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    福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本的蛋白質(zhì)組制備技術研究

    2025-02-07 00:00:00陸澳孟波趙佳威廖煥玥葉子弘方向趙洋
    分析化學 2025年1期
    關鍵詞:二甲苯切片特異性

    關鍵詞 福爾馬林固定石蠟包埋樣本;樣本制備;蛋白質(zhì)組;質(zhì)譜;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

    基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術在發(fā)現(xiàn)疾病診斷生物標志物和指導疾病分類治療方面發(fā)揮了重要的作用[1-3]。離體組織樣本可能喪失生物功能和結(jié)構(gòu),為便于長期保存和分析,常采用福爾馬林固定劑處理,將其制備成福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織樣本[4-5]。FFPE 組織樣本關聯(lián)大量的臨床信息,對疾病研究至關重要。然而,組織樣本經(jīng)過甲醛固定和封蠟處理后,給后續(xù)的蛋白質(zhì)組學樣本制備帶來了挑戰(zhàn):組織樣本經(jīng)石蠟包裹,與外界完全隔離,經(jīng)甲醛固定后,樣本的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與核酸之間會發(fā)生交聯(lián)反應,降低蛋白質(zhì)的溶解性和酶解效率[6-7],同時,樣本的蛋白質(zhì)產(chǎn)生位置修飾,影響蛋白質(zhì)組鑒定的準確性。

    二甲苯(Xylene)常用于溶解石蠟[8],但由于其具有揮發(fā)性和毒性,被世界衛(wèi)生組織列為致癌物質(zhì)。為降低對研究人員健康的影響, Triton X-100 被開發(fā)用于替代二甲苯脫蠟[9]。FFPE 組織樣本蛋白提取過程中常用的裂解液包括RapiGest、三氟乙醇(TFE)和12 烷基硫酸鈉(SDS)。SDS 雖為強效細胞裂解劑,但與質(zhì)譜儀器不兼容,限制了其應用[10-11]。相比之下, RapiGest 和TFE 具備有效的蛋白裂解能力,并與質(zhì)譜儀器具有較好的兼容性。Coscia 等[12]以50% TFE/300 mmol/L Tris-HCl 為裂解液,完成了卵巢癌患者FFPE 蛋白質(zhì)組樣本的制備,通過質(zhì)譜分析共鑒定出4588 種蛋白質(zhì),體現(xiàn)了TFE 在蛋白質(zhì)組樣本制備中的有效性。RapiGest 是一種與質(zhì)譜兼容的酸不穩(wěn)定性表面活性劑,能夠增加疏水性蛋白或肽段的溶解度,提升蛋白質(zhì)酶解的效率[13-14]。Wu 等[15]建立了NanoTPOT 微量樣本制備方案,該方案在60 ℃條件下使用0.1% RapiGest 裂解細胞,從0.5 μg Hela 蛋白中鑒定出5474 種蛋白質(zhì)。目前,常使用的蛋白酶切方案包括過濾輔助樣品制備(FASP)技術[16]、原位酶切(iST)技術[17]和單體系固相增強樣品制備(SP3)技術[18-19]。FASP 酶切方案根據(jù)濾膜分子量大小截留蛋白質(zhì),適用于各種裂解液提取的蛋白質(zhì),但操作較繁瑣,在微量樣本中的效果可能有限。iST 和SP3 實驗方案都是在單一容器內(nèi)完成樣本制備,簡化了操作步驟,適用于微量樣本的蛋白質(zhì)組樣本制備。

    為了探索FFPE 蛋白質(zhì)組樣本的最佳制備條件,本研究選擇2 種脫蠟液(Triton X-100 和Xylene)、2 種裂解液(TFE 和RapiGest)以及3 種酶切方案(iST、SP3 和FASP)作為技術基礎,通過正交實驗設計了12 種樣本制備方案,分別為TTF(Triton-TFE-FASP)、TTI(Triton-TFE-iST)、TTS(Triton-TFE-SP3)、TRF(Triton-RapiGest-FASP)、TRI(Triton-RapiGest-iST)、TRS(Triton-RapiGest-SP3)、XTF(Xylene-TFEFASP)、XTI(Xylene-TFE-iST)、XTS(Xylene-TFE-SP3)、XRF(Xylene-RapiGest-FASP)、XRI(Xylene-RapiGest-iST)和XRS(Xylene-RapiGest-SP3)。從蛋白質(zhì)和肽段的鑒定深度、鑒定穩(wěn)定性和蛋白豐度的定量水平等方面對各方案進行了系統(tǒng)性評估。結(jié)果顯示, TTI 技術方案在所有測試條件中表現(xiàn)最好,具有突出的鑒定重復性和穩(wěn)定性,同時在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量上也表現(xiàn)最佳。本研究為FFPE 組織樣本的蛋白質(zhì)組學分析提供了技術參考。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    Easy-nLC 1200 納升級液相色譜儀、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀、NanoDrop OneC 微量紫外分光光度計和ThermoMixer C 金屬?。绹鳷hermo Scientific 公司);Vacufuge Plus 真空離心濃縮儀(德國Eppendorf 公司);JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

