基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和便攜式拉曼光譜儀鑒定模擬老化紡織品中的靛藍(lán)染料

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；便攜式拉曼光譜；靛藍(lán)；紡織品老化

天然纖維的使用由來(lái)已久，其中應(yīng)用最廣泛的是取自植物種籽的棉纖維和取自動(dòng)物分泌物的絲纖維。隨著染織技術(shù)的進(jìn)步，采用天然染料染織棉和絲等天然纖維可以獲得圖案豐富、風(fēng)格迥異的染織物。靛藍(lán)（Indigo）作為來(lái)源最廣泛的藍(lán)色系天然植物染料，不僅是人類(lèi)所知的最古老染料之一，也因其具有優(yōu)越的染色性能和耐光性能被廣泛應(yīng)用于織物的染色加工。然而，在保存過(guò)程中，由于潮濕[1]和光照[2]等因素的影響，紡織品中天然染料容易發(fā)生老化褪色現(xiàn)象，給染料的識(shí)別鑒定帶來(lái)困難，也嚴(yán)重影響紡織品文物的保護(hù)與修復(fù)。

在紡織品文物的分析方法的研究中，對(duì)纖維種類(lèi)[3]、纖維結(jié)構(gòu)[4]和加工技藝的探索方法已經(jīng)相當(dāng)成熟。然而，對(duì)于其中所用的特定天然染料的識(shí)別鑒定仍存在困難，尤其是紡織品中老化染料的識(shí)別鑒定。目前，雖然有部分技術(shù)，如拉曼光譜[5-6]、光纖反射光譜[7]、原位紫外可見(jiàn)-熒光法[8-9]以及高效液相色譜[10-12]等，已被成功應(yīng)用于紡織品中天然染料的鑒定，但由于可供分析的文物紡織品樣品量極少，對(duì)鑒定方法的分離效果、精確度和靈敏度都提出了更高的要求。相對(duì)而言，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)顯示出極大的優(yōu)勢(shì)。例如，研究者采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定紡織品中的茜草、蘇木、紅花、姜黃和黃檗等天然染料[13-15]，并采用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了唐代紡織品文物中茜草和紫草染料的識(shí)別[16]。此外，非侵入式檢測(cè)手段也成為研究者關(guān)注的對(duì)象[17]，其中，便攜式拉曼光譜技術(shù)為珍貴文物的無(wú)損檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了便利。對(duì)于靛藍(lán)染料，雖然已有研究探討了其在溶液和凝膠介質(zhì)中的光老化降解產(chǎn)物及機(jī)理[1，18-19]，但缺乏對(duì)染織品中的靛藍(lán)在光老化和酸老化后的識(shí)別檢測(cè)研究。

為模擬紡織品文物在館藏和墓葬中的保存環(huán)境，本研究對(duì)現(xiàn)代紡織品棉和絲進(jìn)行靛藍(lán)模擬染色，并進(jìn)行紫外光老化和酸老化處理。采用高效快捷的超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Ultra-highperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight-mass" spectrometry， UPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)以及原位無(wú)損的便攜式拉曼光譜（Portable Raman spectroscopy， P-RS）技術(shù)，對(duì)老化前后棉料和絲料中的靛藍(lán)成分進(jìn)行分析檢測(cè)。本研究結(jié)果為古代紡織品老化后靛藍(lán)染料的檢測(cè)提供了思路，也為相關(guān)文物的保護(hù)和修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Zeiss Gemini 500 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（卡爾蔡司（上海）管理有限公司）；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（中國(guó)教學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；R785-105-ST 便攜式拉曼光譜儀（常州先舟環(huán)?？萍加邢薰荆蛔贤夤饫匣洌ㄗ灾疲?。

靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品（純度gt;98%，上海麥克林試劑公司）；靛紅標(biāo)準(zhǔn)品（純度gt;98%，上海陶術(shù)生物科技有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；NaOH（分析純，天津科茂化學(xué)試劑有限公司）；濃HCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%）和氯仿（分析純）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；保險(xiǎn)粉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm），由Milli-Q Integral 10 純水儀（美國(guó)密理博公司）制備。未染色棉布（100%棉）及絲綢（100%絲）購(gòu)于本地市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靛藍(lán)染色模擬樣品的制備

