豆類作為主要的農(nóng)作物和重要食品原料，其微生物污染問題一直是食品安全領域的關注重點。豆類極易受到黃曲霉菌、葡萄球菌和大腸桿菌等有害微生物的侵染，產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，威脅消費者健康。傳統(tǒng)的豆類微生物檢驗方法主要依賴于細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定，存在檢測周期長、靈敏度低等不足。近年來，CRISPR-Cas技術以其高特異性、高靈敏度和高通量的優(yōu)勢，為谷物和豆類中致病菌的快速檢測提供了新的途徑。例如，WU[9]提出了一種基于CRISPR/Cas12a切割G-四鏈體DNAzyme的多模態(tài)生物傳感器，用于檢測黃曲霉毒素B1。該方法通過黃曲霉毒素B1與適配體的特異性結合激活Cas12a，切割G4-DNAzyme，形成著色/SERS/熒光信號增強的TMBox，用于視覺檢測。結果表明，該方法在花生、玉米和巴丹樣品中具有良好的檢測性能，并成功應用于被黃曲霉毒素B1自然污染的花生樣品檢測，驗證了其在實際應用中的可行性。總之，CRISPR-Cas技術憑借其獨特的優(yōu)勢，為豆類微生物檢驗領域帶來了革命性的變革，有望全面提升谷物和豆類食品安全保障水平。

4 結語

CRISPR-Cas技術憑借其高特異性、快速便捷和靈敏度高等優(yōu)勢，在食品微生物檢驗領域具有巨大的應用潛力。目前，該技術已成功應用于乳制品、肉類、水產(chǎn)品和果蔬等多種食品中重要致病菌的檢測，顯著提高了食品安全檢測的效率和準確性。未來，隨著CRISPR-Cas技術的不斷優(yōu)化和檢測平臺的進一步發(fā)展，有望實現(xiàn)更高靈敏度、更低成本和更高通量的食品微生物檢測。特別是CRISPR-Cas技術與微流控、生物傳感等新興技術的結合，將為食品安全快速檢測提供更多技術支持，推動食品安全監(jiān)管體系的完善和發(fā)展。

參考文獻

[1]周潔，黃夏寧，林潔，等.CRISPR-Cas技術在病原微生物檢測中的研究進展[J].中國口岸科學技術，2024，6（增刊1）：4-10.

[2]彭磊.基于CRISPR-Cas12a平臺檢測金黃色葡萄球菌[D].天津：天津科技大學，2021.

[3]冀霞，代紹密，余若菁，等.CRISPR-Cas12a檢測牛奶中大腸桿菌方法的建立與評價[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（18）：179-184.

[4]狄慧玲.單核細胞增生李斯特菌分子分型研究及CRISPR/Cas系統(tǒng)解析[D].廣州：華南理工大學，2014.

[5]段寧慧.基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)檢測沙門氏菌[D].天津：天津科技大學，2022.

[6]WANG B，WANG H，LU X B，et al.Recent advances in electrochemical biosensors for the detection of foodborne pathogens： current perspective and challenges[J].Foods，2023，12（14）：2795.

[7]LV X R，CAO W W，ZHANG H，et al.CE-RAA-CRISPR assay： a rapid and sensitive method for detecting vibrio parahaemolyticus in seafood[J].Foods，2022，11（12）：13.

[8]LUO Y N，SHAN S，WANG S L，et al.Accurate detection of Salmonella based on microfluidic chip to avoid aerosol contamination[J].Foods，2022，11（23）：3887.

[9]WU Z H，SUN D W，PU H B.CRISPR/Cas12a and G-quadruplex DNAzyme-driven multimodal biosensor for visual detection of Aflatoxin B1[J].Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2023，302：123121.