    Triton X-100非離子表面活性劑(≥99%)、TFE(≥90%)、氯乙酰胺(CAA,≥98%)和氨水(≥99%)(美國Sigma Aldrich 公司);二甲苯(≥99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);RepiGest 表面活性劑(≥98%,美國Waters 公司);Tris-HCl(≥99%, pH 8.0)、三(2-羧乙基)膦(TCEP,≥97%)、三氟乙酸(TFA,≥99%)、甲酸(FA,gt;99%)、乙醇和乙腈(質(zhì)譜純)(美國Thermo Scientific 公司);測序級胰蛋白酶(Trypsin,質(zhì)譜純,北京酶知源生物科技有限公司);SDB-RPS 固相萃取盤(色譜純,美國3M 公司)。

    1.2 樣本信息

    本研究使用的FFPE 組織切片樣本均來自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院,并已得到該醫(yī)院倫理委員會的批準(審批編號:NCC2020C-209)。參與此項研究的個體已簽署知情同意書,確保研究的倫理合規(guī)性。

    所采用的樣本均來自同一患者的肝細胞癌FFPE 組織切片,切片大小約為5 mm×5 mm,厚度為5 μm。

    1.3 FFPE 組織樣本的脫蠟與解交聯(lián)

    Triton X-100 脫蠟流程[9] (1)將FFPE 組織切片在60 ℃恒溫箱中處理10 min;(2)將切片轉(zhuǎn)移至1% Triton X-100 中(60 ℃),浸泡15 min,重復1 次;(3)用去離子水洗滌切片,每次浸泡5 min,重復2 次。

    二甲苯脫蠟流程[8] (1)FFPE 切片在60 ℃恒溫箱中處理10 min;(2)將切片轉(zhuǎn)移至二甲苯中,室溫浸泡10 min,重復1 次;(3)依次使用100%、95%、85%和75%乙醇溶液浸泡切片,其中前兩個濃度各重復2 次,每次浸泡時間為5 min;(4)將切片轉(zhuǎn)移至去離子水中浸泡5 min,重復2 次。

    蛋白質(zhì)提取和解交聯(lián)流程[12] (1)向樣品中加入50% TFE/300 mmol/L Tris-HCl 或0.1% RapiGest,進行水浴超聲處理1 h;(2)樣品置于90 ℃金屬浴中加熱90 min;(3)再次進行水浴超聲處理1 h。

    1.4 蛋白質(zhì)酶切和肽段脫鹽

    FASP 酶切方案 (1)將樣品轉(zhuǎn)入截留分子量為30 kDa 的超濾離心管中,加入TCEP(5 mmol/L)和CAA(25 mmol/L)混合液至終體積為200 μL,置于37 ℃金屬浴中孵育1 h;(2)以16000 r/min 離心15 min,棄去濾過液,并更換套管;(3)加入1 μg Trypsin,在37 ℃金屬浴中酶切16 h,轉(zhuǎn)速為1500 r/min;(4)離心,收集酶切液。

    iST 酶切方案 (1)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至EP 管中,加入TCEP(5 mmol/L)和CAA(25 mmol/L)至終體積為200 μL,在37 ℃金屬浴中孵育1 h;(2)將液體樣品置于真空干燥機中,干燥至約20 μL;(3)加入1 μg Trypsin,在37 ℃金屬浴中酶切16 h,轉(zhuǎn)速為1500 r/min;(4)離心,收集上清液。

    SP3 酶切方案 (1)在蛋白樣品中加入TCEP(5 mmol/L)和CAA(25 mmol/L)至終體積為200 μL,在37 ℃金屬浴中孵育1 h;(2)加入經(jīng)去離子水清洗過的磁珠,再加入純乙醇,使乙醇含量超過50%,在24 ℃金屬浴中孵育5 min,轉(zhuǎn)速為1000 r/min;(3)17000 r/min 離心5 min,再置于磁力架上吸附磁珠,去除上清液;(4)加入200 μL 乙醇-水(80∶20, V/V)洗滌2 次;(5)加入1 μg Trypsin,在37 ℃金屬浴中孵育16 h,轉(zhuǎn)速為1500 r/min;(6)離心,然后再用磁力架吸附磁珠,收集上清液。在收集的各樣品酶切液中加入TFA 至終濃度為1%,待脫鹽。

