利用冷凍電子斷層掃描技術(shù)探究超聲對(duì)紅細(xì)胞膜的影響

關(guān)鍵詞 紅細(xì)胞膜；超聲；冷凍電子斷層掃描

超聲波技術(shù)已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的強(qiáng)大工具，為臨床診斷和治療提供了一種非侵入性方法，能夠深入組織并與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相互作用，在成像、靶向藥物輸送、基因治療甚至組織工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1-3]。超聲波對(duì)生物組織的影響主要通過機(jī)械力介導(dǎo)，例如剪切應(yīng)力和空化效應(yīng)[4-6]，這些影響取決于超聲處理的參數(shù)，包括頻率、功率和持續(xù)時(shí)間，因此，了解超聲波對(duì)細(xì)胞膜的具體影響至關(guān)重要[7-8]。

人紅細(xì)胞因其簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)與高度專業(yè)化的功能，是研究最多的細(xì)胞類型之一。紅細(xì)胞膜由磷脂雙分子層及膜蛋白組成，并由細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)支撐，這對(duì)于維持細(xì)胞的靈活性和結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要[9-12]。超聲治療過程中引起的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜嚴(yán)重的功能障礙，包括變形能力下降和膜通透性改變等[13-16]。因此，研究超聲波對(duì)紅細(xì)胞膜的影響不僅有助于了解治療性超聲波應(yīng)用中的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)于探索操縱細(xì)胞膜用于治療目的的新方法非常重要[13]。

除了紅細(xì)胞外，脂質(zhì)體也是超聲研究中的重要模型體系。脂質(zhì)體作為一種模仿生物膜結(jié)構(gòu)的納米載體，被廣泛用作藥物輸送載體，如作為封裝治療劑的人工囊泡[17-18]。在脂質(zhì)體表面修飾特定蛋白，可以增強(qiáng)靶向能力。超聲波作用于脂質(zhì)體會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和表面特性，特別是脂質(zhì)體表面蛋白的分布和功能[19-20]，這種作用可被利用以增強(qiáng)脂質(zhì)體的靶向能力，從而提高藥物輸送的有效性和特異性[21-23]。

近年來，關(guān)于超聲技術(shù)對(duì)細(xì)胞和脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)影響的研究取得了一系列進(jìn)展。已有研究表明，超聲處理可以引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化和通透性增加等現(xiàn)象[24-26]。然而，超聲處理對(duì)膜蛋白和磷脂雙分子層間的相互作用及細(xì)胞膜-骨架的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步的探究，這些分子水平的變化對(duì)基于超聲的腫瘤療法的探索和診斷工具的開發(fā)具有重要影響[27-30]。

對(duì)細(xì)胞膜及脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的研究通常使用多種高分辨率成像技術(shù)，如熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、原子力顯微鏡和冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）等。近年來， Cryo-ET 技術(shù)在生物膜結(jié)構(gòu)研究中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠在接近天然狀態(tài)下觀察生物膜的高分辨結(jié)構(gòu)，捕捉超聲作用下的細(xì)微結(jié)構(gòu)變化。本研究采用Cryo-ET 技術(shù)，旨在提供超聲波影響細(xì)胞膜精細(xì)結(jié)構(gòu)的直接證據(jù)，為深入理解膜結(jié)構(gòu)在超聲作用下的變化提供支持[20，31-32]?？疾炝瞬煌某暪β仕胶吞幚沓掷m(xù)時(shí)間如何影響細(xì)胞骨架從紅細(xì)胞膜上的分離以及細(xì)胞膜蛋白在磷脂雙分子層上的脫落和重組，通過分析這些變化，有助于增強(qiáng)對(duì)超聲誘導(dǎo)的膜和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制的理解以及優(yōu)化超聲在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中的進(jìn)一步應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai G² F20 200 kV 冷凍透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI 公司）；K2 直接電子探測(cè)相機(jī)（美國(guó)Gatan 公司）；Vitrobot Mark Ⅳ 快速投入式冷凍制樣儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；SOLARUS-950 等離子體清洗系統(tǒng)（美國(guó)Gatan 公司）；TGL-21M 高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-2200DE型臺(tái)式數(shù)字超聲波清洗機(jī)（昆山舒美超聲儀器有限公司）；R1.2/1.3 300 目多孔碳膜銅網(wǎng)（德國(guó)Quantifoil公司）。