靛藍(lán)是一種還原性染料，微溶于水，直接上染的染色效果和色牢度較差。參照古代傳統(tǒng)染色工藝，將靛藍(lán)加入到2 g/L NaOH 溶液中，再分批加入適量保險(xiǎn)粉，攪拌溶解得到靛白隱色鹽溶液，其中，所加入NaOH、保險(xiǎn)粉與靛藍(lán)的質(zhì)量比為2∶5∶2。將未染色的棉布和絲綢清洗后平整浸入靛白隱色鹽溶液染色，布料整體浸于液面下以保證染色均勻。浸泡45 min 后取出，避光自然氧化晾干，洗去染色棉布和絲綢的浮色，并裁剪成75 mm×25 mm 大小的長(zhǎng)條型棉料和絲料樣品。

紫外光老化：搭建紫外光老化裝置，長(zhǎng)36 cm、寬18 cm、高22 cm，樣品臺(tái)與紫外燈的垂直距離為15 cm，選用波長(zhǎng)為340 nm 的UVA 燈管（20 W）；參考文獻(xiàn)[14]的方法對(duì)染色后的棉料和絲料樣品進(jìn)行紫外光加速老化實(shí)驗(yàn)，持續(xù)照射20 d 后取出，期間每隔12 h 更換樣品的位置以保證光照均勻。

酸老化：配制pH=2 的HCl 溶液，將靛藍(lán)染色的棉料和絲料樣品分別浸入酸液中，密封浸泡20 d 后取出，用超純水重復(fù)清洗至pH=7，晾干備用。

1.2.2 萃取溶劑和萃取方法的優(yōu)化

靛藍(lán)在大多數(shù)常見(jiàn)溶劑中的溶解度有限，而在DMF 中具有較好的溶解性能，因此采用DMF 作萃取劑或剝色劑提取樣品中的靛藍(lán)。然而，靛藍(lán)的同分異構(gòu)體靛玉紅在DMF 中也具有較好的溶解度，這在一定程度上干擾了靛藍(lán)的準(zhǔn)確識(shí)別。鑒于此，本研究采用兩步萃取法萃取靛藍(lán)：（1）采用DMF 從靛藍(lán)染色的棉料和絲料中分別萃取目標(biāo)化合物，過(guò)濾得到濾液后用氮?dú)獯蹈桑唬?）加入氯仿對(duì)殘留物進(jìn)行復(fù)溶處理，采用0.22 μm 的針頭式濾器過(guò)濾以獲取靛藍(lán)的氯仿溶液。將此溶液引入色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，每類(lèi)樣品重復(fù)3～5 次取樣分析。

1.2.3 掃描電子顯微鏡測(cè)試

Zeiss Gemini 500 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）分辨率最大可達(dá)0.6 nm，加速電壓在0.02～30 kV 范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)。將待測(cè)棉料和絲料樣品裁剪成1 cm×1 cm 的小塊，平整鋪排到貼有導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上，鍍金110 s 后進(jìn)樣。使用SE2 探測(cè)器，工作距離為8.8 mm，分別在放大倍數(shù)為150 倍和1500 倍下觀察紫外光老化前后以及酸老化前后的棉料和絲料樣品的表面形貌。

1.2.4 UPLC-Q-TOF-MS測(cè)試條件

ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱溫為25 ℃；流動(dòng)相A 為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，流速為0.15 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min， 90%～80% A；1～6 min， 80%～20% A；6～11 min， 20% A；11～16 min， 20%～90% A；16～18 min， 90% A。

采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測(cè)。離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流量為800 L/h，毛細(xì)管電壓為1.5 kV，錐流量為50 L/h；采用MSE 數(shù)據(jù)采集模式，設(shè)置m/z 50～2000 范圍內(nèi)的高性能全掃描檢測(cè)。采用亮氨酸腦啡肽作為實(shí)時(shí)校正液。

1.2.5 P-RS測(cè)試條件

采用785nm波長(zhǎng)的光源，最大功率為650 mW，響應(yīng)范圍為100～1000 cm^–1，適用于現(xiàn)場(chǎng)和非侵入性檢測(cè)的需求。分別選取少量光老化處理以及酸老化處理前后的棉質(zhì)和絲質(zhì)紡織品樣品，采用便攜式拉曼光譜儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，得到拉曼光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同老化方式對(duì)棉料和絲料表面形貌及靛藍(lán)染色的影響