    SDB-RPS-Tip 脫鹽 (1)將2 層SDB-RPS 膜轉(zhuǎn)移至100 μL 移液頭中,并用0.2% TFA 洗滌1 次;(2)將酶切液加至SDB-RPS-Tip 柱中,離心(4000 r/min, 1 min)去除廢液;(3)采用0.2% TFA 洗滌3 次;(4)采用5%氨水的ACN-ddH2O(80∶20,V/V)洗脫肽段。收集的肽段在真空離心濃縮儀中熱干,于–80 ℃保存,供LC-MS/MS 分析。

    1.5 LC-MS/MS分析

    使用EASY-nLC 1200系統(tǒng)與Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀進行分析。肽段在自制的C18 柱(內(nèi)徑為100 μm,柱長為30 cm)上分離。流動相A 為0.1% FA,流動相B 為80% ACN/0.1% FA。肽段以600 nL/min 的流速在135 min 內(nèi)洗脫。梯度洗脫程序如下:0~13 min, 3%~10% B;13~99 min, 10%~22% B;99~120 min, 22%~30% B;120~123 min, 35%~90% B;123~135 min, 90% B。MS1 和MS2 均使用Orbitrap 質(zhì)量分析器分析。MS1 掃描范圍為m/z 350~1550,分辨率為120000。全掃描的自動增益控制(AGC)目標設定為4×105,最大離子注入時間(MIT)為60 ms。選擇用于MS/MS 的前體離子的離子隔離寬度為m/z 1.6,在30%的標準化碰撞能量下進行碎裂。MS2 分辨率設定為15000, AGC 為5×104, MIT 為30 ms。前體離子的動態(tài)排除時間為18s。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用MaxQuant 軟件(版本號:2.0.3)[20]進行分析,在Uniprot 下載用于人類蛋白質(zhì)組檢索數(shù)據(jù)庫。MaxQuant 設置參數(shù)如下:蛋白水解酶為Trypsin,最大漏切位點為2;母離子質(zhì)量偏差為20 ppm (10–6),子離子質(zhì)量偏差為4.5 ppm;Carbamidomethyl (C)被選為固定修飾,可變修飾選擇甲硫氨酸氧化和N-乙?;?;錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)lt;1%,其它設置參數(shù)選擇默認值?;虮倔w(GO)富集分析使用R 語言的ClusterProfiler 軟件包[21]完成,顯著信號通路的選擇標準為plt;0.05。數(shù)據(jù)分析與可視化使用Perseus、Excel 和GraphPad Prism 等工具軟件完成。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 實驗方案設計

    本研究設計了一套正交實驗方案,系統(tǒng)地評價了不同前處理方案對FFPE 組織樣本蛋白質(zhì)組定性與定量分析結(jié)果的影響(圖1)。此方案包括2 種脫蠟方案(Triton X-100,標記為T;二甲苯,標記為X),2種裂解液(TFE,同樣標記為T;RapiGest,標記為R),以及3種酶切方案(FASP,標記為F;iST,標記為I;SP3,標記為S)。以上元素組合形成12種不同的處理組合,分別為TTF、TTI、TTS、TRF、TRI、TRS、XTF、XTI、XTS、XRF、XRI 和XRS。每種組合方式進行3次重復實驗,以確保實驗結(jié)果可靠。

    2.2 12種制備方案的蛋白質(zhì)組對比分析結(jié)果

    12種制備方案的平均蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量范圍在1906~3194 之間,其中TTI 方案的平均蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量最多,達到3194 種蛋白質(zhì),比鑒定數(shù)最少的XRF 方案提升了1.68 倍(圖2)。在3 種酶切方案中, iST 酶切方案(–I)鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量和肽段數(shù)量均明顯優(yōu)于SP3(–S)和FASP(–F)酶切方案,其中, FASP 酶切方案鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量最少。觀察到TTI-TTS-TTF、TRI-TRS-TTF、XTI-XTS-XTF 和XRI-XRS-XTF 這4 種比較組合中趨勢一致, –I 組的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量和肽段鑒定數(shù)量都優(yōu)于–S 組和–F 組, –F 組最低(圖2A)。同時,觀察到使用TFE(T)作為裂解液的效果明顯優(yōu)于RapiGest(R),例如,在TTI 與TRI、TTS 與TRS 等的對比中,選用TFE(-T-)的組合普遍優(yōu)于RapiGest(-R-)。此外,無論選擇Triton X-100 還是二甲苯作為脫蠟液,對FFPE 組織樣本的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果影響較小,如TTI 與XTI、TTS 與XTS 等的比較顯示,蛋白質(zhì)和肽段鑒定數(shù)量之間的差異較小。

