嬰幼兒食品中有益菌功能及安全性分析

摘 要：目的：從市售嬰幼兒食品中分離篩選益生菌并分析其功能特性和安全性。方法：對30份市售嬰幼兒食品進(jìn)行益生菌分離鑒定，結(jié)合體外培養(yǎng)和動物實(shí)驗(yàn)，分析分離菌株的存活率、功能特性及安全性。結(jié)果：從30份市售嬰幼兒食品中分離鑒定出4株優(yōu)勢菌株，包括2株植物乳桿菌（LP-01、LP-02）和2株乳雙歧桿菌（BL-01、BL-02）。其中以LP-01菌株表現(xiàn)最佳，在4 ℃條件下儲存6個月的存活率最高；在人工胃液中3 h存活率為85.2%±2.1%；抑菌圈直徑為（15.2±0.8）mm，表現(xiàn)出良好的耐受性和抗菌性。同時，添加LP-01可顯著提高小鼠腸道屏障功能。安全性實(shí)驗(yàn)表明，LP-01在1010 CFU·kg-1 bw的劑量下，無不良健康效應(yīng)；除LP-02對四環(huán)素和BL-01對紅霉素表現(xiàn)出耐藥性外，其他菌株對所測試的8種抗生素均敏感，且未檢出任何可轉(zhuǎn)移抗性基因。結(jié)論：本研究可為建立益生菌安全評估體系和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以及益生菌在嬰幼兒食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：嬰幼兒食品；益生菌；功能特性；安全性；質(zhì)量控制

Functional and Safety Analysis of Beneficial Bacteria in Infant and Toddler Food

DU Feifei

（Chongqing Inspection Biotechnology Co.， Ltd.， Chongqing 401121， China）

Abstract： Objective： To isolate and screen probiotics from commercially available infant and toddler food， and analyze their functional characteristics and safety. Method： Probiotics were isolated and identified from 30 commercially available infant and toddler foods. Combined with in vitro culture and animal experiments， the survival rate， functional characteristics， and safety of the isolated strains were analyzed. Result： Four dominant bacterial strains were isolated and identified from 30 commercially available infant and toddler foods， including two strains of Lactobacillus plantarum （LP-01， LP-02） and two strains of Bifidobacterium lactis （BL-01， BL-02）. Among them， the LP-01 strain showed the best performance， with the highest survival rate after 6 months of storage at 4 ℃; the survival rate in artificial gastric juice for 3 hours was 85.2%±2.1%; the diameter of the antibacterial zone is （15.2±0.8） mm， indicating good tolerance and antibacterial activity. Meanwhile， "adding LP-01 can significantly improve the intestinal barrier function of mice. Safety experiments have shown that LP-01 has no adverse health effects at a dose of

1010 CFU·kg-1 bw; except for LP-02 showing resistance to tetracycline and BL-01 showing resistance to erythromycin， all other strains were sensitive to the 8 tested antibiotics and no transferable resistance genes were detected. Conclusion： This study can provide scientific basis for establishing a probiotic safety assessment system and quality control standards， as well as the application of probiotics in infant and toddler food.

Keywords： infant and toddler food; probiotics; functional characteristics; security; quality control

隨著人們對嬰幼兒營養(yǎng)和健康的日益關(guān)注，益生菌嬰幼兒食品逐漸成為市場熱點(diǎn)。益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)免疫力，對嬰幼兒的健康成長具有重要作用。然而，在食品中應(yīng)用益生菌仍面臨諸多挑戰(zhàn)。田云等[1]研究表明，益生菌在加工和貯存過程中易受溫度、pH值、水分活度等因素影響，導(dǎo)致存活率和功能活性顯著降低；崔欣美等[2]指出，益生菌的功能穩(wěn)定性受食品基質(zhì)類型和加工工藝的影響較大。在安全性方面，陳瀟等[3]研究發(fā)現(xiàn)，部分嬰幼兒食品中可能存在潛在致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)，而屈鵬峰等[4]進(jìn)一步指出，我國嬰幼兒食品益生菌的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)仍需完善。目前研究主要集中在益生菌對促進(jìn)嬰幼兒健康的作用[5]，而對其在不同食品基質(zhì)中的穩(wěn)定性機(jī)制、安全性評估和質(zhì)量控制的系統(tǒng)研究相對不足。因此，本文通過探討嬰幼兒食品中益生菌的功能特性和安全性，建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，旨在為其合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：30份市售嬰幼兒食品（配方奶粉、米粉、果泥等）；乳酸菌、雙歧桿菌和4種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株；Caco-2和RAW264.7細(xì)胞株。