NaCl、KCl、KH₂PO₄ 和Na₂HPO₄·12H₂O（分析純，北京化工廠）；多聚L-賴氨酸溶液（質(zhì)量濃度1 g/L，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；5nm 膠體金顆粒（西安瑞禧生物科技有限公司）。

1.2 人紅細(xì)胞膜的獲取

取健康成年志愿者的末梢血10 μL，在磷酸鹽緩沖液（137 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 1.8 mmol/LKH₂PO₄， 10 mmol/L Na₂HPO₄， pH 7.4）中離心（1000 r/min， 2 min）、清洗5次，棄去上清液，在管底收集干凈的人紅細(xì)胞，加入1 mL 低滲磷酸鹽緩沖液，誘導(dǎo)人紅細(xì)胞完全溶血10 min，然后在23000 r/min 下離心10 min，用低滲磷酸鹽緩沖液清洗，反復(fù)離心、清洗5 次，棄去上清液，收集人紅細(xì)胞膜，加入1mL 磷酸鹽緩沖液，備用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程均在4 ℃下進(jìn)行。

1.3 超聲波處理紅細(xì)胞膜

使用泡沫浮漂將包含膜懸浮液的離心管固定在裝滿冰水混合物的燒杯中，放置在超聲波清洗機(jī)內(nèi)。固定超聲頻率為40kHz，設(shè)置超聲功率在40～100 W 之間，處理時(shí)間在1～5 min 之間。對(duì)照組同樣放置在裝滿冰水混合物的燒杯中，未進(jìn)行超聲處理。

1.4 冷凍樣品的制備

通過等離子清洗系統(tǒng)對(duì)載網(wǎng)進(jìn)行親水化處理，通入H2 和O2 輝光放電10 s，然后將清洗過的載網(wǎng)浸入多聚L-賴氨酸溶液（1 mg/mL）中4 h 后放入去離子水中清洗。將制備好的紅細(xì)胞膜樣品沉降在載網(wǎng)上30 min，然后加入蛋白A 包被的膠體金顆粒（3 μL）以作為后續(xù)數(shù)據(jù)處理的對(duì)齊標(biāo)記。準(zhǔn)備好的載網(wǎng)在濕度為100%、溫度為8 ℃的冷凍制樣儀腔室中吸干表面多余水分，然后投入液態(tài)乙烷中形成無定形冰。將制備好的載網(wǎng)儲(chǔ)存在液氮中直至使用。

1.5 冷凍透射電子顯微鏡進(jìn)行樣品檢查及數(shù)據(jù)收集

利用冷凍傳輸架將冷凍好的低溫樣品送入電鏡中。通過Seria EM 軟件在Low dose 功能下檢查樣品，將樣品臺(tái)通過角度對(duì)稱的旋轉(zhuǎn)方式以3°的間隔從–60°到+60°的傾斜度獲取目標(biāo)區(qū)域的Cryo-ET 傾斜序列，顯微鏡在200 kV 下運(yùn)行，目標(biāo)欠焦值為–4 μm ～ –6 μm。通過K2直接電子探測(cè)器收集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)圖像像素大小為0.2668 nm（放大倍數(shù)為19000×）。整個(gè)傾斜序列的總累積電子劑量約為140 e^–/?²。

1.6 電子斷層掃描圖的三維重構(gòu)

在冷凍電鏡成像過程中，樣品會(huì)受到輻射和其它環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致圖像出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)模糊。因此對(duì)于收集的傾斜序列，首先通過運(yùn)動(dòng)校正軟件MotionCorr 2對(duì)每個(gè)傾斜序列的每個(gè)角度的電子投影圖進(jìn)行漂移校正，再通過軟件IMOD中的加權(quán)反投影算法對(duì)傾斜序列進(jìn)行對(duì)齊和三維重建，而后通過同步迭代重建技術(shù)進(jìn)行斷層圖的重建，迭代次數(shù)為5或15次[33-34]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同超聲功率對(duì)人紅細(xì)胞膜形態(tài)的影響