    2.3 12 種制備方案的蛋白鑒定情況對比分析結(jié)果

    通過韋恩圖對比分析,對12 種制備方案的蛋白鑒定情況進行了系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明,使用Triton X-100 (T–)和二甲苯(X–)作為脫蠟液的差異較小,在各組配對方案中,如TTI-XTI 和TTS-XTS 等,不同脫蠟液特異性鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量占比通常低于7%,表明2 種脫蠟方法之間的差異不顯著(圖3A)。相比之下, 2種不同的裂解液TFE(-T-)和RapiGest(-R-)之間的差異較為明顯。在配對組,如TTI-TRI 和TTS-TRS 中,特異性鑒定蛋白質(zhì)的占比大部分超過13%,其中, RapiGest(-R-)組的特異性鑒定蛋白質(zhì)占比在9.10%~14.40%之間,而TFE(-T-)組在18.38%~30.22%之間(圖3B)。上述結(jié)果表明, TFE 裂解液(-T-)在蛋白質(zhì)組鑒定中具有明顯優(yōu)勢。同時,在保持裂解液和脫蠟方式不變的情況下, iST(–I)酶切方案的特異性鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量顯著高于SP3(–S)和FASP(–F)酶切方案(圖3C)。綜上, TFE 和iST 酶切技術可顯著提升FFPE 組織樣本的蛋白質(zhì)組鑒定效果,而脫蠟方式對蛋白質(zhì)組鑒定的影響較小。

    2.4 蛋白質(zhì)定性結(jié)果的重復性和穩(wěn)定性評估

    對12種制備方案的重復性和穩(wěn)定性進行了評估。采用各制備方案中3 次重復實驗均能鑒定到的蛋白質(zhì)的占比作為評估制備方案重復性的關鍵指標。在12 種方案中, 10 種方案的蛋白質(zhì)鑒定重復占比超過70%,表現(xiàn)出較高的重復性(圖4A)。然而, XRF 和TRF 方案的重復性較低,分別只有65.71%和65.68%。在所有方案中, TTI 和XTI 方案表現(xiàn)最佳, 3 次重復實驗的鑒定百分比分別為77.02%和75.49%(圖4A)。以鑒定蛋白質(zhì)的變異系數(shù)(CV)衡量各制備方案的穩(wěn)定性,除TRF 和XRF 方案外,其它方案的CVlt;5%的蛋白質(zhì)占比均超過85%,顯示出較高的穩(wěn)定性(圖4B)。特別是TTI 方案,其CVlt;5%的蛋白質(zhì)占比高達89.41%,顯示出極高的穩(wěn)定性(圖4B)。以上結(jié)果表明,絕大部分制備方案不僅具備良好的重復性,還展現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性,其中, TTI 方案的表現(xiàn)最優(yōu)。

    2.5 蛋白質(zhì)定量檢測結(jié)果的穩(wěn)定性評估

    按照蛋白質(zhì)定量豐度對12 種制備方案進行降序排列。TTI 和XTI 方案鑒定的蛋白質(zhì)豐度明顯優(yōu)于其它方案,尤其在低豐度蛋白質(zhì)鑒定方面表現(xiàn)尤為突出(圖5A)。將蛋白質(zhì)豐度劃分為4個區(qū)間:lt;107,107~108, 108~109和≥109。與其它方案相比, TTI 和XTI 在lt;107 區(qū)間的蛋白質(zhì)較少,在107~109 區(qū)間的蛋白質(zhì)數(shù)量顯著增多,表明這2種方案可以提高對低豐度蛋白質(zhì)的鑒定水平,有助于增加蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量和提高定量準確性(圖5B)。

    為進一步評估各種制備方案的蛋白質(zhì)定量分析的效果,選取各制備方案中定量值最低的100 種蛋白質(zhì)。通過交叉比對,挑選在各組實驗中均為最低豐度范圍的IMPA1(P29218)和CBPQ(Q9Y646)2 種蛋白質(zhì)作為評價基準。TTI 和XTI 方案鑒定的2 種蛋白質(zhì)的豐度水平明顯高于其它處理組(圖5C 和5D)。以上結(jié)果表明, TTI 和XTI 方案對低豐度蛋白質(zhì)的鑒定性能優(yōu)異,這也可能是這2 種方案在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量和穩(wěn)定性方面顯著提升的主要原因。