通過(guò)宏觀觀察和SEM 表征紫外光老化前后和酸老化前后靛藍(lán)染色棉料和絲料的表面形貌，結(jié)果如圖1 和圖2 所示。未老化靛藍(lán)染色的棉料（圖1A）和絲料（圖2A）呈現(xiàn)深藍(lán)色，纖維排列整齊。經(jīng)過(guò)紫外光加速老化后，兩者均出現(xiàn)了明顯的褪色或變色現(xiàn)象（圖1D 和2D），其中，絲纖維（圖2D）發(fā)生了較大程度的粉化，纖維強(qiáng)度顯著降低。與光老化相比，酸老化處理后的兩種纖維宏觀變化較?。▓D1G 和2G）。

SEM 結(jié)果進(jìn)一步揭示了纖維微觀結(jié)構(gòu)的差異。未老化靛藍(lán)染色的棉纖維（圖1B 和1C）為扁平帶狀，伴有天然卷曲，表面具有不規(guī)則凹陷，且不均勻地附著有帶狀的染料小分子；紫外光老化后（圖1E 和1F），棉纖維表面裂紋增多，纖維流失現(xiàn)象加??；酸老化處理后的棉纖維（圖1H 和1I），其表面纖維流失程度相較于光老化樣品有所減輕。對(duì)于靛藍(lán)染色的絲纖維，可觀察到未老化樣品（圖2B 和2C）纖維排列整齊，表面光滑，截面呈圓滑的三角形或多邊形；紫外光老化后，絲纖維不僅表面細(xì)小裂紋增多，還出現(xiàn)大量斷口（圖2E 和2F）；盡管酸老化處理后的絲纖維也呈現(xiàn)出更多的表面裂紋，但其仍然排列相對(duì)整齊（圖2H 和2I），可見(jiàn)絲纖維的酸老化程度弱于紫外光老化。因此，紫外光老化及酸老化對(duì)靛藍(lán)染色的棉料和絲料的表面形貌有不同程度的影響。與酸老化處理結(jié)果相比，紫外光老化后，靛藍(lán)染色的棉料和絲料纖維都發(fā)生了更顯著的變化，纖維變得更加脆弱，強(qiáng)度顯著降低。同時(shí)，棉纖維比絲纖維表現(xiàn)出更好的耐紫外光老化性能。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS 檢測(cè)棉料和絲料中的靛藍(lán)染料

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS 檢測(cè)靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的特征信息

為了確保老化紡織品中靛藍(lán)染料的準(zhǔn)確識(shí)別檢測(cè)，首先采用UPLC-Q-TOF-MS 檢測(cè)靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的特征信號(hào)，為老化前后模擬棉料和絲料樣品萃取液中的靛藍(lán)成分提供對(duì)照。如圖3A 所示，靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖（TIC）顯示出2 個(gè)較強(qiáng)信號(hào)峰，其中，保留時(shí)間為7.24 min 的峰被確認(rèn)為靛藍(lán)的特征信號(hào)峰；在UPLC-Q-TOF-MS 的提取離子流圖（EIC）中只在7.24 min 處有單峰，并在正離子模式下成功識(shí)別出其對(duì)應(yīng)的靛藍(lán)的準(zhǔn)分子離子峰（m/z 263.0830）。在總離子流圖中7.24 min 處色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜圖如圖3B 所示，校正后的豐度最大的碎片離子峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比為263.0830，與單同位素精確質(zhì)量數(shù)263.0821 相近，與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的誤差值為3.4×10^–6。因此，推測(cè)7.24 min 處的色譜峰為靛藍(lán)的特征信號(hào)峰。上述結(jié)果為后續(xù)樣品中靛藍(lán)的定性分析提供了重要依據(jù)。

2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS 檢測(cè)紫外光老化和酸老化前后棉料和絲料萃取液中的靛藍(lán)