完整的實(shí)驗(yàn)流程如圖1。紅細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)（如雙凹形狀和細(xì)胞內(nèi)部的內(nèi)容物）可能在超聲作用下產(chǎn)生復(fù)雜的響應(yīng)，從而影響細(xì)胞膜單獨(dú)的響應(yīng)行為。先提取出細(xì)胞膜可以排除紅細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的干擾，確保觀察到的是超聲波直接作用于膜結(jié)構(gòu)的效果，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更聚焦于細(xì)胞膜的物理和結(jié)構(gòu)變化。因此，首先通過低滲溶血和離心制備純凈的人紅細(xì)胞膜，進(jìn)行超聲處理后沉降在電鏡載網(wǎng)上，利用Vitrobot冷凍制樣儀將樣品快速冷凍，然后將樣品轉(zhuǎn)移到冷凍透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察及數(shù)據(jù)收集。

首先觀察未經(jīng)過超聲處理的對(duì)照組，通過對(duì)樣品的低倍成像，可見樣品冰層厚度適中，透光性良好（圖2A）。人紅細(xì)胞膜邊界清晰，結(jié)構(gòu)完整，尺寸約為8～10 μm（圖2B）。對(duì)細(xì)胞膜區(qū)域進(jìn)行高倍數(shù)的數(shù)據(jù)采集，三維重構(gòu)后的細(xì)胞膜光滑且連續(xù)，膜蛋白致密（圖2C）。這些膜蛋白通常包括各種重要的功能蛋白如離子通道等，在維持細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在Cryo-ET 圖像中難以清晰地觀察到磷脂雙分子層，這可能是由于紅細(xì)胞膜平鋪在載網(wǎng)上，電子垂直穿過磷脂雙分子層，其吸收程度很低（圖2D）。這些結(jié)果與預(yù)期一致，表明未經(jīng)超聲處理的人紅細(xì)胞膜保持了其原始結(jié)構(gòu)和功能。

接下來，在40W和60W功率下對(duì)紅細(xì)胞膜進(jìn)行超聲處理，每次處理時(shí)間為5 min。通過Cryo-ET 觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過40W功率超聲處理后的紅細(xì)胞膜形態(tài)變化不大，膜結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，膜表面僅出現(xiàn)少量的波狀變形（圖3A）。這種波狀變形可能是由于超聲波引起的輕微機(jī)械應(yīng)力所致，但尚不足以破壞膜的整體結(jié)構(gòu)。以60W功率超聲處理后，紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)開始顯示出更明顯的變化，雖然大部分膜仍然保持完整，但在某些區(qū)域可以觀察到較大的變形和孔洞（圖3B）。這些孔洞的形成可能是由于超聲波引起的空化效應(yīng)，導(dǎo)致膜局部結(jié)構(gòu)的破壞。盡管如此，總體而言， 60W功率下超聲處理后的紅細(xì)胞膜仍然保持了大部分的結(jié)構(gòu)完整性。當(dāng)超聲功率提高到80W時(shí)，紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞明顯加劇，膜表面出現(xiàn)了不規(guī)則的破裂和較大的孔洞，膜結(jié)構(gòu)的整體完整性受到了嚴(yán)重破壞，并出現(xiàn)了光滑的脂質(zhì)體（圖3C）。這是由于超聲波產(chǎn)生強(qiáng)大空化效應(yīng)和機(jī)械應(yīng)力，這些力直接作用于膜的磷脂雙分子層和膜蛋白，導(dǎo)致其分離和破裂。在100W功率下，紅細(xì)胞膜完全破裂，形成大量的膜碎片及脂質(zhì)體，膜的連續(xù)性完全消失（圖3D）。這種完全破裂的現(xiàn)象表明， 100W功率下的超聲波產(chǎn)生的機(jī)械力和空化效應(yīng)已經(jīng)超過了膜結(jié)構(gòu)的承受能力，導(dǎo)致其徹底解體。