    2.6 TTI方案在FFPE蛋白質(zhì)組研究中的性能優(yōu)勢

    上述分析結(jié)果證明, TTI 方案是FFPE 蛋白質(zhì)組研究的首選?;诟渭毎┑腇FPE 組織樣本,本研究重點考察了TTI 方案在蛋白質(zhì)組研究中的性能優(yōu)勢。比較了TTI 與TTS 和TTF方案的差異,發(fā)現(xiàn)TTI方案特異性鑒定出了565 種蛋白質(zhì),其中, 290種蛋白質(zhì)在3 次重復實驗中均被鑒定(圖6A)。GO 富集分析結(jié)果顯示,這290 種蛋白質(zhì)主要位于囊泡錨定復合體、溶酶體膜和液泡膜等細胞結(jié)構(gòu)(圖6B,電子版文后支持信息表S1),并參與翻譯調(diào)控、肝細胞增殖、上皮細胞增殖和肝臟形態(tài)發(fā)生等生物學過程。此外,在肝細胞增殖、上皮細胞增殖以及肝臟形態(tài)發(fā)生等過程的蛋白質(zhì)鑒定方面, TTI 方案較TTS 和TTF 方案能識別更多相關蛋白質(zhì)。

    通過對TTI 和TRI 的韋恩圖分析,研究了TFE(-T-)和RapiGest(-R-)2 種裂解液的效果。TTI 方案特異性鑒定出796 種蛋白質(zhì),其中397 種在3 次重復實驗中均被鑒定(圖6C)。GO 富集分析表明,這397 種蛋白質(zhì)主要定位于小亞基過程體、前核糖體和囊泡錨定復合體等細胞結(jié)構(gòu),涉及rRNA 加工、核酸運輸和肝臟形態(tài)發(fā)生等多個生物過程(圖6D,電子版文后支持信息表S2)。以上結(jié)果進一步證明了TFE 裂解液在提高FFPE 組織樣本蛋白質(zhì)鑒定性能方面具有顯著優(yōu)勢,為疾病臨床研究提供了重要線索。

    通過韋恩圖分析發(fā)現(xiàn), TTI 制備方案與TRI、TTS 和TTF 制備方案之間在蛋白質(zhì)特異性鑒定方面具有高度相關性, 205種蛋白質(zhì)在比較中顯示出重疊,占TTI-TTS-TTF 特異性鑒定總蛋白質(zhì)數(shù)目的70.69%。表明TTI 技術鑒定的特異性蛋白質(zhì)具有高度獨特性(圖6E)。

    綜上所述,無論是基于iST酶切方案,還是基于TFE裂解液的TTI 技術,都顯著提升了FFPE 蛋白質(zhì)組的分析性能,特異性鑒定出超過200種蛋白質(zhì),這為肝細胞癌的發(fā)展機制提供了一個更加系統(tǒng)和全面的蛋白質(zhì)組圖譜,對于臨床FFPE組織樣本的蛋白質(zhì)組研究具有重要的價值。

    3 結(jié)論

    本研究通過正交實驗方法設計了12種樣本制備方案,涉及脫蠟液、裂解液和酶切方案,以選擇最適合FFPE 蛋白質(zhì)組分析的實驗方法。結(jié)果表明, Triton X-100和二甲苯作為脫蠟液對蛋白質(zhì)組分析的影響較小,可使用Triton X-100替代二甲苯進行脫蠟。在裂解液方面, TFE 相較于RapiGest 展現(xiàn)出更高的蛋白質(zhì)和肽段鑒定效率,并在特異性蛋白質(zhì)鑒定方面表現(xiàn)更優(yōu)。在酶切方案的比較中, iST方案在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定數(shù)目及特異性蛋白質(zhì)鑒定方面顯著優(yōu)于SP3 和FASP 方案。

    綜合評估結(jié)果,推薦Triton X-100、TFE 和iST酶切方案的組合方案(TTI),此組合方案在蛋白質(zhì)和肽段鑒定數(shù)量、重復性、穩(wěn)定性和低豐度蛋白質(zhì)鑒定等多個方面表現(xiàn)出卓越性能。TTI 方案通過特定蛋白質(zhì)鑒定和信號通路富集分析,成功鑒定出200多種具有方法特異性的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)在細胞生長、基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用,證明TTI 技術能夠提供更全面的蛋白質(zhì)組學信息,可為臨床研究的深入進行提供技術支持。

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