按照1.2.2 節(jié)的方法，對(duì)紫外光老化以及酸老化前后的靛藍(lán)染色棉料樣品進(jìn)行萃取處理，并通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS 檢測(cè)萃取液中的靛藍(lán)成分，得到的TIC 圖如圖4A 所示。在靛藍(lán)染色棉料樣品的未老化、紫外光老化和酸老化圖譜（圖4A）中，靛藍(lán)萃取液的TIC 圖都顯示在7.25 min 附近存在明顯的色譜峰，其一級(jí)質(zhì)譜圖（圖4B～4D）與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品（圖3B）一致，均可觀察到正離子模式下靛藍(lán)的準(zhǔn)分子離子峰（分別為m/z 263.0833、263.0845 和263.0845），按照2.2.1 節(jié)所述方法進(jìn)行誤差計(jì)算，最終可以判斷未老化、光老化和酸老化的3 個(gè)棉料樣品中7.25 min 附近的色譜峰為靛藍(lán)的色譜峰。

對(duì)紫外光老化前后以及酸老化前后的靛藍(lán)染色絲料樣品，同樣采用1.2.2 節(jié)的方法進(jìn)行萃取，采用UPLC-Q-TOF-MS 仍能檢測(cè)到萃取液中存在靛藍(lán)成分。如圖5A 所示，在未老化、紫外光老化和酸老化絲料樣品中，靛藍(lán)萃取液的TIC 圖顯示在7.24 min 附近同樣存在明顯的色譜峰，按照2.2.1 節(jié)所述方法進(jìn)行誤差計(jì)算，其一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果（圖5B～5D）（分別為m/z 263.0832、263.0795 和263.0839）符合靛藍(lán)的準(zhǔn)分子離子峰特征，實(shí)現(xiàn)了靛藍(lán)成分的檢測(cè)。除此之外，光老化絲料的萃取液中還檢測(cè)到靛藍(lán)的光老化產(chǎn)物靛紅（m/z 148.0384）。采用與靛藍(lán)一致的UPLC-Q-TOF-MS 測(cè)試條件檢測(cè)靛紅標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)在4.45 min 處存在色譜峰（圖6A），在正離子模式下成功識(shí)別出其對(duì)應(yīng)的靛藍(lán)的準(zhǔn)分子離子峰。此峰對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜圖（圖6B）顯示，校正后的豐度最大的碎片離子峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比為148.0384，與單同位素精確質(zhì)量數(shù)148.0399 相近，可以判斷為靛紅。光老化后的棉料萃取液中靛紅的信號(hào)強(qiáng)度較弱，表明絲料中的靛藍(lán)在紫外光老化條件下更易發(fā)生老化反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.3 P-RS 檢測(cè)老化前后棉料和絲料中的靛藍(lán)

為建立更快速的無(wú)損檢測(cè)方法，采用P-RS 對(duì)老化前后棉料和絲料中的靛藍(lán)成分進(jìn)行分析。對(duì)未染色且未老化的棉料和絲料進(jìn)行785 nm 激發(fā)光源下的P-RS 檢測(cè)，結(jié)果如圖7 中譜線d 和譜線e 所示，未染色的棉料和絲料樣品的拉曼譜圖呈現(xiàn)平直的信號(hào)，未觀察到明顯的拉曼峰。對(duì)靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品、未老化的靛藍(lán)染色棉料和絲料進(jìn)行P-RS 檢測(cè)，結(jié)果表明，在靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的P-RS 圖譜中能夠清晰地觀察到位于754、670、545 和264 cm^–1 處的特征拉曼峰（圖7 譜線a），在未老化的棉料（圖7A 譜線b）和絲料（圖7A 譜線c）染色樣品中也能檢測(cè)到相似的拉曼信號(hào)。

無(wú)論是老化后的棉料（圖8A）還是絲料（圖8B）樣品，其拉曼光譜顯示出相似的規(guī)律。在紫外光老化后的樣品中，雖然能夠檢測(cè)到靛藍(lán)的拉曼信號(hào)（圖8A 和8B，譜線c），但其信號(hào)強(qiáng)度相較于未老化樣品（圖8A 和8B，譜線b）有所減弱，其中絲料的信號(hào)強(qiáng)度（圖8B 譜線c）降低尤為顯著（尤其是545 cm^–1 處的信號(hào)峰），這表明絲纖維上的靛藍(lán)相對(duì)于棉纖維上的靛藍(lán)更不耐紫外光老化，此結(jié)果與圖1 和圖2 中靛藍(lán)染色纖維實(shí)物圖像和SEM 圖像結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)酸老化的樣品檢測(cè)結(jié)果顯示（圖8A 和8B，譜線a），相較于未老化樣品（圖8A 和8B，譜線b），在755、669、545 和258 cm^–1 附近的靛藍(lán)的拉曼信號(hào)更突出，這可能與酸老化導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)變化或染料分子暴露有關(guān)。上述結(jié)果表明， P-RS 可以作為一種快速的無(wú)損檢測(cè)方法檢測(cè)老化前后棉料和絲料中的靛藍(lán)成分。