2.2 超聲持續(xù)時(shí)間對(duì)人紅細(xì)胞膜的影響

進(jìn)一步探討了超聲時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞膜形態(tài)的影響。固定超聲功率為100W，分別考察了超聲1 min、5 min 和間斷超聲處理對(duì)紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響。

在超聲處理1 min 后， Cryo-ET 圖像顯示紅細(xì)胞膜的形態(tài)變化較小，盡管膜表面出現(xiàn)了一些微小的孔洞和波狀變形，但整體結(jié)構(gòu)仍保持相對(duì)完整（圖4A）。這些微小孔洞可能是超聲波產(chǎn)生的局部剪切力形成的。這種現(xiàn)象表明，在短時(shí)間的超聲處理時(shí)，紅細(xì)胞膜具有一定的機(jī)械穩(wěn)定性和修復(fù)能力，能夠抵抗超聲波的輕微損傷。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)至5 min，紅細(xì)胞膜的破壞程度顯著增加。在Cryo-ET 圖像中可以觀察到細(xì)胞膜出現(xiàn)大面積的破裂和脫落，膜的連續(xù)性被嚴(yán)重破壞（圖4B）。為探究更好的保護(hù)紅細(xì)胞膜的方式，考察了采取超聲1 min、停止1 min 共進(jìn)行5 min 的間斷超聲處理方式的影響。間斷超聲處理下，雖然膜表面出現(xiàn)了一些孔洞和破裂現(xiàn)象，但膜的整體結(jié)構(gòu)較連續(xù)超聲處理下保持更為完整（圖4C）。這可能是由于間斷處理方式給細(xì)胞膜留出了緩沖時(shí)間，使得膜在受到機(jī)械應(yīng)力后能夠部分恢復(fù)，從而減少了持續(xù)超聲對(duì)膜結(jié)構(gòu)的累積破壞。此外，發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞膜的邊緣處，膜卷曲時(shí)可以看到邊界清晰的磷脂雙分子層，這可能是因?yàn)楫?dāng)電子橫向穿過磷脂雙分子層時(shí)，其疏水尾部對(duì)電子的吸收率更高（圖4D）。

2.3 超聲導(dǎo)致人紅細(xì)胞膜骨架的脫落

在對(duì)照組中， Cryo-ET 圖像顯示細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架關(guān)系緊密。在Z 軸截面圖中可以清楚地看到細(xì)胞膜磷脂層與骨架層相隔約12 nm（圖5A）。經(jīng)過超聲處理后，尤其是在高功率和長(zhǎng)時(shí)間處理?xiàng)l件下，細(xì)胞膜骨架明顯脫落。隨著超聲功率和時(shí)間的增加，膜骨架蛋白從膜上解離，形成散落的蛋白質(zhì)顆粒。這些散落的骨架蛋白顆粒呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的絲狀結(jié)構(gòu)（圖5B）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)這些散落的細(xì)絲狀骨架蛋白質(zhì)顆粒的尺寸，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度分布在200～260 nm 間，寬度約2～5 nm（圖5C 和5D）。這表明細(xì)胞骨架雖然脫落，但其尺寸大小得到了較好的保持，未發(fā)生明顯的斷裂或變性。這可能是由于細(xì)胞骨架通過連接蛋白與細(xì)胞膜磷脂雙分子層相互作用，在機(jī)械應(yīng)力作用下，細(xì)胞骨架與連接蛋白在細(xì)胞膜上的分布狀態(tài)發(fā)生改變，超聲處理作用于細(xì)胞膜與膜骨架連接處的蛋白，破壞了細(xì)胞骨架與膜的連接，從而導(dǎo)致其脫落[35-37]。