實(shí)驗(yàn)動物：ICR小鼠、SD大鼠和SPF級BALB/c小鼠。

實(shí)驗(yàn)試劑：MRS培養(yǎng)基；TPY選擇性培養(yǎng)基；革蘭氏染色、DNA提取、PCR擴(kuò)增和ELISA試劑盒；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰酶消化液等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；JSM-7800F掃描電鏡，日本電子株式會社；Bio-Rad CFX96 PCR儀，美國伯樂公司；ABI 3730XL DNA測序儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

從30份市售嬰幼兒食品（配方奶粉、米粉和果泥各10份）中分離益生菌。稱取25 g樣品加入

225 mL無菌生理鹽水中均質(zhì)，然后進(jìn)行10倍系列稀釋（10-1～10-6），將稀釋后的樣液分別涂布于MRS和TPY選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h獲得純培養(yǎng)物。

1.3.2 菌株鑒定與分類

采用革蘭氏染色，并用掃描電鏡觀察菌株形態(tài)，進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)（觸酶、氧化酶活性，4～37℃生長特性和2.0%～6.5% NaCl耐受性）及API 50CH分析。提取基因組DNA，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增16S rDNA，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min、30個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s）、72 ℃終末延伸10 min，測序并進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)庫比對。

1.3.3 存活率研究

將1.3.2中篩選出的2株植物乳桿菌（LP-01、LP-02）和2株乳雙歧桿菌（BL-01、BL-02）分別接種于經(jīng)滅菌處理的嬰幼兒食品中，在4、25、37 ℃條件下儲存6個月，每月固定時間采樣測定其活菌數(shù)。

1.3.4 耐受性評價

將LP-01、LP-02、BL-01和BL-02分別進(jìn)行人工胃液（pH=3.0，處理3 h）和0.3%膽鹽（處理4 h）處理，測定菌株存活率。

1.3.5 抗菌活性與免疫調(diào)節(jié)功能研究

采用牛津杯法測定4株益生菌菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。將金黃色葡萄球菌（1×106 CFU·mL-1）均勻涂布于LB瓊脂平板，在平板上放置牛津杯，并分別加入4株益生菌菌株的菌液200 μL，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。將小鼠脾臟細(xì)胞與4株益生菌菌株共培養(yǎng)48 h后，檢測細(xì)胞因子水平，分析吞噬能力和炎癥因子表達(dá)。

1.3.6 腸道菌群研究

設(shè)置對照組（PBS緩沖溶液）、配方奶粉組（LP-01，109 CFU·mL-1）、米粉組（LP-01，109 CFU·mL-1）和果泥組（LP-01，109 CFU·mL-1）4組。每組隨機(jī)分配8只BALB/c小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃28 d后，測定結(jié)腸黏膜厚度、杯狀細(xì)胞數(shù)量、緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1）的表達(dá)水平，同時檢測血清中脂多糖和D-乳酸含量。

1.3.7 安全性評估

基于前期急性毒性試驗(yàn)（一次性給予

1010 CFU·mL-1的菌懸液，灌胃劑量10 mL·kg-1）結(jié)果確定劑量范圍。采用LP-01菌株進(jìn)行亞慢性毒性試驗(yàn)，將大鼠隨機(jī)分為對照組（生理鹽水）、低劑量組

（108 CFU·kg-1 bw）、中劑量組（109 CFU·kg-1 bw）和高劑量組（1010 CFU·kg-1 bw），連續(xù)灌胃90 d。采用電子天平測定大鼠體重；利用全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic Pyruvic Transaminase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic Oxaloacetic Transaminase，AST）活性；根據(jù)肝臟重量與體重的百分比計(jì)算肝臟系數(shù)。監(jiān)測相關(guān)指標(biāo)并建立質(zhì)量控制體系。

1.3.8 抗生素耐藥性分析

采用瓊脂稀釋法測定4株益生菌對8種抗生素的最小抑菌濃度。將益生菌懸液（106 CFU·mL-1）分別接種到含不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。同時采用PCR技術(shù)檢測抗性基因。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離和鑒定結(jié)果分析