以上分析結(jié)果表明， UPLC-Q-TOF-MS 和P-RS 兩種檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)。P-RS 的優(yōu)點(diǎn)在于可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和定性分析，并且對(duì)檢測(cè)樣品的破壞程度較??；不足之處在于對(duì)真實(shí)紡織品文物所處環(huán)境要求較高。UPLC-Q-TOF-MS 需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，是破壞式分析，但UPLC-Q-TOF-MS 靈敏度高，真實(shí)紡織品文物所處環(huán)境的復(fù)雜程度對(duì)其限制較小。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，建議將兩種分析方法結(jié)合使用，以實(shí)現(xiàn)多種環(huán)境下靛藍(lán)的有效檢測(cè)。

3 結(jié)論

為了更精準(zhǔn)模擬古代紡織品文物在實(shí)際保存環(huán)境下的潛在老化情況，本研究選取古代染織最常用的靛藍(lán)染料對(duì)棉料和絲料紡織品進(jìn)行染色，并通過(guò)紫外光照射和HCl 溶液（pH=2）處理，模擬紡織品的老化過(guò)程，獲得用于識(shí)別檢測(cè)的靛藍(lán)染色模擬老化樣品。在此基礎(chǔ)上，采用UPLC-Q-TOF-MS 和P-RS 對(duì)模擬樣品中的靛藍(lán)染料進(jìn)行檢測(cè)分析，建立了高效的UPLC-Q-TOF-MS 分離檢測(cè)方法，即以0.1%甲酸溶液和乙腈為流動(dòng)相，在18 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相比例的梯度調(diào)整。在此條件下，無(wú)論是光老化還是酸老化前后的棉料與絲料樣品，都能在靛藍(lán)萃取液中檢測(cè)到位于7.24 min 附近的中等強(qiáng)度的色譜峰。此色譜峰對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜圖在正離子模式下呈現(xiàn)出與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品相符的準(zhǔn)分子離子峰，證明了靛藍(lán)的存在。此外，在光老化后的絲料樣品中，還檢測(cè)到了分子量為148.0359 的物質(zhì)，證實(shí)是靛藍(lán)的光老化產(chǎn)物靛紅。同時(shí)，P-RS 分析結(jié)果顯示，在經(jīng)歷紫外光老化和酸老化后，依然可以檢測(cè)到紡織品中靛藍(lán)的特征信號(hào)峰，這為紡織文物樣品中靛藍(lán)染料的原位、無(wú)損檢測(cè)提供了有力支撐。值得注意的是，在紫外光老化后的絲料樣品中，靛藍(lán)的P-RS特征信號(hào)強(qiáng)度明顯降低，這表明絲料上的靛藍(lán)相較于棉料在紫外光老化過(guò)程中可能發(fā)生了更顯著的變化。酸老化后，無(wú)論是棉料樣品還是絲料樣品中的靛藍(lán)拉曼信號(hào)均表現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)。本研究通過(guò)模擬紡織品文物的保存環(huán)境，結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS 與P-RS 技術(shù)建立了高效且快速的靛藍(lán)染料鑒定方法，其中， P-RS 方法具有快速無(wú)損的特點(diǎn)，為紡織品文物中靛藍(lán)染料的原位檢測(cè)提供了有力支撐，而UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)具有高分辨率、低檢出限和高靈敏度的特點(diǎn)，為后續(xù)的相關(guān)定量分析研究提供了可能。

致謝 感謝西安交通大學(xué)分析測(cè)試中心白璐老師和劉佳老師在液質(zhì)聯(lián)用和拉曼分析中的幫助和支持。