2.4 細(xì)胞膜形成表面覆蓋膜蛋白的脂質(zhì)體

經(jīng)高強(qiáng)度的連續(xù)超聲處理（100W， 5 min）后，觀察到細(xì)胞膜形成的脂質(zhì)體表面存在膜蛋白（圖6A）。這些膜蛋白顆粒在脂質(zhì)體表面分布較為均勻，形成了一層覆蓋膜，呈現(xiàn)出不同于原始細(xì)胞膜的分布模式（圖6B）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)這些膜蛋白顆粒的直徑，發(fā)現(xiàn)其尺寸與未超聲處理的細(xì)胞膜蛋白顆粒相似，長(zhǎng)度集中在8 nm 左右，寬度主要分布在5～7 nm（圖6C 和6D），這表明超聲處理過程中膜蛋白較好地保持了其整體結(jié)構(gòu)。然而，這些蛋白顆粒顯示出明顯的突出結(jié)構(gòu)，表明它們從脂質(zhì)雙層中伸出很遠(yuǎn)。這可能是由于在超聲過程中，膜蛋白與細(xì)胞膜的連接受到了破壞，導(dǎo)致膜蛋白從磷脂雙分子層中脫落。超聲的剪切力和空化效應(yīng)會(huì)在細(xì)胞膜上產(chǎn)生局部高壓和微小氣泡，這些氣泡的形成與破裂會(huì)進(jìn)一步擾動(dòng)膜結(jié)構(gòu)，從而促使膜蛋白分離。超聲處理后，當(dāng)脂質(zhì)體重新形成時(shí)，脫落的膜蛋白因其疏水區(qū)域的親脂性傾向，自發(fā)地嵌入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層，并重新附著在脂質(zhì)體表面。這種自發(fā)附著可能受到疏水相互作用和靜電吸引的驅(qū)動(dòng)，使得膜蛋白在脂質(zhì)體表面均勻分布，形成類似于原始細(xì)胞膜的覆蓋層[27，38-39]。在圖3C 中出現(xiàn)的光滑的脂質(zhì)體也驗(yàn)證了這一推測(cè)。這種重新附著現(xiàn)象表明，超聲波處理不僅影響細(xì)胞膜的磷脂雙層結(jié)構(gòu)，還可能改變膜蛋白的分布和功能。

3 結(jié)論

超聲波對(duì)紅細(xì)胞膜的影響主要源于其產(chǎn)生的機(jī)械力和空化效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，功率較低或處理時(shí)間較短時(shí)，這些效應(yīng)較為溫和，僅會(huì)導(dǎo)致膜的輕微變形和局部孔洞的形成。隨著超聲功率的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波的空化效應(yīng)和剪切力顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞。而間斷超聲處理可以有效減少細(xì)胞膜的損傷，使膜結(jié)構(gòu)保存更加完整。這一規(guī)律在藥物遞送、細(xì)胞工程及超聲治療等領(lǐng)域具有重要意義。在藥物遞送方面，通過優(yōu)化超聲處理的方式，可以在保持細(xì)胞活性的同時(shí)增加膜的通透性，為藥物分子的有效遞送提供新的途徑。在細(xì)胞工程方面，通過精確控制超聲處理?xiàng)l件，可以研究細(xì)胞膜的機(jī)械性質(zhì)和其對(duì)外界應(yīng)力的響應(yīng)機(jī)制。超聲處理引起的人紅細(xì)胞骨架脫離現(xiàn)象凸顯了進(jìn)一步探究超聲對(duì)細(xì)胞穩(wěn)定性影響的必要性。膜蛋白在脂質(zhì)體上重新附著的現(xiàn)象不僅為設(shè)計(jì)更有效的藥物遞送系統(tǒng)提供了更多的可能性，也為膜蛋白功能的研究提供了新的手段。例如，通過調(diào)整超聲處理?xiàng)l件，可以研究膜蛋白的重新分布規(guī)律及其對(duì)細(xì)胞功能的影響。在超聲治療領(lǐng)域，通過超聲波處理模擬細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下的膜損傷，可以研究膜損傷對(duì)細(xì)胞功能的影響和細(xì)胞膜的修復(fù)機(jī)制。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將深入研究超聲對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的長(zhǎng)期影響，并開發(fā)更加靈活的超聲調(diào)控技術(shù)，以進(jìn)一步提升其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的安全性和有效性。