從30份市售嬰幼兒食品中分離獲得20株優(yōu)勢菌株，通過16S rDNA測序和生理生化特性分析，最終篩選出4株優(yōu)勢菌株，包括2株植物乳桿菌（LP-01、LP-02）和2株乳雙歧桿菌（BL-01、BL-02）。

2.2 不同儲存條件對益生菌存活率的影響

如圖1所示，在不同溫度條件下，4株益生菌存活率均隨儲存時間延長呈下降趨勢。其中，LP-01在4 ℃條件下儲存6個月的存活率最高；在37 ℃條件下，各菌株的存活率下降趨勢明顯，且儲存3個月后，所有菌株存活率均不符合益生菌食品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此未繼續(xù)監(jiān)測4～6月的數(shù)據(jù)。

圖1 不同溫度條件下4株益生菌的存活率變化

2.3 益生菌的耐受性分析

由圖2可知，4株益生菌在人工胃液（pH=3.0）中培養(yǎng)3 h后，LP-01的存活率最高，為85.2%±2.1%，其次是LP-02（82.5%±2.0%）和BL-01（81.3%±1.9%），BL-02的存活率最低，為79.8%±2.2%。在0.3%膽鹽處理4 h后，LP-01菌株的存活率最高，為78.5%±2.3%，其次是LP-02（76.2%±2.0%）和BL-01（74.3%±1.9%），BL-02的存活率最低，為77.2%±2.4%。表明篩選的4株優(yōu)勢菌株具有良好的胃酸和膽鹽耐受性。

2.4 益生菌的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能評價

由圖3可知，4株益生菌株對金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中，LP-01抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（15.2±0.8）mm，其次是LP-02，抑菌圈直徑為（14.5±0.7）mm，而BL-01和BL-02的抑菌圈直徑分別為（13.8±0.6）mm和（12.5±0.5）mm。

免疫調(diào)節(jié)功能測定結(jié)果見圖4，4株益生菌與脾臟細(xì)胞共培養(yǎng)后均能誘導(dǎo)IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生，其中LP-01誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)水平最高，其次是LP-02。而BL-01和BL-02的誘導(dǎo)能力相對較弱。結(jié)果表明，所篩選的益生菌株具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能，其中植物乳桿菌的免疫調(diào)節(jié)能力優(yōu)于乳雙歧桿菌。

2.5 益生菌對腸道屏障功能的影響

如圖5所示，LP-01菌株能有效改善小鼠腸道屏障功能。以配方奶粉組為例，與對照組相比，在結(jié)構(gòu)指標(biāo)方面，結(jié)腸黏膜厚度從80%升高至100%，杯狀細(xì)胞數(shù)量從80%升高至110%；在分子水平上，連接蛋白表達(dá)量由80%上升至140%；在屏障功能方面，血清脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）水平從80%降低至45%，D-乳酸水平從80%降低至45%。米粉組和果泥組也表現(xiàn)出類似的趨勢，但效果不及配方奶粉組。

2.6 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果分析

由表1可知，各劑量組大鼠體重增長率、肝功能指標(biāo)ALT和AST及肝臟系數(shù)與對照組均無顯著差異（p＞0.05），表明LP-01在1010 CFU·kg-1 bw的劑量下，無不良健康效應(yīng)，該菌株在這個劑量水平以下使用是安全的。

2.7 抗生素耐藥性分析

如表2所示，LP-02對四環(huán)素（32 μg·mL-1）和BL-01對紅霉素（64 μg·mL-1）表現(xiàn)出耐藥性，其他菌株對所測試的8種抗生素均敏感。PCR檢測結(jié)果顯示未檢出任何可轉(zhuǎn)移抗性基因。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地探討了嬰幼兒食品中益生菌的功能特性和安全性。從不同食品基質(zhì)中篩選出的乳酸菌和雙歧桿菌菌株表現(xiàn)出良好的耐受性，具有顯著的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能。動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，益生菌可增強(qiáng)腸道屏障功能。安全性評估顯示篩選出的菌株無毒性，并據(jù)此建立完整的質(zhì)量管理體系，為益生菌在嬰幼兒食品中的應(yīng)用提供參考。

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